（泰安市岱岳區(qū)畜牧獸醫(yī)局，山東泰安 271018）

規(guī)模牛場產(chǎn)氣莢膜梭菌耐藥性及其ERIC-PCR指紋圖譜分型

鐘召兵，王 寧，孫紅華，楊夫會

（泰安市岱岳區(qū)畜牧獸醫(yī)局，山東泰安 271018）

[目的]了解不同規(guī)模牛場分離的產(chǎn)氣莢膜梭菌耐藥性及其耐藥基因分型，為臨床治療和感染控制提供依據(jù)。[方法]收集2014—2016年來自不同規(guī)模牛場分離的產(chǎn)氣莢膜梭菌25株，采用K-B法檢測其對9種常用抗生素的敏感性；應(yīng)用基因間重復(fù)序列聚合酶鏈反應(yīng)（ERIC-PCR），對菌株進(jìn)行DNA分型及同源性分析。[結(jié)果]分離到25株產(chǎn)氣莢膜梭菌；在耐藥檢測的9種藥物中，耐藥率超過50%的有4種，其中對慶大霉素耐藥率最高（92%），其次是對青霉素（84%），而對氨芐青霉素耐藥率最低（4%），對其余藥物的耐藥率在12%～52%之間；ERIC-PCR譜型表現(xiàn)為9個基因型（Ⅰ～Ⅸ），其中大部分來源于不同的克隆株，且有2個克隆株的相似度為100%。[結(jié)論]奶牛場的產(chǎn)氣莢膜梭菌多重耐藥現(xiàn)象比較嚴(yán)重，分子多樣性復(fù)雜；產(chǎn)氣莢膜梭菌來源廣泛，不同地區(qū)、環(huán)境和條件下，同一種病原菌的基因型存在一定差異，可能存在多個基因型。

產(chǎn)氣莢膜梭菌；耐藥性；ERIC-PCR；分型；牛

產(chǎn)氣莢膜梭菌是廣泛分布于水、土壤、食物以及人和動物糞便和腸道中一種人獸共患病原體，在畜群中主要引起羔羊痢疾、牛羊“猝死癥”、牛腸毒血癥和綿羊軟腎病[1]。據(jù)有關(guān)資料表明，近年來在我國流行的家畜“猝死癥”大部分與產(chǎn)氣莢膜梭菌感染有關(guān)[2]。近年來，該病的發(fā)病數(shù)量逐年增多，流行特點(diǎn)也由點(diǎn)狀散發(fā)發(fā)展為片狀散發(fā)，給我國養(yǎng)殖業(yè)造成了較大的經(jīng)濟(jì)損失[3]。傳統(tǒng)的控制產(chǎn)氣莢膜梭菌病的方法主要是應(yīng)用抗生素和疫苗。但隨著時間的推移，原先使用的抗生素和疫苗對畜群的保護(hù)率越來越低，導(dǎo)致產(chǎn)氣莢膜梭菌病的暴發(fā)呈上升趨勢。

本研究以規(guī)模奶牛場收集到的產(chǎn)氣莢膜梭菌為實(shí)驗(yàn)材料，在藥敏試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，應(yīng)用基因間重復(fù)序列引物PCR（Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus Sequence-based PCR，ERICPCR）方法，分析其基因型及分子多態(tài)性，為指導(dǎo)規(guī)模牛場臨床合理使用抗生素、科學(xué)修訂防控方案以及控制耐藥產(chǎn)氣莢膜梭菌的傳播提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

樣品為2014—2016年從不同規(guī)模牛場采集的產(chǎn)氣莢膜梭菌25株，均為不重復(fù)株（表1）。實(shí)驗(yàn)前使用VTTEK-32全自動細(xì)菌分析儀系統(tǒng)，進(jìn)行重新鑒定。質(zhì)控菌株參考銅綠假單胞菌株ATCC27853，大腸埃希氏菌ATCC25922作為對照株。

表1 被研究的奶牛場情況

1.2 產(chǎn)氣莢膜梭菌的藥敏試驗(yàn)

采用美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）推薦的紙片擴(kuò)散法（K-B法），選用以下抗生素的藥敏紙片：氨芐青霉素、頭孢噻肟、先鋒霉素、諾氟沙星、阿米卡星、強(qiáng)力霉素、頭孢他啶、青霉素、慶大霉素。結(jié)果判定及質(zhì)量控制按2010年CLSI標(biāo)準(zhǔn)[4]進(jìn)行（表2）。

表2 抗生素耐藥標(biāo)準(zhǔn)

1.3 產(chǎn)氣莢膜梭菌同源性檢測

1.3.1 細(xì)菌總DNA的提取。按細(xì)菌基因組提取試劑盒操作說明書進(jìn)行細(xì)菌DNA提取，提取后的產(chǎn)物于-20 ℃ 保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 引 物 序 列[5]。E R I C 1：5′-ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC-3′；ERIC2：5′-AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3′。以上所有引物由上海生工生物有限公司合成。

1.3.3 ERIC-PCR反應(yīng)體系。10×PCR buffer （Mg2+free）2.5 μL，MgCl2（2.5 mmol/L）2 μL，dNTP（2.5 mmol/L）2.5 μL，上下游引物（25 μmol/L）各1 μL，模板DNA 2 μL，Taq DNA聚合酶（5 U/ μL）0.5 μL，用滅菌雙蒸水補(bǔ)足25 μL。PCR基本反應(yīng)程序?yàn)?，預(yù)變性95 ℃ 4 min，94 ℃ 30 s，36 ℃1 min，68 ℃ 8 min，10個循環(huán)；變性溫度上升到48 ℃和52 ℃時，分別設(shè)為15和10個循環(huán)，最后于68 ℃ 延伸16 min；瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色成像。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理。每個樣品的擴(kuò)增帶存在時賦值為“1”，不存在時賦值為“0”。用電泳圖像分析軟件（Gel Image System，Version 4.00） 自動生成矩陣圖。采用非加權(quán)對數(shù)算術(shù)平均法（Unweighted pair group method using averages algorithm，UPGMA），利用NTSYS-pc 2.10軟件構(gòu)建聚類樹狀圖。另外，每個分離株看作是一個分類學(xué)單位（Operational taxonomic unit，OUT），并且把相似性≥90%的菌株看作起源相同的菌株[6]。為減少誤差，所有菌株在相同反應(yīng)條件下一次完成，而且電泳也是在同一塊凝膠中一次完成。

2 結(jié)果

2.1 產(chǎn)氣莢膜梭菌分離株對常用藥物的敏感性

分離的25株產(chǎn)氣莢膜梭菌的耐藥性情況見表3。參照《中華人民共和國獸藥典》[7]，選取9種針對革蘭氏陽性厭氧菌的藥物，分別對分離的產(chǎn)氣莢膜梭菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果為：對慶大霉素的耐藥性最強(qiáng)，耐藥率達(dá)到了92%；其次為青霉素，耐藥率為84%；再其次為強(qiáng)力霉素、諾氟沙星，耐藥率均為52%；對其他藥物的耐藥率在4%～12%之間。

表3 25株產(chǎn)氣莢膜梭菌對抗菌藥物的耐藥性

2.2 ERIC-PCR分型結(jié)果

25株產(chǎn)氣莢膜梭菌菌株的ERIC-PCR指紋圖譜的條帶數(shù)為3～12，片段大小在0.1～4.5 kb之間。以相似系數(shù)0.8為分界線，25株產(chǎn)氣莢膜梭菌可分為9個基因型，分別描述為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ型，其中Ⅴ型最多，有10株，占總菌株的40%，為主要流行型。8號、14號、15號、23號菌株各自單獨(dú)成為1個型。15號與其余菌株指紋圖譜差異較大，親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。所有產(chǎn)氣莢膜梭菌菌株均有約1 000 bp 大小的特異性條帶，最遠(yuǎn)親緣關(guān)系為70%，17號與21號菌株親緣關(guān)系最近，為100%（圖1）。

3 討論

圖1 25株產(chǎn)氣莢膜梭菌的ERIC-PCR聚類圖

近年來，產(chǎn)氣莢膜梭菌的分離率及耐藥率不斷上升，其在不同地區(qū)、不同規(guī)模畜禽場的耐藥特征存在明顯差異，常表現(xiàn)為多重耐藥和泛藥，已成為規(guī)模畜禽場的重要病原菌，且耐藥性呈逐年上升趨勢。本研究顯示，25株臨床分離的產(chǎn)氣莢膜梭菌對慶大霉素耐藥率最高（92%），青霉素次之（84%），對強(qiáng)力霉素、諾氟沙星耐藥率居中（52%），對頭孢噻肟（8%）、先鋒霉素（8%）、頭孢他啶（8%）等耐藥率較低，對氨芐青霉素耐藥率最低（4%）。因此，及時準(zhǔn)確地檢出耐藥菌株，對建立和完善抗菌藥物臨床應(yīng)用和細(xì)菌耐藥預(yù)警機(jī)制具有十分重要的意義。

臨床分離菌株的基因同源性分析，對于流行病學(xué)調(diào)查，特別是傳染源和傳播途徑的追蹤具有重要意義。ERIC-PCR是由Versalovic等[8]發(fā)展建立起來的，其原理是通過PCR擴(kuò)增細(xì)菌基因的重復(fù)DNA片段，獲得菌株特異性遺傳圖譜。ERIC片段中的回文特性以及能形成框架結(jié)構(gòu)的特性是導(dǎo)致其具有高度保守、結(jié)構(gòu)分散等多重功能的關(guān)鍵。它可以用1對或多對引物，通過計算機(jī)將ERIC-PCR的電泳圖譜進(jìn)行綜合分析，準(zhǔn)確反映菌株間基因組存在的差異，故可應(yīng)用于不同種或不同型別菌株的同源性分析。倪學(xué)琴等[9]應(yīng)用ERIC-PCR方法，把從健康雞群中分離到的34株產(chǎn)氣莢膜梭菌分為8個亞型，并證實(shí)ERIC-PCR和REP-PCR都能對該菌進(jìn)行有效分型，但ERIC-PCR產(chǎn)生的條帶更多，更適合產(chǎn)氣莢膜梭菌的亞型分類。因此，ERICPCR作為一種行之有效的分子分型技術(shù)，為產(chǎn)氣莢膜梭菌的流行病學(xué)調(diào)查提供了一個快捷的工具，有利于快速判斷某個地區(qū)的流行菌株及其傳播情況，從而為防控疫病提供重要參考[10]。

本實(shí)驗(yàn)在藥敏試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用雙引物ERIC-PCR法，對25株產(chǎn)氣莢膜梭菌進(jìn)行分型。根據(jù)ERIC電泳圖譜中條帶的數(shù)目及位置，經(jīng)NTSYS統(tǒng)計軟件聚類分析，得到遺傳樹狀圖。研究結(jié)果顯示，25株產(chǎn)氣莢膜梭菌ERIC-PCR指紋圖譜條帶數(shù)為3～12，片段大小在0.1～4.5 kb之間，可清晰分成9個基因型。菌株之間的遺傳距離相同或接近，反映了這9個基因型中的菌株親緣關(guān)系較近。其中來自同一奶牛場的17號與21號菌株的親緣關(guān)系相同，其他大部分來源于不同的克隆株，其中Ⅴ型菌株數(shù)量最多，Ⅳ型和Ⅵ型次之，顯示同種克隆株在不同規(guī)模牛場之間相互傳播可能是造成規(guī)模牛場產(chǎn)氣莢膜梭菌感染的主要原因之一。來自同一牛場不同個體或同一個體不同乳區(qū)的分離株，既存在相同的基因型，也存在不同的基因型（22號與23號菌株），而來自不同牛場的分離株也可能屬于同一基因型（Ⅳ型與Ⅴ型）。此外，本次實(shí)驗(yàn)出現(xiàn)了少量遺傳距離較遠(yuǎn)的、親緣關(guān)系相差較大的菌株。這些研究結(jié)果提示：本地區(qū)奶牛場的產(chǎn)氣莢膜梭菌多為同一基因型；在某個或某些牛群中存在某一產(chǎn)氣莢膜梭菌的優(yōu)勢基因型；不同地區(qū)、環(huán)境和條件下，同一種病原菌的基因型也存在一定差異，可能存在多個基因型。

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（責(zé)任編輯：朱迪國）

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Drug Resistance of Clostridium Perfringens in Scale Dairy Farms and Fingerprint Typing Analysis by ERIC-PCR

Zhong Zhaobing，Wang Ning，Sun Honghua，Yang Fuhui
（Daiyue District Animal Husbandry and Veterinary Bureau，Tai'an，Shandong 271018）

[Objective]To recognize the drug resistance of Clostridium perfringens（C. perfringens）and to determine the genotype of resistance genes in different scale dairy farms，so as to provide the basis for clinical treatment and infection control.[Methods] Collecting 25 strains of C. Perfringens from different scale farms during 2014—2016，using K-B method to detect the sensitivity against 9 kinds of antibiotics，then conducting DNA typing tests by enterobacteriaceae intergenic repetitive sequence polymerase chain reaction（ERIC-PCR）and analyzing the genetic homology.[Results] 25 C. perfringens strains were isolated. Among the 9 kinds of antibiotics，4 of them had a drug resistance rate of over 50%. The drug resistance rate of the strains against Gentamicin was highest（ratio of 92%），followed by Penicillin（ratio of 84%），the lowest was Ampicillin（4%），and the rest was in the range from 12% to 52%. Besides，by means of ERIC-PCR， fi ngerprint typing analysis showed the isolated strains could be divided into 9 genotypes（Ⅰ～Ⅸ），most of which came from different clone strains，a similarity of 100% was found between two clones.[Conclusion] C. Perfringens with complex molecular diversity in dairy farms showed serious multiple drugresistance to antibiotics，these strains had an extensive source，and there was certain differences in the genotype of the same kind of C. Perfringens，possibly existing multiple genotypes.

C. perfringens；drug resistance；ERIC-PCR；genotype；cow

S852.6

A

1005-944X（2017）03-0087-04

10.3969/j.issn.1005-944X.2017.03.023

泰安市科技計劃“奶牛高產(chǎn)高效繁育技術(shù)集成示范”（2016）