周曉昕，張玉靜，肖芳，鐘才高

中南大學(xué)湘雅公共衛(wèi)生學(xué)院，長沙 410000

在生態(tài)系統(tǒng)中，鉻存在多種價態(tài)，其中Cr(Ⅵ)具有生物氧化毒性，在自然界中主要以鉻酸鹽或重鉻酸鹽的形式存在，毒性最強[1]。肝臟是人體內(nèi)最大的實質(zhì)性器官，物質(zhì)代謝是其主要功能。外源化學(xué)物經(jīng)胃腸道吸收，由門靜脈系統(tǒng)進入肝臟，經(jīng)肝臟代謝后進入體循環(huán)，此過程稱為首過消除；同時肝臟內(nèi)血管網(wǎng)密布，外源化學(xué)物無論以何種方式進入人體，都可以通過血液循環(huán)進入肝臟。因此肝臟既是重要的解毒器官，也是主要的靶器官。線粒體是幾乎所有哺乳動物細胞漿中都存在的一種半自主細胞器，通過三羧酸循環(huán)和氧化磷酸化作用產(chǎn)生ATP為細胞提供能量，同時參與多種物質(zhì)的代謝與合成，還與細胞凋亡、固有免疫和維持細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)有關(guān)[2]。線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(mitochondrial permeability transition pore, MPTP)是由位于線粒體內(nèi)膜和外膜上多個分子組成的蛋白復(fù)合體，主要通過調(diào)節(jié)氧化磷酸化過程來控制細胞能量代謝，以及通過改變線粒體膜通透性引起細胞死亡[3]。電壓依賴性陰離子通道(voltage-dependent anion channel, VDAC)，是真核細胞線粒體外膜上的孔道蛋白，是線粒體外膜物質(zhì)轉(zhuǎn)運的通道，也是調(diào)控細胞生存與死亡途徑的重要節(jié)點[4-5]。VDAC1是VDAC的3種亞型之一，可與細胞內(nèi)多種蛋白(如BCL-2家族蛋白)相互作用，影響線粒體外膜通透性，釋放線粒體膜間隙中的凋亡相關(guān)因子進入胞漿，從而引起細胞凋亡[6]。本研究以肝細胞作為研究對象，初步揭示了VDAC1在Cr(Ⅵ)誘導(dǎo)的線粒體依賴性細胞凋亡中的作用，為進一步的機制探討提供了實驗數(shù)據(jù)；同時也為防治Cr(Ⅵ)引起的職業(yè)損害，促進人群健康提供理論依據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 細胞、儀器和試劑

L02細胞(中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院實驗中心)；293T細胞(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院)；DH5α感受態(tài)細胞(北京鼎國昌盛生物公司)；9700 型 PCR 擴增儀(美國 ABI 公司)； Q5000 型微量紫外分光光度計(美國 Quawell 公司)；Power Wave XS2 微孔板分光光度計(美國 BioTek 公司)；流式細胞儀(美國 BD 公司)；Mini-ProteanTetra 小型垂直電泳槽及PowerPac HC 型高電流電泳儀(美國 Bio-Rad 公司)；重鉻酸鉀(美國Sigma-Aldrich公司)；Hyclone RPMI Medium Modified 培養(yǎng)基、Hyclone DMEM/HIGH GLUCOSE培養(yǎng)基(北京賽默飛世爾生物公司)；胎牛血清(杭州四季青生物有限公司)；青-鏈霉素(北京LEAGENE公司)；0.25%胰蛋白酶、Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit細胞凋亡檢測試劑盒(美國Genview公司)；嘌呤霉素(美國Invitrogen公司)；二甲基亞砜(美國 Sigma-Aldrich 公司)；Ampicillin sodium salt (BIOSHARP公司)；無內(nèi)毒素質(zhì)粒小提試劑盒(北京康為世紀(jì)公司)；細胞核蛋白與細胞漿蛋白抽提試劑盒、RIPA裂解液、活性氧(ROS)檢測試劑盒(上海Beyotime生物技術(shù)公司)；BCA蛋白定量檢測試劑盒(北京鼎國昌盛生物公司)；Cell Counting Kit細胞增殖與毒性檢測試劑盒(七海生物公司)；細胞總RNA提取試劑(美國Invitrogen公司)；PrimeScriptTMRT Reagent kit、SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ(日本Takara公司)；活體細胞線粒體膜通道孔(MPTP)熒光檢測試劑盒(美國GENMED公司)。

1.2 方法

1.2.1 VDAC1穩(wěn)定低表達細胞系的建立

構(gòu)建能夠穩(wěn)定敲低VDAC1基因的shRNA慢病毒載體，在293T細胞中轉(zhuǎn)染shRNA慢病毒包裝體系，并感染L02細胞獲得VDAC1低表達的L02細胞系，同時轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒作為陰性對照(NC)。為避免脫靶效應(yīng)影響實驗結(jié)果，設(shè)計2種引物進行細胞轉(zhuǎn)染，VDAC1低表達shRNA載體引物設(shè)計如表1。

1.2.2 L02細胞與VDAC1穩(wěn)定低表達L02細胞系的培養(yǎng)

L02細胞使用含有10%胎牛血清和1%青-鏈霉素的RPMI Medium Modified 培養(yǎng)基；VDAC1穩(wěn)定低表達的L02細胞系及NC細胞使用含有15%胎牛血清、1%青-鏈霉素和0.5%嘌呤霉素的RPMI Medium Modified 培養(yǎng)基。所有細胞在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2～3 d傳代一次，取生長狀態(tài)良好的對數(shù)期細胞用胰酶消化后按適當(dāng)?shù)拿芏冉臃N至新培養(yǎng)皿中，并設(shè)置分組，以便用于后續(xù)實驗。

1.2.3 預(yù)實驗

取處于對數(shù)期生長狀態(tài)良好的L02細胞、shVDAC1-1、shVDAC1-2及NC細胞，通過胰酶消化后用培養(yǎng)基重懸制成單個細胞懸液，使用細胞計數(shù)板計數(shù)并調(diào)整細胞濃度至1×105cells·mL-1，將細胞接種于96孔板中，每孔100 μL；培養(yǎng)24 h后每孔加入11 μL Cr(Ⅵ)染毒液，使其染毒終濃度分別為2 μmol·L-1、4 μmol·L-1、8 μmol·L-1、16 μmol·L-1、25 μmol·L-1、40 μmol·L-1、50 μmol·L-1、100 μmol·L-1、200 μmol·L-1，空白對照使用等體積的PBS，每組設(shè)3個復(fù)孔；染毒24 h后，每孔加入10 μL的CCK8溶液，繼續(xù)在37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)40 min，使用酶標(biāo)儀測定450 nm處的吸光值。

1.2.4 細胞的分組與處理

將處于對數(shù)生長期狀態(tài)良好的L02細胞、shVDAC1-1、shVDAC-2及NC細胞用胰酶消化，按適當(dāng)濃度接種至新的培養(yǎng)皿，待細胞生長密度達到70%左右時，根據(jù)預(yù)實驗的結(jié)果對細胞進行染毒處理，染毒時間為24 h。

1.2.5 流式細胞儀檢測細胞凋亡

原理：在正常細胞中，磷脂酰絲氨酸(PS)只分布在細胞膜脂質(zhì)雙分子層內(nèi)側(cè)，而在細胞凋亡早期，細胞膜中的PS由內(nèi)側(cè)翻向外側(cè)。Annexin V與PS具有高度親和力，故可通過細胞膜外側(cè)暴露的PS與早期凋亡細胞結(jié)合，將Annexin V進行熒光素FITC標(biāo)記，以標(biāo)記了的Annexin V作為熒光探針，利用流式細胞儀檢測細胞凋亡的發(fā)生。碘化丙啶(propidium iodide, PI)是一種核酸染料，它不能通過完整的細胞膜，但對凋亡中晚期的細胞和死細胞，PI能透過細胞膜將細胞核染紅。因此將Annexin V與PI結(jié)合使用可以區(qū)分不同凋亡時期的細胞。

操作步驟：使用胰酶消化1.2.4中處理后的細胞，同時離心收集上清液中的死亡細胞，用PBS洗滌2次后加入300 μL的Binding Buffer懸浮細胞，加入5 μL Annexin V-FITC混勻后，加入5 μL PI混勻，室溫避光反應(yīng)5～10 min，1 h內(nèi)進行流式細胞儀分析。

1.2.6 ROS活性檢測

原理：DCFH-DA本身無熒光，可自由穿過細胞膜，進入細胞后可被細胞內(nèi)的酯酶水解為不能通過細胞膜的DCFH。細胞內(nèi)的活性氧可將無熒光的DCFH氧化為有熒光的DCF，檢測熒光強度即可判斷細胞內(nèi)活性氧的含量。

操作步驟：將受試細胞按適當(dāng)密度接種至6孔板，按1.2.4中步驟分組處理，24 h后除去細胞培養(yǎng)液，PBS清洗3～4次，用無血清培養(yǎng)基按1∶1 200稀釋DCFH-DA，每孔加入300 μL，37 ℃細胞培養(yǎng)箱孵育20 min，每隔3～5 min混勻一次，無血清培養(yǎng)基清洗細胞3次，收集細胞，通過流式細胞儀檢測ROS活性。

1.2.7 MPTP孔開放度測定

原理：鈣黃綠素-AM極易進入細胞及線粒體，當(dāng)它進入細胞后被酯酶切離，形成熒光性強的鈣黃綠素，鈣黃綠素進入線粒體后即被線粒體俘獲，而未進入線粒體的鈣黃綠素被胞漿中的淬滅劑鈷離子淬滅，失去熒光。當(dāng)MPTP孔開放，線粒體中的鈣黃綠素進入胞漿，被鈷離子淬滅。因此檢測細胞熒光強度的變化可判斷MPTP孔道的開放情況。

表1 VDAC1的引物Table 1 Primers for VDAC1

操作步驟：將受試細胞按適當(dāng)密度接種至96孔板，按1.2.4中步驟進行處理，每種細胞每個處理組設(shè)3個復(fù)孔；24 h后小心吸盡培養(yǎng)液，沿孔壁在每一個孔中緩緩加入100 μL、37 ℃預(yù)熱的清理液，覆蓋細胞，再小心抽去清理液；沿孔壁在每孔中加入100 μL預(yù)先配好的含有染色液和中和液的染色工作液，覆蓋細胞表面，置于37 ℃細胞培養(yǎng)箱中孵育20 min，避免光照；小心抽去染色工作液，沿孔壁加入100 μL清理液，清洗2次后再加入100 μL清理液到培養(yǎng)孔中，使用熒光分光光度計進行定量檢測。

1.2.8 蛋白免疫印跡法檢測相關(guān)蛋白的表達情況

將受試細胞按1.2.4處理后收集細胞，使用RIPA裂解液和胞漿蛋白抽提試劑分別提取總蛋白和胞漿蛋白，通過蛋白免疫印跡法獲得VDAC1、細胞色素C和AIF的表達水平，以β-肌動蛋白(β-actin)作為內(nèi)參，獲得上述蛋白在不同細胞及不同處理組中的變化情況。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果(Results)

2.1 L02-VDAC1低表達細胞系的鑒定

用Western blot法檢驗細胞系，如圖1所示，轉(zhuǎn)染細胞shVDAC1-1和shVDAC1-2中VDAC1的表達較L02明顯減少；而NC細胞 VDAC1的表達與L02相比無明顯差異。

圖1 Western blot法檢測4種細胞內(nèi)VDAC1的表達Fig. 1 The Western blot bands of VDAC1 expression in 4 types of cells

2.2 VDAC1低表達對Cr(Ⅵ)處理的細胞生存率的影響

不同濃度Cr(Ⅵ)對4種細胞生存率的影響見圖2，實驗結(jié)果表明隨著Cr(Ⅵ)染毒濃度的增加，4種細胞的生存率均有下降(P<0.05)，并呈現(xiàn)明顯的劑量-反應(yīng)關(guān)系；但VDAC1低表達組較L02和NC細胞下降趨勢較為平緩；根據(jù)CCK-8實驗結(jié)果，確保Cr(Ⅵ)處理后細胞生存率在一個比較適合的范圍(>70%)，故選擇8 μmol·L-1為后續(xù)試驗的處理濃度；且在染毒濃度為8 μmol·L-1時，L02與NC細胞的生存率與非染毒組相比均下降(P<0.05)，而VDAC1低表達細胞的生存率與非染毒組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

2.3 VDAC1對Cr(Ⅵ)誘導(dǎo)的細胞凋亡的影響

流式細胞儀檢測細胞的凋亡率，如圖3和圖4所示，Q4為正常細胞，Q3為早期凋亡細胞，Q2為晚期凋亡細胞，Q1為壞死細胞，本實驗主要研究晚期凋亡。VDAC1未敲低的L02細胞與NC細胞經(jīng)Cr(Ⅵ)染毒處理后凋亡率升高(P<0.05)，而VDAC1低表達組細胞染毒組與非染毒組的凋亡率無明顯差異。

圖2 不同濃度的Cr(Ⅵ)對受試細胞生存率的影響Fig. 2 Different doses of Cr(Ⅵ) exposure on hepatocytes viability

細胞類型Celltype對照組Controlgroup8μmol·L-1Cr(Ⅵ)處理組8μmol·L-1Cr(Ⅵ)groupL0210.79±0.04*NC10.80±0.08*shVDAC1-110.88±0.12shVDAC1-210.84±0.10

注：與同類型細胞對照組比較，*P<0.05。

Note: P<0.05 compared to the control group.

圖3 Cr(Ⅵ)暴露對不同細胞凋亡率的影響Fig. 3 The effect of VDAC1 on Cr(Ⅵ) exposure-induced apoptosis in 4 types of cell

圖4 Cr(Ⅵ)暴露對不同細胞凋亡率的影響注：與同類型細胞對照組相比* P<0.05。Fig. 4 The effect of VDAC1 on Cr(Ⅵ) exposure-induced apoptosis in 4 types of cellNotes: * P<0.05 compared with the control group.

2.4 VDAC1對Cr(Ⅵ)誘導(dǎo)的細胞內(nèi)ROS的影響

本實驗使用DCFH-DA探針通過流式細胞儀檢測細胞內(nèi)ROS的生成，如圖5所示，經(jīng)Cr(Ⅵ)染毒處理后，L02細胞與NC細胞內(nèi)ROS含量明顯增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；而VDAC1低表達組2種細胞ROS的生成量增加不明顯，與非染毒組相比無統(tǒng)計學(xué)差異。

2.5 VDAC1對Cr(Ⅵ)誘導(dǎo)的線粒體功能的影響

2.5.1 VDAC1對Cr(Ⅵ)誘導(dǎo)的L02肝細胞MPTP活性的影響

使用鈣黃素-AM熒光探針檢測MPTP孔活性，經(jīng)Cr(Ⅵ)處理后測得熒光強度減弱，說明MPTP孔活性增強。計算非染毒組與染毒組熒光強度的比值，得出相對熒光強度，相對熒光強度值大，說明染毒后細胞熒光強度減弱程度大，提示MPTP活性增強。比較4種細胞經(jīng)Cr(Ⅵ)染毒后MPTP開放程度，如圖6所示，經(jīng)Cr(Ⅵ)染毒后，測得L02細胞和NC細胞的相對熒光強度高于VDAC1低表達組細胞，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，說明L02細胞與NC細胞染毒后熒光強度明顯減弱，細胞內(nèi)MPTP活性增強；而VDAC1低表達組的相對熒光強度約為1，表明染毒后VDAC1低表達組細胞的MPTP活性無明顯變化。

圖5 VDAC1對Cr(Ⅵ)引發(fā)產(chǎn)生細胞ROS的影響注：與同類型細胞對照組相比* P<0.05。Fig. 5 The effect of VDAC1 on Cr(Ⅵ) induced ROS accumulation in hepatocytesNote: * P<0.05 compared with the control group.

2.5.2 VDAC1對Cr(Ⅵ)誘導(dǎo)的肝細胞內(nèi)細胞色素C表達的影響

用Western blot法檢測4種細胞胞漿內(nèi)細胞色素C的表達情況，Image J進行灰度值分析。結(jié)果如圖7和表3所示。與非染毒組相比，L02細胞與NC細胞經(jīng)8 μmol·L-1Cr(Ⅵ)染毒后胞漿內(nèi)細胞素色C的含量顯著上升，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；VDAC1低表達的2組細胞，經(jīng)Cr(Ⅵ)處理后胞漿內(nèi)細胞素色C的含量變化不明顯。

圖6 VDAC1對Cr(Ⅵ)誘導(dǎo)的肝細胞MPTP活性的影響注：與同類型細胞對照組相比* P<0.05。Fig. 6 The effect of VDAC1 on Cr(Ⅵ)-induced MPTP activity change in hepatocytesNote: *P<0.05 compared with the L02 group.

圖7 VDAC1對Cr(Ⅵ)誘導(dǎo)的肝細胞胞漿中Cyt C表達的影響的蛋白免疫印跡圖Fig. 7 The Western blot bands of the effect of VDAC1 on Cr(Ⅵ)-induced Cyt C expression in cytoplasm

圖8 VDAC1對Cr(Ⅵ)誘導(dǎo)的肝細胞胞漿中AIF表達的影響Fig. 8 The effect of VDAC1 on Cr(Ⅵ)-induced AIF expression in cytoplasm

2.6 VDAC1對Cr(Ⅵ)染毒引起的AIF變化的影響

Western blot法檢測胞漿內(nèi)AIF的含量，結(jié)果如圖8所示，經(jīng)Cr(Ⅵ)染毒后，L02細胞與NC細胞胞漿內(nèi)AIF含量明顯升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(見表4)(P<0.05)；VDAC1低表達組的細胞經(jīng)Cr(Ⅵ)處理后胞漿內(nèi)AIF的變化并不明顯。

3 討論(Discussion)

鉻是一種具有多種價態(tài)的重金屬，其中以六價鉻的形式最為常見。Cr(Ⅵ)在工業(yè)上的應(yīng)用極為廣泛，涉及不銹鋼制造、制革、電鍍、焊接和木材加工等多個領(lǐng)域[7-8]。Cr(Ⅵ)暴露會使人體產(chǎn)生急慢性中毒，引起支氣管炎癥，造成肝腎損傷，胃腸道潰瘍，同時Cr(Ⅵ)也具有遺傳毒性及致癌性[9]。Bagchi等[10]認(rèn)為Cr(Ⅵ)可使得細胞內(nèi)ROS生成量和脂質(zhì)過氧化增加，導(dǎo)致DNA碎片化以及細胞凋亡。本實驗室前期研究結(jié)果表明，Cr(Ⅵ)可以影響L02細胞的生存率，引起細胞凋亡，并證實Cr(Ⅵ)引起的細胞毒性和凋亡與線粒體功能損傷有關(guān)[11]。MPTP是位于線粒體內(nèi)膜上可以改變線粒體通透性的孔道[12]，早在1990年Crompton和Costi[13]就發(fā)現(xiàn)線粒體通透性改變是細胞死亡的關(guān)鍵調(diào)控因素，隨后的一些研究結(jié)果表明，ROS可以使線粒體通透性增加[14]。Le-Quoc K和Le-Quoc D[15]發(fā)現(xiàn)，要引起線粒體通透性變化需要線粒體外膜與內(nèi)膜同時改變，而線粒體內(nèi)膜外膜上有一些特定區(qū)域可作為它們相互作用的接觸位點，VDAC就是位于線粒體外膜上的連接內(nèi)膜與細胞質(zhì)的位點[16]。VDAC1是VDAC 的3種亞型之一，它可調(diào)控線粒體外膜通透性，同時控制線粒體膜內(nèi)外的物質(zhì)運輸[17]。本研究以L02細胞建立VDAC1低表達細胞系，通過將L02細胞、NC細胞與VDAC1低表達細胞作為研究對象，以預(yù)實驗結(jié)果選定染毒濃度，建立鉻肝細胞毒性損傷模型。結(jié)果顯示，隨著Cr(Ⅵ)染毒濃度的增加，4種細胞的生存率均存在不同程度的下降，且兩者存在劑量-反應(yīng)關(guān)系，但VDAC1低表達的2組細胞下降趨勢較平緩；選定8 μmol·L-1為后續(xù)染毒劑量，在此劑量組中，L02與NC細胞的生存率與非染毒組相比均有下降且具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)，但VDAC1低表達組的生存率與非染毒組相比無明顯差異；同時細胞凋亡情況的結(jié)果與生存率相符，Cr(Ⅵ)染毒組L02與NC細胞的凋亡率與非染毒組相比明顯上升(P<0.05)，而VDAC1低表達細胞染毒組與非染毒組的凋亡情況無明顯差異。此外，本課題組前期實驗數(shù)據(jù)顯示Cr(Ⅵ)染毒24 h后，L02細胞內(nèi)ROS的含量顯著上升[18]，與上文中L02與NC組的實驗數(shù)據(jù)一致，但VDAC1低表達組染毒前后細胞內(nèi)ROS生成量未見明顯上升。因此，以上實驗結(jié)果提示Cr(Ⅵ)染毒條件下，VDAC1敲低確實可以降低細胞內(nèi)ROS生成量從而減少細胞凋亡，提高細胞生存率。

表3 VDAC1對Cr(Ⅵ)誘導(dǎo)的肝細胞胞漿中Cyt C表達的影響Table 3 The effect of VDAC1 on Cr(Ⅵ)-induced Cyt C expression in cytoplasm

注：與同類型細胞對照組比較，*P<0.05。

Note:*P<0.05 compared to the control group.

表4 VDAC1對Cr(Ⅵ)誘導(dǎo)的肝細胞胞漿中AIF表達的影響Table 4 The effect of VDAC1 on Cr(Ⅵ)-induced AIF expression in cytoplasm

注：與同類型細胞對照組比較，*P<0.05。

Note:*P<0.05 compared to the control group.

為進一步闡明VDAC1影響Cr(Ⅵ)誘導(dǎo)的肝細胞凋亡的原因，本研究檢測了Cr(Ⅵ)處理后4種細胞線粒體功能及凋亡相關(guān)蛋白的變化情況。與非染毒組相比，L02和NC細胞染毒后MPTP活性增強(P<0.05)，同時胞漿內(nèi)細胞色素C的含量明顯增加(P<0.05)，表明在Cr(Ⅵ)的作用下，線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔的開放性增加，線粒體內(nèi)的細胞色素C進入胞漿中，提示上述2種細胞發(fā)生了線粒體功能障礙；而VDAC1低表達組細胞的MPTP活性與胞漿內(nèi)細胞色素C含量均無明顯增加。同時L02細胞與NC細胞在染毒后，胞漿內(nèi)AIF含量增加，與非染毒組相比有明顯差異(P<0.05)，VDAC1低表達組的2種細胞胞漿內(nèi)AIF的含量無明顯差異，說明VDAC1敲低可以拮抗由Cr(Ⅵ)誘導(dǎo)的肝細胞凋亡。

綜上所述，Cr(Ⅵ)可使肝細胞中ROS生成量增加，造成線粒體功能障礙，線粒體外膜通透性增加，使得線粒體內(nèi)的凋亡相關(guān)蛋白漏出，進入胞漿，引起細胞凋亡；而降低VDAC1的表達可抑制由Cr(Ⅵ)誘導(dǎo)的肝細胞凋亡。本研究可為Cr(Ⅵ)影響肝細胞線粒體依賴性凋亡的分子機制研究提供部分證據(jù)，從而為搞清楚鉻暴露所致肝細胞毒性與肝損傷的預(yù)防和控制提供思路。但本研究還需在分子機制與信號通路方向進行進一步研究，并在后期通過動物實驗驗證。

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