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      綿羊IL-6啟動子的克隆及pIL6-TLR4載體構(gòu)建

      2017-03-10 01:46:42宗炎闞童童潘求真王靜宜連正興
      關(guān)鍵詞:綿羊轉(zhuǎn)基因菌落

      宗炎,闞童童,潘求真,王靜宜,連正興

      (1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué),大慶 163319;2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院)

      綿羊IL-6啟動子的克隆及pIL6-TLR4載體構(gòu)建

      宗炎1,闞童童2,潘求真1,王靜宜1,連正興2

      (1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué),大慶 163319;2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院)

      為生產(chǎn)抗病轉(zhuǎn)基因綿羊,并確保轉(zhuǎn)基因羊的安全性??寺【d羊IL-6啟動子序列,以IL-6為啟動子構(gòu)建TLR4過表達載體,轉(zhuǎn)染綿羊成纖維細胞驗證功能。用1 μg·L-1的LPS刺激轉(zhuǎn)染后的綿羊成纖維細胞,利用qPCR技術(shù)和ELISA方法檢測受LPS刺激后的成纖維細胞TLR4 mRNA表達量和TLR4蛋白表達量。結(jié)果表明,轉(zhuǎn)染后的TLR4 mRNA表達量在2、4、24、48 h顯著高于對照組(P<0.05),其中2、4、24 h極顯著高于對照組(P<0.01),TLR4蛋白表達量始終高于對照組。說明pIL6-TLR4過表達載體構(gòu)建成功。

      TLR4;IL-6啟動子;轉(zhuǎn)基因;綿羊

      革蘭氏陰性菌是經(jīng)革蘭氏染色后呈紅色的一類細菌,其病原能力通常與其細胞壁的主要成分脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)有關(guān)[1]。在動物體中,LPS可以刺激并激發(fā)強烈的免疫炎癥反應(yīng)[2],另外由于脂多糖在革蘭氏陰性菌死亡后被釋放出[3],許多種類的抗生素都不能非常有效地抑制此類細菌的繁殖和釋放LPS。很多革蘭氏陰性菌如:沙門氏菌和布魯氏菌等,在羊群中大面積地引發(fā)消化系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)及血液等傳染病,某些人畜共患的疾病甚至大面積的感染人群,如布魯氏菌病的爆發(fā),對養(yǎng)羊業(yè)造成了巨大的危害。

      LPS可以與TLR4的信號受體結(jié)合,通過激活TLR4信號通路,介導(dǎo)生物體先天性免疫應(yīng)答與獲得性免疫應(yīng)答[4],引發(fā)炎癥反應(yīng)與氧化應(yīng)激從而達到清除病原菌的目的[5]。白細胞介素-6(IL-6)既是一種促進炎癥反應(yīng)的因子可以在炎癥反應(yīng)早期就及時上調(diào)表達[6],同時又是一種抗炎因子可以在炎癥反應(yīng)達到一定程度時適當(dāng)抑制[7]。基于TLR4在機體免疫中的功能與IL-6啟動子在炎癥反應(yīng)中的正反向調(diào)控作用以及動物轉(zhuǎn)基因在動物疾病模型建立中的用途,可以將三者有效地結(jié)合在一起進行進一步的功能探討,同時也會彌補國內(nèi)外在相關(guān)研究中的空白。

      1 材料與方法

      1.1 綿羊IL-6啟動子區(qū)域的克隆與測序

      根據(jù)IL-6啟動子重要啟動元件所在位置,使用primer 5.0對綿羊IL-6基因啟動子區(qū)域設(shè)計PCR擴增特異性引物(TLR4 F:5'-TAC CCC CTC TAA AAC TCT G-3',TLR4 R:5'-GGA TTT CCT TCA CTT ACT TG-3'),將PCR產(chǎn)物進行測序,結(jié)果與GenBank提供的綿羊IL-6基因啟動子序列相似性為100%,可以通過膠回收后進行后續(xù)試驗將PCR回收片段與pMD19-T載體進行連接(pMD19-T Vector 1 μL,Insert DNA 1 μL,ddH2O 3 μL,Solution I 5 μL,Total 10 μL,16℃連接過夜),將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌,通過藍白斑篩選進行初步鑒定后,挑取白斑劃線并進行菌落PCR鑒定,挑選部分菌落PCR鑒定陽性的菌線搖菌并提取質(zhì)粒。使用XbaI和PstI雙酶切進行鑒定,隨機挑選5個酶切正確的質(zhì)粒進行測序。

      1.2 pIL6-TLR4載體的構(gòu)建

      根據(jù)目的載體酶切位點的選擇以及IL-6啟動子重要啟動元件的位置,用Primer 5.0設(shè)計一對含有酶切位點及保護堿基的引物擴增IL-6啟動子適宜(IL-6酶切F:CGA TTA ATA CCC CCT CTA AAA CTC TGT GCA,IL-6酶切R:CTA GCT AGC GGT CTC AGA CAT CCC CGG TCT),其中CG和CTA為保護堿基,上游加入AseI酶切位點ATTAAT,下游加入NheI酶切位點GCTAGC。

      對已有的3S載體和PCR擴增片段分別用AseI和NheI進行雙酶切,雙酶切后,需切膠回收載體長度:7 340 bp,PCR片段長度350 bp(其中IL-6啟動子長度為345 bp),然后將二者進行連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌,隨機挑取較大菌斑劃線并進行菌落PCR鑒定,挑選部分菌落PCR鑒定陽性的菌線搖菌并提取質(zhì)粒。隨機挑選5個酶切鑒定正確的質(zhì)粒進行測序,并進行新3S-pIL6-TLR4載體圖譜的繪制。

      1.3 綿羊IL-6啟動子驅(qū)動效率評價

      接種綿羊成纖維細胞到6孔板中,待細胞生長良好達到70%時進行轉(zhuǎn)染[8]。轉(zhuǎn)染24 h狀態(tài)穩(wěn)定并開始表達外源基因時,每孔加入1 μg·L-1LPS進行刺激,并在0、0.5、2、4、8、12、24、48 h時對細胞進行收集,用于做mRNA表達檢測和蛋白表達檢測。

      2 實驗結(jié)果

      2.1 IL-6啟動子區(qū)域的克隆與測序

      結(jié)果顯示,引物設(shè)計非常理想,可以在較大的溫度范圍內(nèi)特異地擴增出單一目的條帶,且PCR產(chǎn)物測序結(jié)果無雜峰,與挑選的5個成功連接T載體的單克隆質(zhì)粒測序結(jié)果都相同,均與Genbank所提供的序列相一致,表明IL-6啟動子克隆成功。

      圖1 綿羊全基因組IL-6啟動子區(qū)域的克隆Fig.1The clone of IL-6 gene promoter region from the whole sheep genome

      2.2 pIL6-TLR4載體的構(gòu)建

      選取菌落PCR為陽性的菌落搖菌提取質(zhì)粒后進行雙酶切鑒定,全部成功連接。結(jié)果表明引物引入的保護堿基與酶切位點十分理想。隨機選取的5個成功連接的3S載體的單克隆質(zhì)粒進行測序,結(jié)果與Genbank所提供的序列完全一致,這表明重組3S-pIL6-TLR4載體構(gòu)建成功。

      圖23 S-pIL6-TLR4載體的構(gòu)建Fig.2The construction of 3S-pIL6-TLR4 vector

      2.3 IL-6啟動子驅(qū)動效率評價

      從qPCR結(jié)果可以看出,IL-6啟動子組在4 h時TLR4 mRNA表達量達到高峰,表現(xiàn)出了IL-6啟動子調(diào)節(jié)的特異性。且在2、4、24、48 h時,轉(zhuǎn)基因組的TLR4 mRNA顯著高于對照組。ELISA結(jié)果表明,TLR4蛋白的表達與mRNA的表達基本趨于一致,且出現(xiàn)了表達累積的現(xiàn)象。通過對質(zhì)粒的瞬時轉(zhuǎn)染后TLR4表達的檢測,證明3S-pIL6-TLR4載體的IL-6啟動子可以有效外驅(qū)動外源TLR4基因的表達。

      3 討論

      實現(xiàn)基因的選擇性、特異性表達不在于是哪種基因,而在于這種基因是被哪種啟動子所啟動。因此,要想使某個目的基因能夠特異性的表達就需要運用相應(yīng)特異性的啟動子來啟動該基因的轉(zhuǎn)錄[9]。IL-6既充分發(fā)揮了促炎因子的作用同時還具有一定的抗炎因子的作用[10-11],IL-6基因的表達受相應(yīng)的調(diào)控基因的控制,其啟動子在這個過程中起到了十分重要的作用[12-13]。并且IL-6在組織中的表達比較廣泛,又具有一定程度的組織特異性,在淋巴細胞、單核細胞、成纖維細胞、血管內(nèi)皮細胞、腫瘤細胞以及肌細胞中表達[14]。因此我們選擇了IL-6基因啟動子來提高轉(zhuǎn)基因綿羊抗病能力。

      由轉(zhuǎn)染細胞TLR4 mRNA的相對定量及TLR4蛋白ELISA結(jié)果分析得出pIL6-TLR4轉(zhuǎn)基因綿羊在4 h時TLR4 mRNA與蛋白的表達量均迅速上升,并達到峰值,極顯著地高于對照組綿羊(P<0.01)。而對照組綿羊在4 h時還在緩慢上升,8 h時才迅速上升并達到峰值。在24 h后,pIL6-TLR4轉(zhuǎn)基因綿羊TLR4的表達量再次高于對照組綿羊。轉(zhuǎn)然后的TLR4 mRNA表達量在2、4、24、48 h顯著高于對照組,其中2、4、24 h極顯著高于對照組,TLR4蛋白表達量始終高于對照組??梢钥闯觯琓LR4蛋白與mRNA的表達趨勢基本一致,只是在表達時間點密集檢測時相比mRNA的表達出現(xiàn)了逐漸累積的現(xiàn)象。

      參考文獻:

      [1]Ozinsky A,Underhill D M.The repertoire for pattern recognition of pathogens by the innate immune system is defined by cooperation between Toll-like receptors[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,2000,97(25):13766-13771.

      [2]Vasselon T,Detmers P A.Toll receptors:A central element in innate immune responses[J].Immunity,2002,70(3):1033-1041.

      [3]Zgurskaya HI1,Lo¨pez CA2,Gnanakaran S2.permeability barrier of gram-negative cell envelopes and approaches to bypass it,2015,1(11):512-522.

      [4]Kieran A R,Michael F S,Jr M K,et al.Reactive oxygen and nitrogen species differentially regulate Toll-like receptor 4-mediated activation of NF-kappa B and interleukin-8 expression[J].Infect Immunol,2004,72(4):2123-2130.

      [5]Ishida I,Kubo H,Suzuki S,et al.Hypoxia diminishes tolllike receptor 4 expression through reactive oxygen species generated by mitochondria in endothelial cells[J].J Immunol,2002,169(4):2069-2075.

      [6]Roded Sharan.Analysis of biological networks:transcriptional networks-promoter sequence analysis[J].Tel Aviv University,2007(4):11.

      [7]孫乃恩,孫東旭,朱德胞.分子遺傳學(xué)[M].南京:南京大學(xué)出版社,1999.

      Cloning of Sheep IL-6 promoter and the Construction of the pIL6-TLR4 Vector

      Zong Yan1,Kan Tongtong2,Pan Qiuzhen1,Wang Jingyi1,Lian Zhengxing2
      (1.Heilongjiang Bayi Agricultural University,Daqing 163319;
      2.College of Animal Science and Technology,China Agricultural University)

      To produce disease resistance transgenic sheep and to ensure its security,the sheep IL-6 promoter sequences were cloned. The TLR4 over-expression vector was constructed by using sheep IL-6 as a promoter,and transfected into sheep fibroblasts successfully.The transfected sheep fibroblasts was stimulated with 1 μg·L-1of LPS,and the technology of qPCR was used to detect the mRNA and protein expression.The results showed that,the mRNA expressions of TLR4 in transfected sheep fibroblasts after 2,4,24,48 h were significantly higher than that in the control group(P<0.05),in which after 2,4,24 h were extremely significantly higher(P<0.01),meanwhile the TLR4 protein expression was always higher than that in the control group.It was proved that the pIL6-TLR4 over-expression vector was constructed successfully.

      TLR4;IL-6 promoter;transgene;sheep

      Q78

      A

      1002-2090(2017)01-0045-04

      2016-03-10

      國家重大轉(zhuǎn)基因?qū)m棧?014ZX08008-005)。

      宗炎(1990-),男,黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院2013級碩士研究生。

      潘求真,男,副教授,碩士研究生導(dǎo)師,E-mail:panqiuzhen@163.com。

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