張悅勇，南文龍，秦立得，鞏明霞，吳發(fā)興，單 虎，陳義平

（1.中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島 266032；2.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)，山東青島 266109）

豬偽狂犬病毒納米PCR檢測(cè)方法的建立

張悅勇1，2，南文龍1，秦立得1，鞏明霞1，吳發(fā)興1，單 虎2，陳義平1

（1.中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島 266032；2.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)，山東青島 266109）

[目的]快速靈敏檢測(cè)豬偽狂犬病毒（PRV）[方法]根據(jù)PRV gB基因設(shè)計(jì)特異性引物，建立了PRV納米PCR檢測(cè)方法。[結(jié)果]PRV納米PCR方法的最低檢出限為10 拷貝/μL，其敏感性比未添加納米金的對(duì)照PCR提高100倍；建立的納米PCR與豬細(xì)小病毒、豬圓環(huán)病毒Ⅱ型、豬繁殖與呼吸綜合征病毒等常見(jiàn)豬病毒性病原均無(wú)交叉反應(yīng)。應(yīng)用納米PCR和PRV國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中的PCR方法，對(duì)2014—2016年期間采集自17個(gè)省市發(fā)病豬場(chǎng)的148份臨床樣品進(jìn)行平行檢測(cè)，PRV納米PCR的陽(yáng)性檢出率為49.3%（73/148），PRV國(guó)標(biāo)PCR方法的陽(yáng)性檢出率為23.6%（35/148），并且PRV納米PCR檢測(cè)為陽(yáng)性，而PRV國(guó)標(biāo)PCR方法檢測(cè)為陰性的38份樣品，測(cè)序結(jié)果均確認(rèn)為PRV陽(yáng)性。[結(jié)論]本研究建立的納米PCR檢測(cè)方法敏感特異，可用于豬偽狂犬病的病原學(xué)檢測(cè)。

豬偽狂犬病毒；納米PCR；gB基因

豬偽狂犬病毒（Pseudorabies virus，PRV）是常見(jiàn)的引起豬繁殖障礙性疾病的病原，可引起母豬流產(chǎn)、不孕，產(chǎn)死胎、畸形胎、木乃伊胎及弱胎等。同時(shí)，還能使仔豬出現(xiàn)神經(jīng)癥狀、嚴(yán)重的呼吸道癥狀，甚至死亡。PRV在我國(guó)豬群中廣泛存在，對(duì)我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成較大的經(jīng)濟(jì)損失。建立快速、敏感的PRV檢測(cè)方法，對(duì)該病的防控具有重要意義。常規(guī)的病毒分離鑒定方法，雖然準(zhǔn)確，但費(fèi)時(shí)費(fèi)力[1]。PCR方法操作簡(jiǎn)單，檢測(cè)快速，已成為PRV檢測(cè)的常用方法之一。為了提高常規(guī)PCR方法的敏感性，本研究擬建立敏感、特異的PRV納米PCR檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 病毒與臨床樣品

PRV、豬細(xì)小病毒（PPV）、豬圓環(huán)病毒Ⅱ型（PCV2）、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）、古典豬瘟病毒（CSFV）、豬流行性腹瀉病毒（PEDV）核酸、H1亞型豬流感病毒（SIV-H1）核酸、H3亞型豬流感病毒（SIV-H3）核酸，均由本實(shí)驗(yàn)室保存；148份臨床疑似PRV感染的組織樣品，主要包括腦、淋巴結(jié)、脾等組織，于2014—2016年期間采集于山東、河南、黑龍江等17個(gè)?。ㄊ校┑陌l(fā)病種豬場(chǎng)。

1.2 主要試劑

NanoPCR試劑盒，購(gòu)自大正醫(yī)療器械股份有限公司；Taq DNA Polymerase、2×GC BufferⅡ、dNTPs、DL2000 DNA Marker、pMD18-T載體、Reverse Transcriptase M-MLV（RNase H-）、Oligo（dT）購(gòu)自TaKaRa公司；DNA提取試劑盒，購(gòu)自QIAGEN 公司；RNA提取試劑盒購(gòu)自Roche公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)

比對(duì)Genbank上發(fā)表的PRV gB基因，選取基因保守區(qū)域，應(yīng)用Primer premier 5.0軟件設(shè)計(jì)1對(duì)PRV檢測(cè)引物，由Takara公司合成（表1）。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性質(zhì)粒的制備

按照DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)方法提取PRV細(xì)胞培養(yǎng)物DNA，以其為模板用表1中的引物進(jìn)行擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后克隆于pMD18-T載體中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD-gB，測(cè)序正確后作為標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性質(zhì)粒模板。

1.5 PRV納米PCR的建立及條件優(yōu)化

參照NanoPCR試劑盒說(shuō)明書(shū)的方法，將納米PCR反應(yīng)體系預(yù)設(shè)定為：2×Nano Buffer 12.5 μL，gB-F/gB-R（20 μmol/L）各0.5 μL，Taq酶（5 U/μL）0.5 μL，pMD18-gB標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性質(zhì)粒模板2 μL，滅菌水補(bǔ)至25 μL。將不添加納米金的對(duì)照PCR反應(yīng)體系預(yù)設(shè)定為：2×GC BufferⅡ 12.5 μL，dNTPs 2 μL，gB-F/gB-R（20 μmol/L）各0.5 μL，Taq 酶（5 U/μL）0.5 μL，pMD18-gB標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性質(zhì)粒模板2 μL，滅菌水補(bǔ)至25 μL。納米PCR和對(duì)照PCR的反應(yīng)條件，均預(yù)設(shè)定為94 ℃ 5 min；94 ℃ 45 s，60 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。

保持預(yù)設(shè)的其他反應(yīng)體系指標(biāo)條件不變，優(yōu)化納米PCR退火溫度，設(shè)定為54～64 ℃，間隔2 ℃。之后，再優(yōu)化其反應(yīng)體系組分用量：Buffer體積9.5 ～14.5 μL，間隔1 μL；酶（5 U/μL）體積0.2 ～0.7 μL，間隔0.1 μL；引物（20 μmol/L）體積從0.1 ～1.1 μL進(jìn)行優(yōu)化，間隔0.2 μL。

1.6 敏感性試驗(yàn)

使用Qubit 2.0分別測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性質(zhì)粒模板的濃度后，進(jìn)行10倍倍比稀釋?zhuān)x擇10-1～10-8作為濃度梯度模板標(biāo)準(zhǔn)品，滅菌水作為陰性對(duì)照，應(yīng)用PRV納米PCR和對(duì)照PCR進(jìn)行檢測(cè)，比較二者檢測(cè)敏感性差異。

1.7 特異性試驗(yàn)

參照DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)方法，提取PPV和PCV2病毒液的DNA作為模板；參照RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)方法，提取PRRSV、CSFV病毒液的RNA，對(duì)PEDV、SIV-H1亞型及SIV-H3亞型的核酸，按M-MLV說(shuō)明書(shū)方法，應(yīng)用Oligo（dT）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，將反轉(zhuǎn)錄的cDNA作為模板。應(yīng)用所建立的納米PCR方法檢測(cè)上述模板，確定納米PCR方法的特異性。

1.8 臨床樣品的檢測(cè)

將148份臨床樣品分別剪碎、研磨，參照DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取DNA，分別用所建立的PRV納米PCR和PRV國(guó)標(biāo)中的PCR檢測(cè)方法[2]平行檢測(cè)，比較檢測(cè)結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 目的基因的擴(kuò)增結(jié)果

對(duì)PRV細(xì)胞培養(yǎng)物DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增出了1條與預(yù)期的338bp大小一致的特異性片段（圖1）。

2.2 PRV納米PCR 的建立及條件優(yōu)化

圖1 PRV納米PCR擴(kuò)增結(jié)果

通過(guò)對(duì)納米PCR 反應(yīng)的退火溫度、2×Nano Buffer濃度、引物濃度及Taq聚合酶濃度進(jìn)行優(yōu)化，最終確定PRV納米PCR的最佳反應(yīng)體系為2×Nano Buffer 12.5 μL，gB-F/gB-R （20 μmol/L）各0.5 μL ，Taq 酶（5 U/μL） 0.5 μL，DNA 模板4 μL，滅菌水補(bǔ)至25 μL；最佳反應(yīng)條件為94 ℃ 5 min，94 ℃ 45 s、58 ℃ 45 s、72 ℃ 45 s，40個(gè)循環(huán)，72 ℃ 10 min。對(duì)照PCR 最佳反體系參考預(yù)設(shè)，反應(yīng)條件同納米PCR一致。

2.3 敏感性試驗(yàn)結(jié)果

將重組質(zhì)粒模板進(jìn)行10倍梯度稀釋后，得到濃度梯度模板標(biāo)準(zhǔn)品（1.0×101～ 1×109拷貝/μL）。結(jié)果顯示，PRV納米PCR 方法最低檢出限為1.0×101拷貝/μL（圖2A），PRV對(duì)照PCR的最低檢出限為1.0×103拷貝/μL（圖2B），PRV納米PCR方法的敏感性比未添加納米金的對(duì)照PCR提高100倍。

2.4 特異性試驗(yàn)結(jié)果

應(yīng)用所建立的PRV納米PCR分別檢測(cè)PRV、PPV、PCV2、PRRSV、CSFV、PEDV、SIV-H1及SIV-H3的DNA 或cDNA模板。只有檢測(cè)PRV的DNA模板時(shí)出現(xiàn)特異性擴(kuò)增條帶，其他7種病原檢測(cè)均無(wú)擴(kuò)增條帶出現(xiàn)（圖3），這表明該納米PCR具有良好的特異性，與常見(jiàn)豬病毒性病原無(wú)交叉反應(yīng)。

圖3 PRV納米PCR 的特異性試驗(yàn)

2.5 臨床樣品的檢測(cè)

對(duì)148份臨床樣品進(jìn)行檢測(cè)，PRV納米PCR的陽(yáng)性率檢出為49.3%（73/148），PRV國(guó)標(biāo)PCR方法的陽(yáng)性檢出率23.6%（35/148）。PRV國(guó)標(biāo)PCR檢測(cè)為陽(yáng)性的樣品，經(jīng)納米PCR檢測(cè)均為陽(yáng)性；PRV納米PCR檢測(cè)為陽(yáng)性，而PRV國(guó)標(biāo)PCR方法檢測(cè)為陰性的38份樣品，經(jīng)測(cè)序鑒定，結(jié)果均確認(rèn)為PRV陽(yáng)性。

3 討論

納米技術(shù)是近年來(lái)的研究熱點(diǎn)，2012年以來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者先后將其用于魚(yú)溶藻弧菌病、非洲豬瘟病毒病、豬細(xì)小病毒病、豬博卡病毒病、豬偽狂犬病毒病及豬流行性腹瀉病毒病等動(dòng)物疫病的檢測(cè)[2-8]。

由于PRV的DNA G+C含量高，高達(dá)74%，引物的Tm值很高[9]，采用常規(guī)PCR方法擴(kuò)增PRV DNA可能會(huì)對(duì)檢測(cè)的敏感性產(chǎn)生影響。納米PCR是一種新型PCR技術(shù)，該方法在PCR反應(yīng)體系中加入1～100 nm的納米金粒子，PCR反應(yīng)溫度變化過(guò)程中，納米粒子在反應(yīng)液體中形成納米流體，提高反應(yīng)的導(dǎo)熱性，提高升溫和降溫的速度，減少在非目的溫度停留的時(shí)間，提高引物與模板的配對(duì)效率，從而提高PCR反應(yīng)的特異性和敏感性，減少退火溫度對(duì)PCR 反應(yīng)的影響[10-12]。

本研究通過(guò)比對(duì)Genbank上PRV及其變異株的序列，針對(duì)PRV gB基因的保守區(qū)域設(shè)計(jì)了一對(duì)目的片段長(zhǎng)度為338 bp的特異性引物，經(jīng)反應(yīng)體系和反應(yīng)條件的優(yōu)化，建立了敏感、特異的PRV納米PCR檢測(cè)方法。敏感性試驗(yàn)表明PRV納米PCR方法可顯著提高PCR反應(yīng)的敏感性，最低檢出限為10拷貝/μL，比不添加納米金的常規(guī)PCR方法（最低檢出限為1.0×103拷貝/μL）敏感性提高100倍，與Ma Xingjie等[5]的報(bào)道一致。同時(shí)，本研究還使用PRV細(xì)胞培養(yǎng)病毒DNA模板進(jìn)行了測(cè)試，納米PCR最低檢出限約為50個(gè)TCID50/0.1mL。本方法具有良好的特異性，與豬細(xì)小病毒、豬圓環(huán)病毒Ⅱ型、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、經(jīng)典豬瘟病毒、H1亞型豬流感病毒及H3亞型豬流感病毒等7種常見(jiàn)豬病毒性病原無(wú)交叉反應(yīng)。

應(yīng)用建立的PRV納米PCR檢測(cè)方法和PRV國(guó)標(biāo)PCR方法對(duì)2014—2016年期間采集于我國(guó)不同地區(qū)發(fā)病豬場(chǎng)的148份臨床樣品進(jìn)行平行檢測(cè)，PRV納米PCR的陽(yáng)性檢出率為49.3%，PRV國(guó)標(biāo)PCR方法的陽(yáng)性檢出率為23.6%。與現(xiàn)行PRV國(guó)標(biāo)PCR方法相比，納米PCR對(duì)PRV的檢測(cè)具有更高的陽(yáng)性檢出率，經(jīng)測(cè)試其敏感性約為國(guó)標(biāo)方法的100倍。

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（責(zé)任編輯：孫榮釗）

A NanoPCR Assay for Detection of Pseudorabies Virus

Zhang Yueyong1，2，Nan Wenlong1，Qin Lide1，Gong Mingxia1，Wu Faxing1，Shan Hu2，Chen Yiping1
（1. China Animal Health and Epidemiology Center，Qingdao，Shandong 266032；2. Qingdao Agricultural University，Qingdao；Shandong 266109）

[Objective]In order to develop a rapid and sensitive method for detecting Pseudorabies virus （PRV）. [Methods]A nanoPCR assay for detection of PRV was developed with a pair of speci fi c primers that were designed based on sequence of gB gene.[Results]Results showed the detection limit of this assay was 10 copies/μL，sensitivity of which was 100 times higher than conventional PCR assay that no gold nanoparticle was added. Good speci fi city was also identi fi ed that there was no cross reaction with other common viral pathogens of swine such as porcine parvovirus（PPV），porcine circovirus type 2（PCV2），porcine reproductive and respiratory syndrome virus （PRRSV）. Using PRV nanoPCR and national standard PCR test of gB gene，148 clinical samples collected from 17 different areas during 2014-2016 were conducted parallel detection. The positive rates by nanoPCR and national standard PRV were 43.5%（73/148）and 27.2%（35/148）. 38 samples tested negative by national standard PRV presented a positive result when using the method of nanoPCR，which were consistent with DNA sequencing.[Conclusion]The established PRV nanoPCR method was applicable for pathogenic detection of PRV due to its high sensitivity and good speci fi city.

Pseudorabies virus；nanoPCR；gB gene；detection

S852.651

B

1005-944X（2017）03-0102-04

10.3969/j.issn.1005-944X.2017.03.026

科技部國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2016YFD0501501）