易先亮，孫樺奇，張可可，張明乾

大連理工大學食品與環(huán)境學院，盤錦 124221

有機錫常用作防污涂料、塑料、殺蟲劑和殺菌劑等的有效成分或添加劑，可以通過不同途徑大量地釋放到環(huán)境中，其中尤以三丁基錫(tributyltin)與三苯基錫(triphenyltin，TPT)對環(huán)境的影響最為嚴重，其在極低的環(huán)境濃度下即可引起軟體動物、魚類等物種發(fā)生性畸變等[1]。盡管含有有機錫的防污涂料從20世紀80年代開始已經(jīng)在全世界范圍內(nèi)被陸續(xù)禁用，但是TPT在其他領域(如殺蟲劑等)的廣泛應用使其在海洋環(huán)境中的濃度在近年來仍然呈上升趨勢[2]。

海洋微藻作為海洋生態(tài)系統(tǒng)中最主要的初級生產(chǎn)者，是海洋食物鏈的基礎。而硅藻作為分布廣泛的海洋微藻，其固碳量占全球海洋生態(tài)系統(tǒng)總固碳量的20%，因此其在海洋生態(tài)系統(tǒng)中起著十分重要的作用[3]。假微型海鏈藻(Thalassiosira pseudonana)是一種常見的海洋硅藻，在全球海域中均分布廣泛，此外，假微型海鏈藻是全球第一種被全基因測序的海洋真核藻類[4]。在海洋生態(tài)毒理學研究中，因其個體小、世代周期短、分布廣泛以及有已知的全基因序列等特點，已成為海洋生態(tài)毒理學研究中的理想物種。因此，本研究以假微型海鏈藻為實驗物種，研究了在不同溫度條件下三苯基錫對其細胞生長以及光合作用的影響，為了解不同溫度下污染物對海洋微藻的毒性效應提供科學依據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實驗材料

假微型海鏈藻(CCMP 1015)的原始培養(yǎng)條件為：溫度(25±1) ℃，鹽度32.5‰±1‰(人工海水，0.45 μm濾膜過濾)，pH 7.8，光暗比為14 h:10 h，培養(yǎng)基為f/2-Si。本實驗所使用的錐形瓶及其他玻璃器皿均在酸浴(蒸餾水：HNO3：HCl 體積比為 9:2:1)中浸泡至少24 h后以蒸餾水洗凈、烘干并滅菌。

實驗用氯化三苯基錫(TPTCl；>95%)購自Sigma公司(Sigma-Aldrich，USA)。

1.2 生長抑制實驗

實驗溫度設置為：10 ℃、15 ℃、25 ℃和30 ℃。實驗用假微型海鏈藻由25 ℃經(jīng)接種后置入上述4個溫度的恒溫水浴中，并在各自溫度下培養(yǎng)4個世代周期(> 28 d)以后進行藻類生長抑制實驗以及光合作用抑制實驗。氯化三苯基錫(TPTCl)的暴露濃度設置為0.5、1、2、5、10 μg·L-1與海水空白以及溶劑對照組，除海水空白外，所有TPTCl暴露組與溶劑對照組中的助溶劑濃度均調整為0.05%二甲基亞砜(體積比)。具體暴露實驗條件參照Yi等[5]的方法，本實驗每組處理設置4個平行樣，暴露96 h后以的方法血小球計數(shù)板(Brand GmbH, Wertheim, Germany)確定藻的濃度并計算藻液的細胞密度。本研究中對照組中各平行間的生長率變異系數(shù)小于10%，符合國標要求。

1.3 光合作用抑制實驗

實驗條件、暴露濃度設置與上述生長抑制實驗完全一致。96 h暴露結束后，將所有樣品遮光2 h后，用熒光法來測量每組的藻類光合作用活性，包括photosystem II(PSII)最大光化學量子產(chǎn)量(Fv/Fm)與PSII光化學能量轉化的有效量子產(chǎn)量(ФII)。熒光測量采用WATER-PAM fluorometer (Heinz WalzGmbH，Germany)，光照強度選取與儀器參數(shù)設置參考Yi等[5]方法。

1.4 數(shù)據(jù)分析

將生長速率數(shù)據(jù)與光合作用數(shù)據(jù)應用GraphPad Prism (version 5.00，GraphPad software，San Diego，USA)軟件中的sigmoidal log(dose)-response (variable slope)曲線擬合，以計算不同溫度下TPTCl對T. pseudonana的生長以及光合作用的半數(shù)抑制濃度(IC50)及其95%置信區(qū)間(95%CI)。

不同溫度對細胞生長與光合作用速率的影響結果使用One-way ANOVA進行分析，而溫度與污染物濃度兩因素間的聯(lián)合作用對假微型海鏈藻的生長以及光合作用的影響則采用Two-way ANOVA進行統(tǒng)計分析。進行ANOVA分析前，各組數(shù)據(jù)首先經(jīng)Levene檢驗證明組間方差齊次(P>0.05)。上述分析均由SPSS(version 19，SPSS Inc., Chicago)完成。

2 結果(Results)

2.1 溫度對假微型海鏈藻的生長與光合作用的影響

通過方差分析發(fā)現(xiàn)，空白對照組與助溶劑對照組中的假微型海鏈藻生長無明顯差異，表明0.05%二甲基亞砜對此種微藻的生長沒有影響。溫度條件對假微型海鏈藻的細胞生長與光合作用有顯著影響(見圖1)，在25 ℃條件下，假微型海鏈藻的細胞增長最快，每天的細胞增長數(shù)目為其他溫度下的2倍，而在10 ℃、15 ℃以及30 ℃條件下，假微型海鏈藻的藻細胞密度增長沒有顯著性差異(n=4，one-way ANOVA檢驗，P>0.05)。此外，溫度條件對假微型海鏈藻的光合作用參數(shù)也有顯著影響，在30 ℃條件下，F(xiàn)v/Fm與ФII兩項參數(shù)均顯著低于其他溫度下的值(one-way ANOVA檢驗，P<0.05)，而此兩項參數(shù)在10 ℃、15 ℃與25 ℃下無顯著性差異。

圖1 不同溫度對假微型海鏈藻的生長(a)與光合作用(b、c)的影響Fig. 1 Effect of temperature on the growth rate (a) and photosynthesis parameters (b, c) of Thalassiosira pseudonana

2.2 溫度對TPTCl毒性的影響

在不同溫度下，TPTCl對假微型海鏈藻的生長及光合作用抑制的IC50如表1所示。生長抑制為相對較為敏感的毒性終點，TPTCl在10 ℃、15 ℃、25 ℃與30 ℃下對生長抑制的IC50值分別為1.81、1.69、1.09、0.73 μg·L-1，這些值均低于在同一溫度下其對光合作用參數(shù)的IC50值。而Fv/Fm則相對最不敏感，尤其是在10 ℃與15 ℃條件下，IC50值均大于10 μg·L-1。以10 ℃為例，與對照組相比，ФII的抑制率在本實驗最高暴露濃度10 μg·L-1下為83%，而Fv/Fm的抑制率僅為28%(圖2)。

總的來說，TPTCl對假微型海鏈藻的3個不同試驗終點的IC50值隨著溫度的上升呈下降趨勢。Two-way ANOVA分析結果表明，TPTCl的濃度與溫度的交互作用對Fv/Fm與ФII均有顯著影響，此外，溫度與TPTCl濃度2個因素分別對光合作用參數(shù)均有顯著影響(表2)。

3 討論(Discussion)

3.1 溫度對假微型海鏈藻的生長與光合作用的影響

溫度對海洋微藻的生長與光合作用均有顯著的調節(jié)作用。假微型海鏈藻對溫度的適應范圍較廣，在本實驗中的溫度范圍10～30 ℃條件下均可生長，與其他很多海洋硅藻如半裸舟形藻、雙尖菱板藻細頭變種和菱形藻類似，25 ℃為其最適生長溫度[6]。溫度可以影響微藻體內(nèi)的合成蛋白與多糖酶的活性，合成酶處于最適條件下時，細胞增長的速度最快。在一定的適宜溫度范圍內(nèi)，溫度升高使得細胞內(nèi)部的化學和酶促反應加快，硅藻的生長也相應加快。而當溫度超出適宜范圍之后，細胞內(nèi)的某些組分以及蛋白質、核酸會受到不可逆的損害，并導致細胞機能急劇下降。因此，在本實驗中，當培養(yǎng)溫度達到30 ℃時，假微型海鏈藻的生長速率很低，而光合作用同樣受到顯著的影響[7]。在較低溫度時，細胞新陳代謝的化學反應速率會減慢，硅藻的生長速率也會受到抑制。與高溫條件不同的是，低溫下，假微型海鏈藻的光合作用并未受到影響，此結果與溫度對另外2種硅藻(三角褐指藻、中肋骨條藻)的光合作用參數(shù)影響均一致[8-9]。低溫脅迫對植物光合作用的影響是多方面的，針對溫度對硅藻光合作用影響的試驗結果表明，盡管低溫暴露可以降低硅藻利用光能的能力，但這種影響可逆，暴露一定時間后，硅藻能逐漸啟動恢復機制。由于本實驗中，T. pseudonana已在低溫條件下培養(yǎng)4代以上，因此，低溫條件并未影響其光合作用。相反的，高溫造成的損耗不可逆，這種損耗可能表現(xiàn)為PSII最大光化學轉換效率及實際光能轉化效率的降低，以及PSII的潛在活性以及光合電子傳遞速率的抑制等[9]。

表1 不同溫度下三苯基錫對假微型海鏈藻的生長以及光合作用的半數(shù)抑制濃度(IC50，μg·L-1)及95%置信區(qū)間(95%CI)Table 1 IC50(μg·L-1) of triphenyltin chloride (TPTCl) on the growth and photosynthesis inhibition for Thalassiosira pseudonana at different temperatures

注：*NA表示95%CI無法從劑量-效應曲線中得出。

Note:*NA, not available (95%CI was not able to be obtained from the dose-response curve).

3.2 TPTCl對假微型海鏈藻的毒性作用

在25 ℃條件下，TPTCl對幾種海洋毒理學模式物種如日本虎斑猛水蚤(Tigriopus japonicus)、輪蟲(Brachionus koreanus)以及海水青鳉魚(Oryzias melastigma)的LC50值分別為6.3、29.6、20.5 μg·L-1[10-12]。而假微型海鏈藻對TPTCl較敏感，IC50值與小型浮游動物或魚相比較低。而TPT與另外一

種有機錫TBT對假微型海鏈藻的毒性相近，氧化三丁基錫(TBT oxide)對其96 h-IC50值為1.4 μg·L-1 [13]。Yi等[5]的研究表明，低濃度與高濃度的TPTCl對假微型海鏈藻的毒性效應機制有顯著區(qū)別。在低濃度TPTCl暴露下(< 0.5 μg·L-1)，假微型海鏈藻自身的解毒機制被激活，非光化學猝滅系數(shù)(non-photochemical quenching)增大可以保護PSII并維持光合作用過程的穩(wěn)定，MnSOD與OEE1等蛋白質的表達量升高以抵御過量的胞內(nèi)活性氧。而較高濃度的TPTCl(> 1.0 μg·L-1)可直接破壞部分蛋白功能，抑制代謝，并最終抑制藻類的生長與光合作用。

圖2 不同溫度下TPTCl (μg·L-1)對假微型海鏈藻的(a)Fv/Fm與(b)ФII的影響Fig. 2 Effect of TPTCl on the (a) Fv/Fm and (b) ФII at different temperatures (℃)

DegreeoffreedomFvalueSignificancelevelFv/FmTemperature3882.44<0.001TPTCl61959.90<0.001Interactingeffect18175.36<0.001ФIITemperature398.28<0.001TPTCl61320.79<0.001Interactingeffect1819.71<0.001

3.3 溫度對TPTCl毒性的影響及其種間特異性

Lau等[14]針對溫度對9種不同化學物質的毒性的影響進行了元分析，結果顯示，LC50值隨溫度的升高呈“倒V型”變化趨勢，即化學物質在最適生長溫度下的LC50值最高，毒性最低，而LC50值隨著溫度的升高或降低均呈下降趨勢。比如，對于海水青鳉，TPTCl在20 ℃的LC50最大[12]。然而，此結論并非適用于所有生物。由于不同物種的種間特異性，溫度對污染物毒性的影響對不同的物種呈現(xiàn)出不同的趨勢。例如，TPTCl對小型浮游動物日本虎斑猛水蚤與輪蟲的LC50與溫度的升高均呈負相關[12]。本研究中，TPTCl對假微型海鏈藻的毒性隨溫度變化的趨勢與小型浮游動物類似。

上述溫度對污染物毒性影響的種間特異性可能與污染物對不同物種的毒性效應機制(如靶器官以及代謝途徑等)不同有關。一般對于魚類(以海水青鳉魚為例)來說，溫度升高使其代謝速率加快，并進一步促進污染物的攝入量與污染物在其體內(nèi)的生物積累[15]。而低溫條件可引起供氧不足，從而改變糖酵解的路徑并最終導致魚個體需要更多能量來維持蛋白功能，因此，魚類在低溫條件下對污染物也相對更加敏感[16]。對于小型浮游動物來說，溫度升高引起的污染物毒性變化的原因與魚類相似[17]。而在低溫條件下，小型浮游動物如T. brevicornis等會進入休眠狀態(tài)，進而抑制新陳代謝速率，減少污染物的攝入量與生物積累，此種狀態(tài)是對低溫條件下節(jié)約能量的一種適應性[18]。

致謝：感謝周豪博士在本文撰寫過程中給予的指導與幫助。

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