劉祥，王敏，陳求穩(wěn),*，陳凱，胡柳明

1. 南京水利科學(xué)研究院生態(tài)環(huán)境研究中心，南京 210029 2. 河海大學(xué)環(huán)境學(xué)院，南京 210098

隨著城鎮(zhèn)化和工業(yè)化的快速發(fā)展，大量地表徑流及工業(yè)廢水排入水體，各種污染物負(fù)荷逐年增加。近年來，因重金屬而引發(fā)的突發(fā)污染事件和生態(tài)問題相繼出現(xiàn)，中國七大水系中如長江、淮河等也遭受了不同程度的重金屬污染[1-2]，導(dǎo)致魚類突發(fā)性死亡，周邊居民癌癥頻發(fā)等。雖然排入水體的重金屬離子大部分可以通過物理、化學(xué)和生物的途徑轉(zhuǎn)移至沉積物中，但在水力因子改變的條件下，容易釋放到水中引起二次污染[3]。水生生物長期暴露于污染水體中，因易富集溶解在水中的重金屬離子而受到毒害作用，甚至基因受到損傷而導(dǎo)致遺傳特性被改變[4-6]。同時(shí)，重金屬可通過食物鏈的生物放大作用逐級(jí)傳遞，對水生態(tài)系統(tǒng)健康產(chǎn)生巨大沖擊，最終嚴(yán)重威脅到人類的健康。因此，水體中低濃度重金屬的慢性生物毒性及其復(fù)合污染交互作用機(jī)制已逐漸成為淡水生態(tài)學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。

日本沼蝦(Macrobranchium nipponense)，又名河蝦，廣泛分布于我國江河、湖泊和水庫中，是一種具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的甲殼類水生動(dòng)物，在水生態(tài)食物鏈中占據(jù)重要地位，不僅可以攝食水中有機(jī)碎屑降低污染，而可以作為更高營養(yǎng)級(jí)生物的餌料[7]，還也可以被人直接食用。鎘(Cd)和鉛(Pb)在我國江河湖泊中屬于典型重金屬污染物，檢出濃度較高，同時(shí)也是國際公認(rèn)的有毒有害重金屬，早在1976年就被美國環(huán)境保護(hù)局(EPA)列為優(yōu)先控制污染物。Cd主要會(huì)對生物體呼吸道產(chǎn)生刺激，并可積存于肝或腎臟造成毒素富集；Pb主要對生物體神經(jīng)系統(tǒng)的毒性效應(yīng)突出，并且容易積存在血液或骨骼中產(chǎn)生毒害作用[6-8]。傳統(tǒng)化學(xué)監(jiān)測只能對Cd和Pb精確定量，而并不能準(zhǔn)確反映其對生物的毒性效應(yīng)。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，生物監(jiān)測技術(shù)逐漸受到研究者的青睞并作為環(huán)境監(jiān)測領(lǐng)域內(nèi)的一門新興技術(shù)逐漸被推廣應(yīng)用，其工作原理是通過監(jiān)測生物體在受到污染脅迫時(shí)，在群落、種群和生物個(gè)體以及細(xì)胞、分子等水平上發(fā)生的異常變化信號(hào)來表征污染狀況及毒害效應(yīng)[9-10]。與傳統(tǒng)監(jiān)測相比而言，它具有連續(xù)性、科學(xué)性、綜合性等優(yōu)點(diǎn)。

對水生生物來說，無論是必需還是非必需重金屬，當(dāng)其濃度在生物體中蓄積超出一定閾值后都會(huì)產(chǎn)生大量的活性氧自由基(ROS)而引起機(jī)體氧化損傷[9-10]。為維持機(jī)體內(nèi)自由基產(chǎn)生和氧化還原作用之間的動(dòng)態(tài)平衡，生物體自身可以建立抗氧化防御系統(tǒng)來保護(hù)機(jī)體組織和細(xì)胞免受自由基的氧化損傷[9,11]。重金屬的致毒效應(yīng)就是通過激活或抑制抗氧化防御過程中的酶或非酶物質(zhì)，干擾機(jī)體正常的生理代謝[12-13]。原先相關(guān)研究多側(cè)重于沉積物中重金屬的形態(tài)分布、遷移轉(zhuǎn)化規(guī)律及生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)[1-3]，忽略了水體中低濃度重金屬及不同重金屬聯(lián)合對水生生物的慢性毒性的研究。因此，本研究基于環(huán)境水平設(shè)置不同濃度梯度開展河蝦在Cd和Pb單一及聯(lián)合暴露下的慢性毒性實(shí)驗(yàn)，以期探明水體溶解性金屬離子的致毒效應(yīng)及交互作用機(jī)制，同時(shí)，耦合多種生物標(biāo)志物綜合評價(jià)不同處理組的生物毒性大小，為水體重金屬生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)預(yù)警、水質(zhì)基準(zhǔn)制定及流域水環(huán)境管理提供依據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本文重點(diǎn)研究水體Cd和Pb單獨(dú)及聯(lián)合存在時(shí)對河蝦的慢性生物毒性。在試驗(yàn)過程中，分別采用C4H6CdO4·2H2O和Pb(NO3)2(分析純，國藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司)配成母液并根據(jù)已設(shè)定的濃度梯度按照稀釋法投加到試驗(yàn)水體中。暴露試驗(yàn)桶的材質(zhì)為聚氯乙烯，最大容積為40 L。

實(shí)驗(yàn)用河蝦取自南京某河蝦養(yǎng)殖區(qū)，實(shí)驗(yàn)前暫養(yǎng)3 d適應(yīng)新環(huán)境。為避免因河蝦個(gè)體大小差異對實(shí)驗(yàn)結(jié)果引入較大誤差，用于暴露實(shí)驗(yàn)的河蝦平均體長為(6.43±0.21) cm，體重為(2.62±0.15) g。實(shí)驗(yàn)用水選用在太陽下暴曬10 d除氯后的自來水，以消除天然水體中殘存的微量重金屬對實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生干擾。此外，為了在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)模擬現(xiàn)實(shí)水環(huán)境，在每個(gè)暴露裝置中培養(yǎng)伊樂藻(Elodea nuttallii)，為河蝦提供附著場所且作為青飼料(見圖1)。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

本實(shí)驗(yàn)共包括10個(gè)暴露組，分別為對照組、Cd單獨(dú)處理組、Pb單獨(dú)處理組以及Cd與Pb聯(lián)合處理組，其中含有重金屬污染的處理組均分低(L)、中(M)、高(H)3個(gè)濃度梯度。本研究采用的Cd和Pb的污染濃度梯度為0.01、0.1、1 mg·L-1，2種重金屬聯(lián)合暴露采用的濃度梯度組合為(0.01+0.01)、(0.1+0.1)、(1+1) mg·L-1。每個(gè)實(shí)驗(yàn)桶中分別盛裝25 L水，根據(jù)濃度梯度設(shè)定值，按照稀釋的方法將配好的母液投加到實(shí)驗(yàn)桶中并用玻璃棒攪勻水體。然后將實(shí)驗(yàn)用河蝦隨機(jī)分為10組，每組24只投加到每個(gè)實(shí)驗(yàn)桶中，并添加一定量的伊樂藻?？刂扑疁夭怀^10 ℃并用空氣泵進(jìn)行水體增氧，保證水中溶解氧的濃度不低于4 mg·L-1。每隔1天喂少量麥麩保證河蝦基本的能量需求。分別在暴露3 d和10 d后，平行取河蝦生物樣品3只，解剖取出肝胰腺與肌肉組織，迅速在-80 ℃下冰凍保存用于后續(xù)分子生物標(biāo)志物檢測分析。

1.3 檢測分析

選用超氧化物歧化酶(SOD, U·mg-1Protein)、過氧化氫酶(CAT, U·mg-1Protein)、金屬硫蛋白(MT, ng·mg-1Protein)和脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛(MDA, nmol·mg-1Protein)作為代表性分子生物標(biāo)志物，生物樣品分別為河蝦肝胰腺和肌肉組織，分別測定4種標(biāo)志物，具體測定操作和計(jì)算按南京建成生物工程研究所的試劑盒說明書進(jìn)行。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用IBM SPSS Statistics 22進(jìn)行組間差異顯著性的多重比較檢驗(yàn)(LSD)和2×2析因設(shè)計(jì)方差分析。析因分析中的交互作用即為聯(lián)合作用中的協(xié)同或拮抗作用，若無交互作用，則聯(lián)合作用為相加作用。生物標(biāo)志物數(shù)據(jù)均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(Mean±SD)表示，所有結(jié)果都采用Shapiro-Wilk和Levene方法進(jìn)行常態(tài)和同方差性檢驗(yàn)，采用單因素方差分析(ANOVA)進(jìn)行組間統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，處理組與對照組以及處理組之間采用Dunnett T3檢驗(yàn)法進(jìn)行差異顯著性水平的分析，其中P<0.05被認(rèn)為具有顯著性，并以不同字母標(biāo)注。

綜合生物標(biāo)志物指數(shù)(IBR)計(jì)算參照文獻(xiàn)[14]中所描述的方法，具體計(jì)算公式如下所示。最后把不同處理組的IBR值繪制成可視化的星狀圖，根據(jù)IBR值越大，生物所受的影響越大的原理可以直觀地看出Cd和Pb單獨(dú)及聯(lián)合暴露在不同濃度梯度下對河蝦產(chǎn)生的生物毒性大小。

圖1 河蝦在不同重金屬處理組下的暴露示意圖Fig. 1 Schematic diagram of river shrimp exposed to different heavy metals with different concentrations

2 結(jié)果與分析(Results and analysis)

2.1 Cd和Pb單獨(dú)及聯(lián)合暴露下SOD和CAT的響應(yīng)

暴露試驗(yàn)結(jié)果表明：水體中Cd濃度達(dá)到1 mg·L-1時(shí)，將會(huì)對河蝦產(chǎn)生致死毒性(36 h后全部死亡)；當(dāng)Cd與Pb高濃度聯(lián)合作用時(shí)，致死毒性增強(qiáng)(24 h后全部死亡)，表現(xiàn)為協(xié)同作用，因而在這2個(gè)處理組中沒有采集到活體生物樣品用于標(biāo)志物的分析。同一生物體不同組織器官對金屬污染物的響應(yīng)也存在顯著差異(P<0.05)，Cd和Pb單獨(dú)及聯(lián)合暴露下河蝦肝胰腺和肌肉組織內(nèi)SOD活性隨濃度和時(shí)間的變化如圖2(A)所示。從圖中可以看出，肝胰腺中SOD活性顯著高于肌肉(P<0.05)，相比于對照組，肝胰腺與肌肉中SOD活性均受到重金屬不同程度的抑制作用。暴露3 d時(shí)，肝胰腺中SOD活性均隨劑量增加而降低，其中Cd單獨(dú)暴露對肝胰腺SOD活性的抑制效應(yīng)較為顯著(P<0.05)，在Cd (M)-3 d時(shí)SOD值為(67.03±5.44) U·mg-1Protein，抑制率為65.61%，10 d后，肝胰腺SOD活性均有所提高，但仍低于對照組，Pb高濃度單獨(dú)暴露3 d的抑制率為54.08%，而10 d的抑制率為29.11%，中等濃度聯(lián)合暴露3 d的抑制率為66.57%，而10 d的抑制率為44.13%。然而，對于肌肉中SOD活性均隨著劑量和時(shí)間的增大而減小，在處理組Pb (M)-10 d處達(dá)到最低值，為(3.61±0.47) U·mg-1Protein，抑制率為70.02%。

圖2 Cd和Pb單一及聯(lián)合暴露下河蝦肝胰腺(左)和肌肉(右)的SOD活性(A)和CAT活性(B)的響應(yīng)注：不同字母表示相互之間存在顯著性差異(P<0.05)。Fig. 2 The changes of SOD activity (A) and CAT activity (B) in hepatopancreas (left) and muscle (right) of shrimp exposed to control, Cd and Pb (single or in combination)Note: Bars not sharing common letters were significantly different from each other (P<0.05).

Cd和Pb單獨(dú)及聯(lián)合暴露下河蝦肝胰腺和肌肉組織內(nèi)CAT活性隨濃度和時(shí)間的變化如圖2(B)所示。從圖中可以看出，重金屬污染對河蝦體內(nèi)的CAT活性具有誘導(dǎo)效應(yīng)。Cd單獨(dú)暴露時(shí)，肝胰腺CAT活性隨濃度增加而增加，但無顯著時(shí)間效應(yīng)(P<0.05)，在Cd (M)暴露3 d與10 d的CAT值分別為(0.46±0.07) U·mg-1Protein和(0.44±0.04) U·mg-1Protein；Pb單獨(dú)暴露時(shí)，無論3 d還是10 d，肝胰腺CAT活性在低中高3個(gè)暴露梯度下均呈現(xiàn)先增后降趨勢且中濃度下無時(shí)間效應(yīng)；聯(lián)合暴露時(shí)，CAT活性整體高于對照組水平(P<0.05)，但無顯著劑量和時(shí)間效應(yīng)(P<0.05)。暴露3 d時(shí)，肌肉中CAT活性均受到誘導(dǎo)并表現(xiàn)出微弱的劑量效應(yīng)，在Pb (H)-3 d下達(dá)到最大值，為(0.48±0.04) U·mg-1Protein；但暴露10 d后，CAT活性均有所降低，尤其在Cd單獨(dú)暴露下表現(xiàn)顯著(P<0.05)，然而相比對照組而言，總體上還是呈誘導(dǎo)趨勢。

2.2 Cd和Pb單獨(dú)及聯(lián)合暴露下MT和MDA的響應(yīng)

Cd和Pb單獨(dú)及聯(lián)合暴露下河蝦肝胰腺和肌肉組織內(nèi)MT含量隨濃度和時(shí)間的變化如圖3(A)所示。從圖中可以看出，肝胰腺中MT含量隨不同重金屬濃度變化呈現(xiàn)不同的抑制或誘導(dǎo)效應(yīng)，相比于肌肉組織，其敏感性更高。Cd單獨(dú)暴露3 d時(shí)，肝胰腺M(fèi)T含量顯著高于對照組(P<0.05)，且隨濃度增加而增加，而在低濃度下暴露10 d時(shí)，MT含量顯著降低(P<0.05)；Pb單獨(dú)暴露3 d時(shí)，肝胰腺M(fèi)T含量顯著高于對照組(P<0.05)，且在中等濃度下達(dá)到最大值，暴露10 d后，MT含量在高濃度下被繼續(xù)誘導(dǎo)，達(dá)到全組最大值(0.60±0.06) ng·mg-1Protein，而在中等濃度下被顯著抑制；聯(lián)合暴露時(shí)，MT含量表現(xiàn)出劑量和時(shí)間效應(yīng)。然而，對于肌肉中MT含量變化，整體無顯著變化，僅在聯(lián)合暴露下呈現(xiàn)出顯著的時(shí)間和劑量效應(yīng)(P<0.05)，在高濃度下聯(lián)合暴露10 d后，達(dá)到全組最大值(0.31±0.03) ng·mg-1Protein。

Cd和Pb單獨(dú)及聯(lián)合暴露下河蝦肝胰腺和肌肉組織內(nèi)MDA含量隨濃度和時(shí)間的變化如圖3(B)所示。從圖中可以看出，水體重金屬污染對河蝦肝胰腺的氧化損傷要顯著高于尾部肌肉，MDA含量存在數(shù)量級(jí)差異。Cd單獨(dú)暴露3 d時(shí)，肝胰腺中MDA含量顯著高于對照組(P<0.05)，且呈現(xiàn)顯著劑量效應(yīng)，10 d后，低濃度組MDA含量顯著降低(P<0.05)，而高濃度組MDA含量顯著升高，達(dá)到(16.50±1.02) mmol·mg-1Protein；Pb單獨(dú)暴露時(shí)，MDA含量變化與MT含量變化呈現(xiàn)相同的規(guī)律，在Pb (H)-10 d處引起的脂質(zhì)過氧化損傷最大(P<0.05)，MDA含量達(dá)到(20.01±1.27) mmol·mg-1Protein；聯(lián)合暴露時(shí)，MDA含量變化無顯著時(shí)間和劑量效應(yīng)，且整體低于單獨(dú)金屬暴露時(shí)所引起的脂質(zhì)過氧化損傷，但仍然顯著高于對照組(P<0.05)。然而，對于肌肉組織來說，僅在Pb (H)-10 d處MDA含量相對較高，其余變化不大。

2.3 Cd和Pb聯(lián)合效應(yīng)分析

采用2×2析因設(shè)計(jì)方差分析對Cd和Pb不同濃度聯(lián)合對河蝦肝胰腺SOD、CAT、MT和MDA的交互作用進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示2種污染物聯(lián)合作用大多表現(xiàn)出拮抗作用(圖4)。Cd與Pb同時(shí)不添加即為對照組，Cd添加Pb不添加即為Cd單獨(dú)暴露組，Cd不添加Pb添加即為Pb單獨(dú)暴露組，Cd與Pb同時(shí)添加即為聯(lián)合暴露組。在暴露3 d時(shí)，Cd和Pb低濃度聯(lián)合對MDA產(chǎn)生的交互作用最強(qiáng)(圖4A)，Partial Eta2值顯示，各暴露組對MDA變化的貢獻(xiàn)大小順序?yàn)镃d+Pb (L)>Pb (L)>Cd (L)；在暴露10 d時(shí)，低濃度聯(lián)合仍然表現(xiàn)出對MDA的交互作用最強(qiáng)且貢獻(xiàn)大小順序保持不變，但對SOD和MT產(chǎn)生的交互作用均有所減弱，Partial Eta2值顯示，各暴露組對SOD活性變化的貢獻(xiàn)大小順序?yàn)镃d (L)>Pb (L)> Cd+Pb (L)，對MT含量變化的貢獻(xiàn)大小順序?yàn)镻b (L)> Cd (L)> Cd+Pb (L)，尤其Cd與Pb聯(lián)合對MT甚至已表現(xiàn)出相加效應(yīng)。

圖4 Cd/Pb低濃度(A)和中等濃度(B)對河蝦肝胰腺分子標(biāo)志物SOD、CAT、MT和MDA的交互作用注：兩直線夾角越大表明交互作用越強(qiáng)，如兩直線隨污染物劑量的增大而靠近或交叉，則表明2種污染物聯(lián)合作用表現(xiàn)為拮抗作用。Fig. 4 Cd-Pb interaction effect under low concentration (A) and middle concentration (B) on hepatopancreatic biomarkers including SOD, CAT, MT and MDA in shrimpNote: The greater the angle of two straight lines, the stronger the interaction between variables. The variables are antagonism when the two lines next to or cross with each other as the contaminants kept increasing.

Cd和Pb中等濃度聯(lián)合對河蝦肝胰腺SOD、CAT、MT和MDA的交互作用如圖4(B)所示。從圖中可以看出，重金屬聯(lián)合對河蝦肝胰腺中分子標(biāo)志物均產(chǎn)生交互作用。在暴露3 d時(shí)，Cd和Pb中等濃度聯(lián)合對MDA產(chǎn)生的交互作用最強(qiáng)，Partial Eta2值顯示，聯(lián)合暴露對CAT和MDA變化的貢獻(xiàn)大小順序均為Cd+Pb (M)> Pb (M)> Cd (M)，對MT含量變化的貢獻(xiàn)大小順序則為Cd+Pb (M)> Cd (M) > Pb (M)；在暴露10 d時(shí)，聯(lián)合暴露對CAT產(chǎn)生的交互作用最強(qiáng)，Partial Eta2值顯示，Cd和Pb單一及聯(lián)合下對CAT活性變化的貢獻(xiàn)大小順序?yàn)镃d+Pb (M)> Pb (M)> Cd (M)，而對SOD、MT和MDA變化的貢獻(xiàn)大小均為Cd (M)> Cd+Pb (M)> Pb (M)。

2.4 不同金屬及聯(lián)合生物毒性評價(jià)

本實(shí)驗(yàn)中不同暴露時(shí)間、不同重金屬處理下的綜合生物標(biāo)志物指數(shù)分析結(jié)果如圖5。研究發(fā)現(xiàn)：Cd和Pb單獨(dú)暴露對肝胰腺產(chǎn)生的毒性較大，尤其Cd致毒效應(yīng)突出，在Cd (M)下暴露3 d，IBR值高達(dá)3.27，10 d后，IBR值仍保持最大值，為2.66；對于肌肉來說，Pb單獨(dú)暴露產(chǎn)生的致毒效應(yīng)顯著高于其他處理組，尤其在Pb (H)下暴露3 d后，生物毒性最大，IBR值為3.17，10 d后，IBR仍保持最大，為2.00。此外，河蝦暴露于Cd和Pb共存的水體中，隨著暴露時(shí)間的延長，機(jī)體自身表現(xiàn)出一定的解毒機(jī)制，但毒性依然高于對照組。無論是肝胰腺還是肌肉組織，暴露10 d后的IBR值總體均小于3 d時(shí)的IBR值，表明河蝦自身對Cd和Pb具有一定的毒性調(diào)控能力，但并不能完全對抗重金屬所產(chǎn)生的毒性。

3 討論(Discussion)

3.1 重金屬單一及聯(lián)合作用

天然水體中，往往是多種重金屬同時(shí)存在，對于某一生物來說常常存在聯(lián)合交互作用。迄今為止，水環(huán)境生態(tài)毒理學(xué)中所提及的交互作用主要包括協(xié)同作用、相加作用、獨(dú)立作用和拮抗作用[12]。然而，水體中有毒有害重金屬對水生生物的聯(lián)合作用是一個(gè)很復(fù)雜的問題，其聯(lián)合毒性類型不僅與污染物的組成有關(guān)，而且與目標(biāo)生物、暴露濃度及時(shí)間等密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，在一定濃度的重金屬脅迫下，重金屬可與生物體蛋白質(zhì)等高分子物質(zhì)結(jié)合，影響蛋白質(zhì)的分解與合成而擾亂正常新陳代謝[9,20]。

本研究為深入認(rèn)識(shí)水體中典型重金屬Cd與Pb對河蝦的毒性機(jī)制，從金屬單一及聯(lián)合暴露入手，考慮不同濃度梯度和暴露時(shí)間的影響，進(jìn)行室內(nèi)暴露實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：當(dāng)河蝦暴露于含Cd濃度為1 mg·L-1的水體中，河蝦會(huì)在36 h內(nèi)全部死亡，尤其Cd與Pb高濃度聯(lián)合下，毒性增強(qiáng)，這主要是因?yàn)镃d在河蝦體內(nèi)積累達(dá)到一定程度后，細(xì)胞中蓄積的Cd含量超過了生物體中MT對它的螯合速率時(shí)，過剩的Cd就會(huì)與其體內(nèi)的其他生物分子，包括酶和核酸等生物大分子相互作用，進(jìn)而引起中毒致死現(xiàn)象；吳豐昌等[15]在研究中指出，水體中Cd濃度超過15 μg·L-1時(shí)對羅氏沼蝦會(huì)產(chǎn)生急性毒性，這一結(jié)果表明羅氏沼蝦對水中Cd的耐受能力要低于日本沼蝦。研究表明水體中Cd對甲殼動(dòng)物的致死毒性約是Pb的50倍[16]。然而，高濃度聯(lián)合毒性增強(qiáng)的主要原因是Pb可以增加機(jī)體細(xì)胞膜的通透性，導(dǎo)致更多的Cd進(jìn)入細(xì)胞而過剩積累，引起毒性增強(qiáng)[12]。在剩余處理組中，根據(jù)典型分子生物標(biāo)志物響應(yīng)變化(圖2，3)，Cd與Pb的單獨(dú)毒性均高于其聯(lián)合毒性且其聯(lián)合效應(yīng)主要表現(xiàn)為拮抗作用。這一結(jié)果可以用競爭點(diǎn)位理論(competitive site theory)來解釋：金屬離子進(jìn)入細(xì)胞前先要與細(xì)胞表面的接受點(diǎn)位結(jié)合，而當(dāng)Cd與Pb在低或中等濃度下共存時(shí)，Pb并不發(fā)揮增加細(xì)胞膜通透性的作用，而是與Cd一起競爭接受點(diǎn)位，因此而產(chǎn)生拮抗作用。

圖5 不同重金屬暴露下IBR響應(yīng)圖注：A為肝胰腺，B為肌肉組織。Fig. 5 Star plots of IBR from different exposure groups with heavy metals (Cd and Pb) during different periodsNote: A, hepatopancreas sample; B, muscle sample.

3.2 典型分子生物標(biāo)志物響應(yīng)

生物標(biāo)志物是生物機(jī)體受到外源污染物脅迫損害前，在不同分子、細(xì)胞上產(chǎn)生的異?；男盘?hào)指標(biāo)，它們可以對嚴(yán)重毒性傷害提供早期預(yù)警，可以揭示某一生化代謝過程的變化或異常代謝產(chǎn)物的生成[17]。一般認(rèn)為，外源性有毒有害物質(zhì)主要通過影響或阻斷呼吸鏈、電子傳遞鏈、酶促反應(yīng)等體內(nèi)正常生理代謝，導(dǎo)致活性氧自由基增加而使機(jī)體處于氧化應(yīng)激狀態(tài)[18-19]。然而，為消除或減緩因活性氧累積而產(chǎn)生的氧化損傷，生物體內(nèi)的各種酶和非酶抗氧化劑聯(lián)合作用可以構(gòu)成抗氧化防御系統(tǒng)，其中SOD和CAT是生物體耐受污染脅迫的重要抗氧化酶[20]，MT是典型的重金屬特異性分子標(biāo)志物，具有維持生物體內(nèi)金屬含量的動(dòng)態(tài)平衡和重金屬解毒作用的雙重機(jī)制[5]，MDA是反映機(jī)體脂質(zhì)過氧化損傷最具代表性的生物標(biāo)志物，其含量變化可以直接表明生物受損傷大小[5]。因此，以抗氧化生物標(biāo)志物的活性和含量為測試終點(diǎn)不僅可以間接地反映河流水體中重金屬的存在及其潛在的慢性生物毒性，而且可以彌補(bǔ)原先化學(xué)監(jiān)測的缺陷，科學(xué)地進(jìn)行重金屬污染物的早期診斷和水環(huán)境健康評價(jià)。

河蝦屬于典型的甲殼動(dòng)物，自身不具有免疫球蛋白，對機(jī)體的保護(hù)作用主要由血細(xì)胞來承擔(dān)；河蝦肝胰腺中含有離子轉(zhuǎn)移酶、解毒酶以及抗逆酶，是機(jī)體主要的解毒器官。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，肝胰腺中SOD活性和敏感性均高于肌肉，這主要由于其生理功能不同所致。在整個(gè)防御系統(tǒng)中，SOD是最先與活性氧自由基作用的酶，且主要分布在肝胰腺中，它可以快速將超氧陰離子分解成H2O2和O2。已有研究表明[21]，當(dāng)生物機(jī)體受到輕度污染脅迫時(shí)，SOD活性往往被激活，相反可以推斷，當(dāng)SOD活性呈現(xiàn)抑制效應(yīng)則表明機(jī)體對該種脅迫的不適性或已出現(xiàn)中毒反應(yīng)。本研究Cd與Pb單一及聯(lián)合暴露對肝胰腺和肌肉組織中SOD活性均呈現(xiàn)抑制效應(yīng)，表明重金屬對河蝦已造成慢性致毒效應(yīng)，尤其Cd對肝胰腺SOD活性的抑制最為突出。很多學(xué)者認(rèn)為，造成這種結(jié)果的原因可能是：Cd2+離子更易取代Cu/Zn-SOD中的Zn2+或Mn-SOD中的Mn2+，導(dǎo)致SOD結(jié)構(gòu)變化而活性降低；其次，Cd2+可能與酶分子中的-SH基團(tuán)發(fā)生結(jié)合，也是SOD活性減小的一個(gè)重要原因[22]；另外，Cd也能夠與SOD相互作用，致使蛋白質(zhì)改性而改變其活性[23]。然而，由于河蝦肝胰腺自身含有一些解毒酶，在暴露10 d后對Cd和Pb也表現(xiàn)出一定的適應(yīng)性，SOD活性增強(qiáng)，但仍低于對照組。對于肌肉組織，Pb對SOD的活性抑制相對顯著，這可能與不同器官執(zhí)行不同的生理功能有關(guān)，且Pb更容易進(jìn)入血液而傳送到肌肉組織中。CAT是一種末端血紅素氧化酶，在抗氧化防御系統(tǒng)中其主要作用就是催化H2O2分解為H2O和O2，防止H2O2蓄積量過高對機(jī)體組織造成損傷[24]。本研究中CAT活性在重金屬Cd和Pb脅迫下大體呈現(xiàn)出誘導(dǎo)效應(yīng)(圖2B)，主要是因?yàn)镃d和Pb離子進(jìn)入肝胰腺細(xì)胞后，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生大量的活性氧，致使產(chǎn)生氧化壓力，為保護(hù)機(jī)體細(xì)胞，CAT活性被激活，然而，CAT活性在Pb低中高3個(gè)濃度梯度上表現(xiàn)先增后降的拋物線趨勢，主要原因可能是暴露初期，生物機(jī)體自身抗氧化防御系統(tǒng)可以通過自身調(diào)節(jié)對抗這部分因重金屬引起的ROS，而隨著外界Pb濃度的持續(xù)增加，肝胰腺細(xì)胞內(nèi)Pb離子濃度急劇增加，一方面抑制了CAT的生成，另一方面細(xì)胞受損，細(xì)胞內(nèi)的活性氧自由基的平衡破壞，致使CAT活性降低[25]。

MT是一類低分子量、富含半胱氨酸的蛋白質(zhì)，MT上的Cys殘基含有易與重金屬結(jié)合的疏基，可以預(yù)測生物體對重金屬的富集狀況和受重金屬的污染壓力[5]。同時(shí)，由于MT能夠通過自身羥基還原態(tài)/氧化態(tài)的轉(zhuǎn)換來清除活性氧自由基，在一定程度上可以取代SOD來保護(hù)機(jī)體免受氧化損傷[4]。本研究結(jié)果中肝胰腺中MT含量高于肌肉，表明肝胰腺對重金屬的富集能力高于肌肉且間接反映肝胰腺河蝦主要的解毒器官。在暴露3 d后，肝胰腺M(fèi)T含量顯著提高，主要是因?yàn)榧?xì)胞富集了大量了金屬離子，均能與MT結(jié)合。然而，較低濃度下，隨著暴露時(shí)間延長，MT含量不再上升，甚至出現(xiàn)下降趨勢，其原因可能是細(xì)胞膜表面的重金屬受體點(diǎn)位逐漸飽和，或過量金屬離子超過MT的結(jié)合能力，使肝胰腺細(xì)胞器解體而導(dǎo)致粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的片斷化[4-5]。

MDA既是機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的重要產(chǎn)物，同時(shí)又可與蛋白質(zhì)的游離氨基作用，引起蛋白質(zhì)分子內(nèi)與分子間交聯(lián)，導(dǎo)致細(xì)胞損傷[26]。圖3B結(jié)果顯示，河蝦肝胰腺對0.01 mg·L-1的Cd和0.01、0.1 mg·L-1的Pb均具有一定的毒性調(diào)節(jié)功能，然而在0.1 mg·L-1的Cd和1 mg·L-1的Pb下暴露10 d后河蝦肝胰腺均會(huì)受到較大的氧化損傷，細(xì)胞中MDA含量較高(圖3B)，這種結(jié)果與眾多污染脅迫動(dòng)態(tài)研究結(jié)果相類似。產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因可能是，由于重金屬脅迫，河蝦體內(nèi)活性氧自由基水平過高，超出機(jī)體抗氧化防御系統(tǒng)的能力，過剩的活性氧自由基攻擊生物膜磷脂中不飽和脂肪酸雙鍵而導(dǎo)致脂質(zhì)的過氧化反應(yīng)，MDA含量隨之升高。然而，在較低濃度下，暴露10 d后，MDA含量反而有所下降，主要原因可能是抗氧化酶系統(tǒng)酶活性在低濃度下表現(xiàn)出一定耐受性，活性氧自由基的誘導(dǎo)下，其活性增強(qiáng)，從而增強(qiáng)了清除活性氧自由基的能力，降低活性氧自由基的水平，但仍然不能對抗高濃度所引起的氧化損傷。其次，在相同的脅迫時(shí)間下，肝胰腺的脂質(zhì)過氧化程度要高于肌肉，說明即使是同一污染物對生物體產(chǎn)生的脅迫，不同部位脂質(zhì)過氧化水平也不一樣。

3.3 IBR綜合評價(jià)

Cd和Pb是具有潛在危害的水環(huán)境污染物，與其他污染物相比，其風(fēng)險(xiǎn)在于它們不能被微生物降解、易生物富集、食物鏈傳遞放大，且易與生物體內(nèi)的蛋白質(zhì)等生物大分子結(jié)合，造成不可逆轉(zhuǎn)的變性，干擾正常的生理代謝過程，甚至可以引起DNA突變改變遺傳特性[13]。因此，科學(xué)準(zhǔn)確地進(jìn)行重金屬生物毒性評價(jià)是當(dāng)前河流生態(tài)健康評價(jià)與風(fēng)險(xiǎn)評估的基礎(chǔ)工作。傳統(tǒng)重金屬生物毒性評價(jià)大多基于半致死濃度(LC50)，往往提高了毒物的風(fēng)險(xiǎn)濃度，忽略了低濃度重金屬及多種金屬聯(lián)合時(shí)的慢性生物毒性，與現(xiàn)實(shí)河流污染現(xiàn)狀難以接軌。然而，本研究基于環(huán)境水平設(shè)置不同濃度梯度進(jìn)行室內(nèi)暴露實(shí)驗(yàn)，通過測試代表性分子標(biāo)志物揭示重金屬慢性毒性。由于單一生物標(biāo)志物很容易受到其他因素的干擾，且不同生物標(biāo)志物對不同污染物的響應(yīng)程度存在差異，因此，單一生物標(biāo)志物很難準(zhǔn)確對污染物作出全面評價(jià)。本文采用IBR指數(shù)，綜合不同生物標(biāo)志物對不同重金屬處理組的生物毒性評價(jià)，不僅可以避免單一生物標(biāo)志物的不確定性，也可以更準(zhǔn)確更科學(xué)地比較不同濃度梯度重金屬的慢性毒性大小，為水環(huán)境管理及風(fēng)險(xiǎn)基準(zhǔn)制定提供依據(jù)。

綜上所述：(1) 當(dāng)水體中Cd濃度達(dá)到1 mg·L-1時(shí)，河蝦就會(huì)出現(xiàn)毒性致死，且與同濃度的Pb聯(lián)合時(shí)，致死毒性增強(qiáng)，表現(xiàn)為協(xié)同作用；析因方差分析發(fā)現(xiàn)，Cd與Pb分別在0.01和0.1 mg·L-12個(gè)梯度下聯(lián)合時(shí)，無論對肝胰腺還是尾部肌肉，對4種標(biāo)志物均表現(xiàn)為拮抗作用。

(2) 肝胰腺與肌肉組織中SOD活性與MDA含量存在數(shù)量級(jí)差異。Cd和Pb單獨(dú)及聯(lián)合時(shí)，肝胰腺與肌肉中SOD活性均受到抑制，10 d后，肝胰腺中SOD活性少許增強(qiáng)，而肌肉中SOD活性仍被抑制；CAT活性絕大部分被激活，10 d后，肝胰腺中CAT活性繼續(xù)被激活，肌肉中CAT活性反而降低，尤其Cd抑制效應(yīng)顯著；肌肉中MT和MDA含量組間變化較小，在肝胰腺中兩者變化規(guī)律類似；聯(lián)合暴露下，4種標(biāo)志物的時(shí)間效應(yīng)微弱。

(3) IBR生物毒性評價(jià)發(fā)現(xiàn)，河蝦自身在時(shí)間尺度上具有一定的重金屬解毒功能；相比而言，Cd對肝胰腺的潛在生物毒性較大，尤其Cd濃度為0.1 mg·L-1時(shí)，IBR值始終最大，而對于肌肉，Pb的潛在生物毒性較大，尤其Pb濃度為1 mg·L-1時(shí)，10 d后，IBR值仍最大；Cd與Pb聯(lián)合毒性要低于單一金屬。

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