楊佳琪，檀 軍，曹米蘭，金道超，郭建軍*

(1. 貴州大學(xué)昆蟲研究所，貴州山地農(nóng)業(yè)病蟲害重點實驗室，貴陽 550025; 2. 遵義醫(yī)學(xué)院，貴州遵義 563099)

CCK-8法檢測九香蟲血淋巴對人乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖的抑制作用

楊佳琪1，檀 軍2，曹米蘭1，金道超1，郭建軍1*

(1. 貴州大學(xué)昆蟲研究所，貴州山地農(nóng)業(yè)病蟲害重點實驗室，貴陽 550025; 2. 遵義醫(yī)學(xué)院，貴州遵義 563099)

為了明確九香蟲血淋巴對人乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖的抑制作用，本文利用Bradford法檢測九香蟲血淋巴濃度，用不同濃度的九香蟲血淋巴處理體外培養(yǎng)的MCF-7細(xì)胞，采用CCK-8法檢測九香蟲血淋巴對MCF-7細(xì)胞的抑制作用。結(jié)果表明：九香蟲血淋巴能顯著抑制人乳腺癌MCF-7細(xì)胞的生長，且對MCF-7的抑制率呈時間、劑量依賴關(guān)系。

九香蟲；血淋巴；乳腺癌；CCK-8法

乳腺癌嚴(yán)重威脅著女性健康。全世界每年約有120萬婦女患乳腺癌，50萬人死于乳腺癌，其長期居于女性腫瘤患者致死率的第2位；近年來我國乳腺癌的發(fā)病率也呈逐年上升趨勢，且發(fā)病年齡逐漸降低，并且隨著社會經(jīng)濟發(fā)展，女性生活方式顯著改變，乳腺癌相關(guān)危險因素普遍存在，預(yù)計未來較長一段時間我國乳腺癌的發(fā)病率和死亡率還將持續(xù)上升(鄭瑩等，2013)。目前，抗乳腺癌藥物對腫瘤有一定療效，但仍存在著嚴(yán)重的毒副作用。因此，尋找高效、低毒、安全的抗乳腺癌藥物仍是當(dāng)前治療的當(dāng)務(wù)之急。

藥用歷史悠久的中藥材九香蟲AspongopuschinensisDallas, 1851是昆蟲綱Insecta半翅目Hemiptera兜蝽科Dinidoridae昆蟲(彩萬志等，2001)，因其理氣止痛、溫中助陽的功能以及含有抗癌的藥用成分而倍受人們的重視(張笠等，2011)?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)也認(rèn)為九香蟲對某些種類的腫瘤和癌癥亦有良好的治療效果(林普蓮，2005；徐波等，2007)。近年來，國外研發(fā)了一種綜合指標(biāo)較好的細(xì)胞活性檢測方法CCK-8法(Cell Counting Kit-8)，其原理為活細(xì)胞線粒體脫氫酶轉(zhuǎn)化的黃色結(jié)晶為高度水溶性，不需要裂解細(xì)胞，可直接進行比色；該法步驟簡便，且準(zhǔn)確性高(Tominagaetal., 1999；熊建文等，2007；劉愛旗和夏璐，2013)，目前在國際上被廣泛應(yīng)用于免疫學(xué)、腫瘤學(xué)、及醫(yī)用材料生物相容性等方面的研究(鄒穎等，2011；辛培成等，2011；趙惠君等，2012)。因此，本實驗利用Bradford法(李海玲等，2008；喻輝輝等，2010；張志濤等，2011)測得九香蟲血淋巴蛋白含量后，擬采取該技術(shù)檢測九香蟲血淋巴對乳腺癌MCF-7的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 供試材料

人乳腺癌細(xì)胞MCF-7，購自中科院上海細(xì)胞庫；九香蟲活蟲采自貴州習(xí)水縣，經(jīng)貴州大學(xué)郭建軍教授鑒定。

1.1.1 主要試劑

Bradford蛋白濃度測定試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所)；DMEM(Hyclone公司)；胎牛血清(杭州四季青)；胰蛋白酶(美國賽默飛世爾科技有限公司)；青鏈霉素(雙抗)(索萊寶公司)；PBS緩沖液(北京鼎國昌盛生物公司)；CCK-8試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所)。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

酶標(biāo)儀(帝肯瑞士公司)；CO2培養(yǎng)箱(美國賽默飛世爾科技有限公司)；生物安全柜(西班牙Telstar公司)；離心機(德國Sigma公司)。

1.2 方法

1.2.1 九香蟲血淋巴制備

野外采集九香蟲活蟲，-20℃冰箱內(nèi)致死；將其頭部及翅膀掰下，剩余部分置于無針頭的10 mL注射器內(nèi)，擠壓將九香蟲體內(nèi)物質(zhì)與蟲體分離，并向存放九香蟲血淋巴的離心管中加入檸檬酸鈉(0.5 mmol/L)，3500 rpm/min，4℃離心10 min，取中部的水溶性組分置于新的離心管中，制得九香蟲血淋巴組分。

1.2.2 Bradford法檢測九香蟲蛋白濃度

完成溶解蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，取10 μL加緩沖液PBS稀釋至100 μL，使終濃度為0.5 mg/mL。將稀釋后的標(biāo)準(zhǔn)品按0、1、2、4、8、12、16、20 μL加到96孔板中，加緩沖液PBS補足到20 μL。取過濾除菌后的九香蟲血淋巴10 μL加緩沖液PBS至100 μL，將稀釋后的九香蟲血淋巴1 μL加到96孔板中，加緩沖液PBS補足到20 μL。各孔加入200 μL G250染色液，室溫放置3-5 min。用酶聯(lián)免疫檢測儀測定A595，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出樣品中的蛋白濃度。

1.2.3 癌細(xì)胞培養(yǎng)

將人乳腺癌MCF-7細(xì)胞體外培養(yǎng)于DMEM(高糖)培養(yǎng)基(10%胎牛血清，1%雙抗)，置于37℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.4 九香蟲血淋巴對人乳腺癌MCF-7生長的影響

取指數(shù)生長期細(xì)胞，使用血細(xì)胞計數(shù)板對細(xì)胞懸液計數(shù)；將細(xì)胞懸液接種到96孔培養(yǎng)板中，采用倍比稀釋法，調(diào)節(jié)細(xì)胞的濃度，使得濃度達到5×104個/mL，每組4孔，每孔加入細(xì)胞懸液100 μL，待細(xì)胞貼壁后，分別加入九香蟲血淋巴1、5、10、15 μL(血淋巴處理組含0.5 mmol/L的檸檬酸鈉)，并加入緩沖液PBS，每孔總體積補至115 μL，使得反應(yīng)體系中血淋巴濃度比為1 ∶5 ∶10 ∶15，設(shè)置無藥對照組(培養(yǎng)液中有細(xì)胞)，并對應(yīng)設(shè)置空白對照組(培養(yǎng)液中無細(xì)胞)，在二氧化碳培養(yǎng)箱中37℃、5%二氧化碳濃度下分別培養(yǎng)12、24、36 h后取出培養(yǎng)板，并在96孔培養(yǎng)板的相應(yīng)孔中加入CCK-8試劑10 μL，再將培養(yǎng)板重新放回二氧化碳培養(yǎng)孵育4 h后，利用酶聯(lián)免疫檢測儀在波長490 nm處測量OD值(辛培成等，2011)。抑制率的計算公式為：抑制率(%)=1-[(藥物組OD值-空白對照OD值)/(無藥對照組OD值-空白對照組OD值)]×100

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS 18.0進行單因素方差分析(One way ANOVA)，試驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(X±s)表示，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 Bradford法分析測定九香蟲血淋巴蛋白質(zhì)含量

配置牛血清蛋白(BSA)標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.5 mg/mL，按濃度0、0.025、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL分別加到96孔板中，在595 nm下用酶聯(lián)免疫檢測儀測定各標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度，重復(fù)3次，計算平均值(見表1)。

以平均吸光度(Y)對牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)品含量(X)進行線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線(見圖1)：Y=1.2348X+0.6240，r=0.9827(n=7)

表1 不同濃度BSA標(biāo)準(zhǔn)品吸光度

圖1 牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線譜圖Fig.1 Standard curve of BSA

在同一塊酶標(biāo)板上測定標(biāo)準(zhǔn)品及九香蟲樣品的吸光度(測定時間在1 h內(nèi)完成)。九香蟲血淋巴平行3份，每次試驗結(jié)果測定3次，計算9次吸光度的平均值為樣品最終測量值。參照標(biāo)準(zhǔn)曲線，由平均吸光度計算樣品含蛋白質(zhì)濃度(見表2)。

表2 九香蟲血淋巴吸光度及蛋白質(zhì)含量

Bradford法檢測蛋白質(zhì)靈敏度高，檢測下限可達25 μg/mL(李海玲等，2008)，蛋白質(zhì)與Bradford試劑反應(yīng)顏色變化明顯，顏色深淺與蛋白質(zhì)含量在一定范圍內(nèi)呈正相關(guān)，結(jié)合酶聯(lián)免疫檢測儀測定可以快速檢測樣品中含有的蛋白質(zhì)，可為后續(xù)實驗中蛋白含量提供可靠依據(jù)。

2.2 CCK-8法檢測九香蟲血淋巴對MCF-7的抑制作用

2.2.1 作用于人乳腺癌MCF-7的九香蟲血淋巴濃度

由Bradford法測出九香蟲血淋巴蛋白含量，計算作用于人乳腺癌MCF-7的九香蟲血淋巴濃度分別為：0.82 mg/L,4.09 mg/L,8.17 mg/L,12.26 mg/L。

2.2.2 CCK-8法檢測結(jié)果

結(jié)果表明，0.82、4.09、8.17、12.26 mg/L 的九香蟲血淋巴與陰性對照組相比有顯著性差異(P<0.05)，表明其對MCF-7細(xì)胞生長具有顯著的抑制作用。相同時間不同濃度的血淋巴對MCF-7細(xì)胞的抑制率與對照組比較，差異顯著(P<0.05)。不同時間相同濃度的血淋巴對MCF-7細(xì)胞的抑制率與對照組比較，差異達到顯著水平(P<0.05)，且各濃度組對MCF-7細(xì)胞的抑制率大體隨濃度的增大、時間的延長而增高，呈時間、劑量依賴關(guān)系(見表3)。

2.2.3 九香蟲血淋巴對MCF-7細(xì)胞的影響

由圖2可知：九香蟲血淋巴對乳腺癌MCF-7細(xì)胞具有明顯的抑制作用。處理時間在12-24 h時，九香蟲血淋巴濃度的改變對MCF-7細(xì)胞的抑制率具有很大的影響；處理時間為24-48 h時，九香蟲血淋巴濃度分別為8.17 mg/mL與12.26 mg/mL，抑制率增加的幅度明顯減弱；在處理時間增至48 h后，九香蟲血淋巴濃度為8.17 mg/mL與濃度12.26 mg/mL對MCF-7細(xì)胞的影響相對持平，此時九香蟲血淋巴濃度的增加對MCF-7細(xì)胞的抑制率并不明顯，表示這樣的處理條件下，MCF-7細(xì)胞的抑制作用并不會再因血淋巴濃度的增加而增加。因此僅在一定的處理時間及九香蟲血淋巴濃度范圍內(nèi)，對MCF-7細(xì)胞的抑制作用隨著血淋巴的濃度及處理時間的增加而增強。

表3 不同濃度九香蟲血淋巴作用12 h、24 h、48 h對人乳腺癌MCF-7增殖的影響

圖2 九香蟲血淋巴作用12 h、24 h、48 h對MCF-7細(xì)胞增殖的抑制作用Fig.2 Inhibitory effects of haemolymph from Aspongopus chinensis on proliferation of human breast cancer MCF-7 for 12,24,48 h

3 結(jié)論與討論

據(jù)統(tǒng)計，中國城市人口中乳腺癌占女性惡性腫瘤之首(Zhengetal., 2010；Ferlayetal., 2010)。因此，尋找高效、低毒、安全的抗乳腺癌藥物成為緊迫而現(xiàn)實的問題。研究表明九香蟲對某些種類的腫瘤和癌癥亦有良好的治療效果，但多以干蟲或冷凍干燥后的血淋巴為原料(范欽，2011；檀軍等，2013)。本實驗以保證九香蟲血淋巴最高活性為前提，通過Bradford法檢測九香蟲蛋白含量，以蛋白質(zhì)含量為指標(biāo)，計算出各處理組九香蟲血淋巴的濃度。但目前常用于檢測細(xì)胞活性的MTT法，需要使用DMSO等裂解液溶解甲贊晶體，因此可能遇到顆粒不完全溶解以及吸取上清的操作中也可能帶走部分細(xì)胞等問題，導(dǎo)致所測結(jié)果穩(wěn)定性不佳等情況。所以本實驗將處于對數(shù)生長期的MCF-7細(xì)胞以不同濃度的九香蟲血淋巴處理后，應(yīng)用CCK-8比色法檢測 OD 值，計算抑制率；檢測出九香蟲血淋巴對人乳腺癌MCF-7細(xì)胞的體外增殖具有抑制作用，且在濃度為0.82、4.09、8.17、12.26 mg/L時呈時間和濃度依賴。

九香蟲作為一種傳統(tǒng)中藥，對其抗菌作用的研究較多(吳瑪莉和金道超，2005；趙柏松等，2011；李尚偉等，2015)，但其抗癌活性的研究較少。目前主要有兩種研究方法，第一種是利用九香蟲的提取溶劑進行抗癌活性檢測，主要材料為九香蟲干蟲，提取方法包括有侯曉暉等(2012， 2013)使用的冷浸法得到的九香蟲三氯甲烷浸提物和乙醇粗提物；于聲等(2015)使用傳統(tǒng)的水煎服藥方式收集九香蟲水提液，分別采用MTT法檢測胃癌SGC-7901、肝癌HepG2細(xì)胞活性。第二種是檀軍等(2013)直接利用九香蟲活蟲體內(nèi)血淋巴，采用冷凍干燥等方法后加入癌細(xì)胞中，利用形態(tài)觀察法及臺盼藍(lán)法檢測九香蟲血淋巴對胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖影響。而以上實驗表明，多種方法處理九香蟲后，所得溶劑都具有一定抗癌活性，因此本實驗結(jié)合兩種研究方法，直接將Bradford法測得血淋巴蛋白含量后的血淋巴作用于目前高發(fā)的乳腺癌細(xì)胞內(nèi)，采用比MTT法更精確的CCK-8法檢測九香蟲血淋巴抗癌活性，最后證明九香蟲血淋巴對乳腺癌MCF-7具有明顯的抑制作用。

本研究檢測出九香蟲血淋巴對人乳腺癌細(xì)胞具有明顯的抑制作用后，可從兩方面進行后續(xù)研究。一是檢測九香蟲血淋巴是否會誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，進而可研究九香蟲血淋巴作為抗腫瘤藥物誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡過程中的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制，為開發(fā)中藥治療腫瘤提供參考依據(jù)。二是針對其抗癌活性進行九香蟲血淋巴的分離純化，進一步得出九香蟲血淋巴抗癌的具體活性成分，為后續(xù)藥品產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供可靠支撐。

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The inhibitory effect of haemolymph fromAspongopuschinensisDallas on growth of human breast cancer MCF-7 by CCK-8

YANG Jia-Qi1, TAN Jun2, CAO Mi-Lan1, JIN Dao-Chao1, GUO Jian-Jun1*

(1. Institute of Entomology, Guizhou University, The Provincial Key Laboratory for Agricultural Pest Management of Mountainous Region, Guiyang 550025, China; 2. Zunyi Medical College, Zunyi 563099, Guizhou Province, China)

To clear the inhibitory effect on human breast cancer cell line MCF-7 by the haemolymph fromAspongopuschinensisDallas, 1851, Bradford method was used to test the concentrations of the haemolymph fromA.chinensis, the MCF-7 cells cultured in vitro were treated by different concentrations of the haemolymph, and at last the inhibition rates to MCF-7 cells were detected by CCK-8 method. The results showed that the haemolymph fromA.chinensiscould inhibit proliferation of human breast cancer MCF-7 cellsinvitrowith dosage- and time-dependent effects.

AspongopuschinensisDallas; haemolymph; breast cancer; CCK-8

國家自然科學(xué)基金(81360612)；貴州省科學(xué)基金省校聯(lián)合項目(黔科合LH字[2014]7650)；貴州省優(yōu)秀青年科技人才培養(yǎng)對象專項資金項目(黔科合人字[2015]25號)；貴州省科技廳創(chuàng)新人才團隊建設(shè)項目(黔科合人才團隊[2014]4001號)

楊佳琪，女，1992年生，碩士研究生，研究方向為資源昆蟲學(xué)

*通訊作者Author for correspondence，E-mail: jjguo@gzu.edu.cn

Received：2016-05-28； 接受日期Accepted: 2016-10-08

Q965.9;R273

A

1674-0858(2017)01-0193-06

楊佳琪，檀軍，曹米蘭，等.CCK-8法檢測九香蟲血淋巴對人乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖的抑制作用[J].環(huán)境昆蟲學(xué)報，2017,39(1):193-197.