波動性高糖對血管平滑肌細(xì)胞增殖及凋亡蛋白表達(dá)的影響

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(1.山東壽光市人民醫(yī)院， 山東 濰坊 262700； 2.山東大學(xué)齊魯醫(yī)院， 山東 泰安 271041)

波動性高糖對血管平滑肌細(xì)胞增殖及凋亡蛋白表達(dá)的影響

張?zhí)鹛?，丁穎超1，蘇 寧1，任建民2

(1.山東壽光市人民醫(yī)院， 山東 濰坊 262700； 2.山東大學(xué)齊魯醫(yī)院， 山東 泰安 271041)

目的分析血管平滑肌細(xì)胞增殖和凋亡蛋白表達(dá)受到波動性高糖影響的過程。方法利用持續(xù)高糖及波動性高糖的方式促使大鼠胸主動脈平滑肌持續(xù)孵育二十四小時，重點(diǎn)采用MTT方法檢測血管平滑肌細(xì)胞的增殖活性，同時還需要關(guān)注流式細(xì)胞術(shù)對檢測細(xì)胞周期過程中發(fā)生的具體改變，利用Western bloting手段檢測胞漿中Bcl-2與Bax蛋白的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)波動性高濃度葡萄糖培養(yǎng)相比于持續(xù)高濃度葡萄糖的培養(yǎng)方式更有助于提升血管平滑肌細(xì)胞的增殖活性，并且有效的實現(xiàn)周期轉(zhuǎn)變，促使G0/G1期及時向S期進(jìn)行轉(zhuǎn)變，在上調(diào)Bcl-2/Bax比值的過程中，更好的呈現(xiàn)出提高活性效果。結(jié)論 波動性高葡萄糖能夠通過干預(yù)細(xì)胞周期的方式，對凋亡蛋白加以調(diào)控，從而更好的促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞出現(xiàn)不斷增殖的現(xiàn)象，并且逐漸誘導(dǎo)其進(jìn)入凋亡狀態(tài)，相較于持續(xù)性高葡萄糖，可以更加明顯的促進(jìn)糖尿病動脈粥樣硬化的發(fā)展延伸。

波動性高糖；細(xì)胞增殖；凋亡蛋白表達(dá)；血管平滑肌細(xì)胞

糖尿病患者會發(fā)生慢性血管并發(fā)癥主要是跟持續(xù)高糖有關(guān)，同時也和血糖波動聯(lián)系密切[1]。動脈粥樣硬化屬于DM患者發(fā)生大血管病變中的重要病理基礎(chǔ)，內(nèi)皮細(xì)胞與血管平滑肌細(xì)胞等成分都是在As發(fā)生過程中體現(xiàn)出重要價值。此次研究主要是以大鼠胸主動脈平滑肌細(xì)胞株A7r5為對象，目的是探索波動性高糖對VSMC的增殖及凋亡，以及可能產(chǎn)生的作用與相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

大鼠胸主動脈平滑肌細(xì)胞株A7r5細(xì)胞；Epics-XLⅡ型流式細(xì)胞儀(BeckmanCoulter公司)；高糖DMEM培養(yǎng)基、低糖DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(GIBCO公司)；鼠單抗Bclxl抗體(eBioscience公司)；兔抗人 β-actin多克隆抗體(Santa Cruz公司)；鼠單抗Bcl-2抗體、鼠單抗Bax抗體(杭州四季青生物工程公司產(chǎn)品)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和實驗分組

把細(xì)胞培養(yǎng)在四十八小時之內(nèi)更換含無血清的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)二十四小時，讓細(xì)胞可以同步于G0/G1期，然后分3組：①正常對照組：5.5 mmol/L葡萄糖組；②持續(xù)高糖組：25 mmol/L葡萄糖組；③波動性高糖組：白天5.5 mmol/L葡萄糖和25 mmol/L葡萄糖每3 h高糖2 h低糖交替3次，高糖過夜。培養(yǎng)24 h。

1.3 MTT法檢測細(xì)胞增殖活性

流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期分布；Western bloting法檢測細(xì)胞Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 血管平滑肌細(xì)胞的具體增殖情況

波動性高糖組VSMC A490值相比于正常的對照組，會發(fā)現(xiàn)持續(xù)高糖組都顯著升高(均P＜0.01)；持續(xù)高糖組A490值相比于正常對照組也呈現(xiàn)出明顯增加的趨勢(P＜0.01) (表1略)。

2.2 細(xì)胞生長周期比較

不同濃度的葡萄糖在經(jīng)過二十四小時作用VSMC之后，波動性高糖組及持續(xù)高糖組S期細(xì)胞百分比相比于正常對照組要呈現(xiàn)出明顯的增高趨勢(P分別＜0.01，0.05)，波動性高糖組相比于持續(xù)高糖組呈現(xiàn)出增高(P＜0.05)趨勢；波動性高糖組G0/G1期細(xì)胞百分比相比于持續(xù)高糖組和正常對照組呈現(xiàn)出降低的趨勢(P分別＜0.01，0.005)，而持續(xù)高糖組G0/G1期細(xì)胞百分比和正常的對照組進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)差異無統(tǒng)計學(xué)意義。各個組間G2期細(xì)胞百分比相比體現(xiàn)不出統(tǒng)計學(xué)意義(表2略)。

2.3 不同葡萄糖濃度的影響

和正常對照組進(jìn)行對比，發(fā)現(xiàn)波動性高糖組和持續(xù)高糖組Bcl-2和Bax蛋白的表達(dá)都呈現(xiàn)出增強(qiáng)(均P＜0.01)的趨勢，波動性高糖組Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)也明顯高于持續(xù)高糖組(P分別＜0.05，0.01)；波動性高糖組和持續(xù)高糖組Bcl-2/Bax之間的比值明顯高于正常對照組(均P＜0.01)，波動性高糖組Bcl-2/Bax比值相比于持續(xù)高糖組呈現(xiàn)出顯著增高(均P＜0.01；表3和圖1)的趨勢。

3 討論

糖尿病就是慢性高血糖為特征的代謝紊亂綜合征，如果大血管發(fā)生病變會引起心腦血管疾病的發(fā)生，甚至是致死致殘。高血糖與心腦血管疾病聯(lián)系密切，糖化血紅蛋白在逐漸升高1%的時候，1型和2型糖尿病患者的心腦血管疾病呈現(xiàn)出的危險性也會逐漸增加15%和18%，顯示出的高血糖狀態(tài)就是糖尿病患者發(fā)生心腦血管疾病的成因。

此次研究證實，持續(xù)體外高糖培養(yǎng)能夠刺激VSMC細(xì)胞的增殖，從而改變細(xì)胞在不CN 43-1262/R中國動脈硬化雜志2011年第19卷第11期899同周期的百分比，和以往研究的結(jié)果相符。

此研究在VSMC上證實，波動性高葡萄糖會通過細(xì)胞周期轉(zhuǎn)化、調(diào)控凋亡蛋白的表達(dá)增加細(xì)胞增殖，避免出現(xiàn)凋亡情況，這對細(xì)胞功能損傷較之持續(xù)性高糖更加嚴(yán)重。為此，控制好具體的血糖水平，能夠減少血糖波動對控制糖尿病大血管并發(fā)癥的延續(xù)，以此對提升患者的生存質(zhì)量具有重要意義。

[1] 鄧珊珊，劉 紅，榮 曦，等.波動性高糖對INS-1細(xì)胞凋亡及凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響[J].山東醫(yī)藥，2012，(15)：12-14.

[2] 馮朝彩，趙占勝，李 丹，等.波動性高糖對血管平滑肌細(xì)胞增殖及凋亡蛋白表達(dá)的影響[J].中國動脈硬化雜志，2011，(11)：897-900.

[3] 湯智敏，雷閩湘.波動性高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡與JNK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[J].中南大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版)，2010，(06)：616-621.

本文編輯：賀 攀

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ISSN.2095-8242.2017.12.2196.01