黃立+宋振濤+朱明軍

摘要：辣蓼是一種傳統(tǒng)的中藥材，來源廣泛，具有消炎、鎮(zhèn)痛和抗氧化等多種生物活性。使用混料試驗和正交試驗聯(lián)合的方式進行了辣蓼飼料添加劑的生產(chǎn)工藝優(yōu)化，混料試驗用于優(yōu)化麥糟、辣蓼和木薯渣的物料配比，正交試驗用于優(yōu)化黑曲霉、釀酒酵母和枯草芽孢桿菌的接種配比。結(jié)果表明，混料試驗待優(yōu)化變量的方差分析均極顯著，R2和調(diào)整R2均超過90%，模型擬合優(yōu)秀。選擇黃酮含量2.75 mg/g、總酚含量3 mg/g、蛋白質(zhì)含量28%和蛋白質(zhì)增量40%作為多重響應(yīng)的臨界條件，得到滿足條件的物料配比為麥糟 ∶辣蓼 ∶木薯渣=59 ∶10 ∶31。正交試驗的單一效應(yīng)不顯著，使用總數(shù)據(jù)趨勢進行結(jié)果分析，得出最佳接種配比為黑曲霉 ∶釀酒酵母 ∶枯草芽孢桿菌=10 ∶10 ∶2，此外除了 2 ∶10 ∶2 接種配比外，其他均達到混料試驗的預(yù)測結(jié)果，完好地驗證了混料試驗的有效性。最后的驗證試驗結(jié)果表明聯(lián)合試驗設(shè)計合理可行。

關(guān)鍵詞：辣蓼；混料試驗；混合發(fā)酵；固態(tài)發(fā)酵；單細胞蛋白；生產(chǎn)工藝

中圖分類號： S188+.4 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）11-0272-05

辣蓼（Polygonum hydropiper Linn.）為一年生草本植物，是中國傳統(tǒng)中藥材?，F(xiàn)代研究表明，辣蓼具有消炎、鎮(zhèn)痛和抗氧化等功效[1-2]。傳統(tǒng)中藥的使用方法常常是熱水煎煮法或者直接入藥，具有吸收差、有效成分損耗的缺點，而使用現(xiàn)代化的方法（如生物發(fā)酵等溫和的方式）對辣蓼等傳統(tǒng)中藥材進行新型研究和開發(fā)，將可以很好地彌補這些缺點。

隨著世界人口的快速增長，世界食物的供需關(guān)系會出現(xiàn)嚴重的不平衡，因此開發(fā)一種廉價而又生產(chǎn)速率快的蛋白質(zhì)食品就顯得更加緊迫，而單細胞（single cell protein）由于具有營養(yǎng)豐富、原料廣泛廉價和生產(chǎn)速率高等優(yōu)點，可以很好地解決這個問題?，F(xiàn)代單細胞蛋白生產(chǎn)的研究熱點是在工農(nóng)業(yè)廢物方面，如廢棄檸檬果肉和工業(yè)廢棄甘油等[3-4]，此舉不但可以減少環(huán)境污染，而且還變廢為寶，可以獲得營養(yǎng)收益。

微生物在自然界的生長是一種天然的多菌混合狀態(tài)，不同菌株之間促進和拮抗作用并存，最后演變?yōu)榉€(wěn)定的微生物群落。而混菌發(fā)酵（mixed fermentation）就是模擬這種微生物群落的天然生長狀態(tài)并加以改良，再綜合考慮微生物之間的營養(yǎng)和代謝特性，經(jīng)過人工仔細挑選之后，削弱菌株之間的拮抗作用，而加強菌株之間的互利作用，從而獲得微生物發(fā)酵的更大收益。Fang等使用里氏木霉和黑曲霉混合發(fā)酵的方式進行纖維素酶生產(chǎn)，在優(yōu)化了菌種配比和延遲接種之后，獲得了最大濾紙酶活（FPA）和非常高的β-葡萄糖苷酶活，是所有試驗組中最好的纖維素酶活配比[5]。Li等使用黑曲霉和熱帶假絲酵母混菌發(fā)酵中藥水飛薊工業(yè)廢棄物來生產(chǎn)飼料添加劑，相比較未發(fā)酵物料，粗蛋白含量提升了79.85%，活性成分總黃酮、水飛薊素分別是未發(fā)酵物料的2.42、1.63倍[6]。

隨著現(xiàn)代研究的發(fā)展，試驗設(shè)計如析因設(shè)計、正交試驗、Plackett-Burman試驗、響應(yīng)面試驗等越來越被研究者所重視。而聯(lián)合試驗設(shè)計也因其省時高效的優(yōu)點受到研究者的青睞，在如今的研究中，Plackett-Burman試驗+響應(yīng)面試驗是一種非常常見的試驗設(shè)計[7-8]，但是廣義的聯(lián)合試驗設(shè)計遠不止如此，根據(jù)不同的研究目的，選用不同的聯(lián)合試驗設(shè)計，將可以極大地節(jié)省試驗次數(shù)，同時獲得很好的試驗優(yōu)化結(jié)果。

本研究將根據(jù)發(fā)酵優(yōu)化的需要，選用混料試驗+正交試驗的聯(lián)合試驗設(shè)計，對辣蓼混菌發(fā)酵生產(chǎn)飼料添加劑進行探索，也為廣義的聯(lián)合試驗設(shè)計起到借鑒作用。

1 材料與方法

1.1 辣蓼、木薯渣和麥糟

辣蓼由廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所提供，高速萬能粉碎機（FW 100型，天津泰斯特儀器有限公司）磨碎過200目篩，密封袋包裝于室溫下存放。

木薯渣來自于廣西武鳴安寧淀粉責任有限公司，50 ℃烘干至恒質(zhì)量，高速萬能粉碎機磨碎過40目篩，-20 ℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

麥糟來自于廣州珠江啤酒集團有限公司，50 ℃烘干至恒質(zhì)量，高速萬能粉碎機磨碎過100目篩，-20 ℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 菌種

釀酒酵母GIM2.121購買自廣東省微生物菌種保藏中心（GIMCC），作為單細胞蛋白生產(chǎn)菌。

黑曲霉GIM3.25購買自廣東省微生物菌種保藏中心（GIMCC），分離自酒曲中，具有很強的糖化能力。

枯草芽孢桿菌DES-59由華南理工生物科學(xué)與工程學(xué)院發(fā)酵工程研究室保藏，經(jīng)過紫外和化學(xué)聯(lián)合誘變，高產(chǎn)蛋白酶。

黑曲霉-80 ℃甘油孢子懸液保存。取-80 ℃種子，PDA平板劃線，30 ℃靜止培養(yǎng)5 d；之后取孢子轉(zhuǎn)接至PDA平板，30 ℃靜止培養(yǎng)5 d，10 mL 0.1%吐溫80洗孢子，調(diào)孢子濃度為105個/mL，即是黑曲霉二級種子液。

釀酒酵母YPD斜面4 ℃保存。取斜面種子1環(huán)，接種于YPD液體培養(yǎng)基，30 ℃ 180 r/min振蕩培養(yǎng)12 h即得一級種子液；取一級種子液10%（體積分數(shù)）接種量接種于YPD液體培養(yǎng)基，30 ℃ 180 r/min振蕩培養(yǎng)12 h即得釀酒酵母二級種子液。

枯草芽孢桿菌LB斜面4 ℃保存。取斜面種子1環(huán)，接種于LB液體培養(yǎng)基，30 ℃ 180 r/min振蕩培養(yǎng)12 h即得一級種子液；取一級種子液10%（體積分數(shù)）接種量接種于LB液體培養(yǎng)基，30 ℃ 180 r/min振蕩培養(yǎng)8 h即得枯草芽孢桿菌二級種子液。

1.3 混料試驗

混料試驗設(shè)計使用3因素擴大的單純形重心混料試驗設(shè)計[9]。

固態(tài)發(fā)酵參考Li等的方法[6]，根據(jù)試驗設(shè)計表（表1），計算相應(yīng)的麥糟、辣蓼和木薯渣質(zhì)量，體系為5 g，準確稱量置于150 mL三角瓶中。稱量0.05 g/g碳酸鈣粉末以中和木薯渣的酸性成分，最終pH值5.0。加入1 mL營養(yǎng)鹽溶液，其成分為50 g/L葡萄糖、75 g/L尿素、25 g/L磷酸二氫鉀（最終含量為1%葡萄糖、1.5%尿素、0.5%磷酸二氫鉀）。調(diào)水分為60%，120 ℃滅菌20 min。取黑曲霉、釀酒酵母和枯草芽孢桿菌種子液等比例混合（1 ∶1 ∶1），無菌條件下接種混合種子液，接種量為30%。于恒溫恒濕培養(yǎng)箱中，30 ℃靜止培養(yǎng) 96 h。

發(fā)酵結(jié)束后，于三角瓶中加入50 mL蒸餾水，30 ℃ 180 r/min 振蕩提取黃酮1 h，100 mL離心管5 000 r/min離心10 min。上清液2層濾紙抽濾，濾液定容至80 mL，進行總酚、黃酮含量測定。離心沉淀和濾渣合并，置于稱量瓶中，105 ℃烘干至恒質(zhì)量，測定蛋白質(zhì)含量。

1.4 正交試驗

正交試驗使用3因素2水平正交試驗表（表2）。

在選定的最佳混料配比之下，作不同混菌配比的混菌固態(tài)發(fā)酵試驗發(fā)酵體系為5.0 g，其中麥糟2.95 g、辣蓼0.05 g、木薯渣1.55 g，稱量0.05 g/g碳酸鈣粉末以中和木薯渣的酸性成分，最終pH值5.0。加入1mL營養(yǎng)鹽溶液，其成分為50 g/L 葡萄糖、75 g/L尿素、25 g/L磷酸二氫鉀。調(diào)水分含量為60%，120 ℃滅菌20 min。取黑曲霉、釀酒酵母和枯草芽孢桿菌的種子液，不做混合，根據(jù)正交試驗設(shè)計表，依次接種三者，最后無菌條件下將發(fā)酵基質(zhì)混勻。于恒溫恒濕培養(yǎng)箱中，30 ℃靜止培養(yǎng)96 h。

發(fā)酵完成后，測定黃酮含量、總酚含量和蛋白質(zhì)含量，操作同混料試驗。

1.5 驗證試驗

在完成上述試驗后，綜合試驗結(jié)果得出最佳的試驗方案，然后使用驗證試驗對其可行性和有效性進行驗證。準確稱量麥糟2.95 g、辣蓼0.05 g、木薯渣1.55 g，體系為5 g，置于 150 mL 三角瓶中。稱量0.05 g/g碳酸鈣粉末以中和木薯渣的酸性成分，最終pH值5.0。加入1 mL營養(yǎng)鹽溶液，其成分為50 g/L葡萄糖、75 g/L尿素、25 g/L磷酸二氫鉀（最終含量為1%葡萄糖、1.5%尿素、0.5%磷酸二氫鉀）。調(diào)水分含量為60%，120 ℃滅菌20 min。取黑曲霉、釀酒酵母、枯草芽孢桿菌的種子液，接種量分別為10%、10%、2%，置于恒溫恒濕培養(yǎng)箱中，30 ℃靜止培養(yǎng)96 h，3個重復(fù)。同時作空白對照試驗，不接種種子液，使用無菌水補全，其他操作同上。發(fā)酵完成后，測定黃酮含量、總酚含量和蛋白質(zhì)含量，操作同混料試驗。

1.6 參數(shù)測定及結(jié)果分析

黃酮測定參考張國英的方法[10]；總酚測定使用Folin-Ciocalteu法[11]；蛋白質(zhì)含量測定使用凱氏定氮法。

試驗設(shè)計及結(jié)果分析使用Design expert 8.0，分析方法均使用方差分析。統(tǒng)計分析使用Minitab 16.0。

2 結(jié)果與分析

2.1 混料試驗優(yōu)化物料配比

在無法預(yù)先知道最佳物料配比的試驗條件下，使用混料試驗往往可以非常迅速地獲得所有物料配比下的響應(yīng)變量的變化規(guī)律?；炝显囼炇菫榱苏页鳆溤?、辣蓼和木薯渣三者的最佳混料配比，使用總酚含量、黃酮含量、蛋白質(zhì)含量和蛋白質(zhì)增量作為響應(yīng)變量，測定結(jié)果如表1所示。

方差分析結(jié)果為總酚含量模型顯著性0.000 3，黃酮含量模型顯著性0.000 1，蛋白質(zhì)含量模型顯著性0.000 1，蛋白質(zhì)增量模型顯著性0.000 1，均是極顯著，且四者的失擬項均不顯著，這表明擬合模型具備統(tǒng)計學(xué)意義，系統(tǒng)誤差很小。4個模型的R2和調(diào)整R2均超過90%，表明模型擬合優(yōu)秀。

圖1為四者的等高線圖，從總酚含量等高線圖（圖1-a）可以看出，在麥糟含量較低水平和木薯渣含量較高水平的條件下，總酚含量較低，含量低于2 mg/g；在麥糟高水平的條件下，總酚含量最高，超過4 mg/g。該結(jié)論和Meneses等的結(jié)論[12]相同，麥糟具較高的總酚含量，80%甲醇提取可以獲得6.46 mg/g的總酚含量。在辣蓼較高水平的條件下，其總酚含量介于以上兩者之間。這和辣蓼的主要活性成分有關(guān)，辣蓼具有高含量的黃酮成分[13]，黃酮是植物總酚成分中含量最大的一類物質(zhì)[12，14]。

從黃酮含量等高線圖（圖1-b）可以看出，在木薯渣含量較高的條件下，發(fā)酵產(chǎn)物黃酮含量較低，這和木薯渣的主要成分有關(guān)，木薯渣具有較高的淀粉含量，可達40.12%[15]，而不含黃酮成分。在麥糟或者辣蓼處于較高水平的條件下，黃酮含量處于較高水平，黃酮最高值可超過4 mg/g，其原因同總酚含量，麥糟和辣蓼具有較高的黃酮成分。

從蛋白質(zhì)含量等高線圖（圖1-c）可以看出，在所有的混料配比中，存在一個區(qū)域使得發(fā)酵產(chǎn)物出現(xiàn)最大蛋白質(zhì)含量，該區(qū)域為麥糟處于較高水平，而辣蓼和木薯渣的總和位于較低水平。這和配比中物料的具體功能有關(guān)，麥糟是一種固體發(fā)酵介質(zhì)，同麥麩一樣，它的加入可以保持固體發(fā)酵基質(zhì)的疏松性，保證發(fā)酵過程中的水分含量和通氣性能。而且麥糟的蛋白質(zhì)含量較高，可以作為氮源，保證發(fā)酵的順利進行。木薯渣的淀粉含量較高，它是發(fā)酵的碳源，必須保證木薯渣具有一定的含量，才能提高發(fā)酵程度，進而提高蛋白質(zhì)含量。在蛋白質(zhì)增量等高線圖（圖1-d）中，可以清楚地看出木薯渣在發(fā)酵過程中的作用，在木薯渣含量較高或者木薯渣和辣蓼總體含量較高的情況下，蛋白質(zhì)含量增加較高，最大發(fā)酵前后的蛋白質(zhì)增量超過60%。在僅具有麥糟的條件下，沒有蛋白質(zhì)增量，表明發(fā)酵無法進行，這和麥糟的成分有關(guān)，麥糟是啤酒工業(yè)糖化后的工業(yè)廢棄物，其碳源幾乎沒有，因此微生物無法直接利用進行生長發(fā)酵。

為了綜合協(xié)調(diào)總酚含量、黃酮含量、蛋白質(zhì)含量和蛋白質(zhì)增量的變化，使用重疊等高線法來解決多重響應(yīng)的問題，在Design expert中以黃酮2.75 mg/g、總酚3 mg/g、蛋白質(zhì)含量28%和蛋白質(zhì)增量40%為臨界等高線繪制重疊等高線，如圖2所示，其中的黑色區(qū)域為滿足黃酮含量超過2.75 mg/g、總酚含量超過3 mg/g、蛋白質(zhì)含量超過28%和蛋白質(zhì)增量超過40% 4個限定條件的混料配比值。最后根據(jù)Design expert的最優(yōu)計算， 選擇麥糟 ∶辣蓼 ∶木薯渣=59 ∶10 ∶31的配比為最優(yōu)條件。對于此優(yōu)化的結(jié)果，將于下述正交試驗中進行驗證。

3.2 正交試驗優(yōu)化菌種配比

在對混料配比進行優(yōu)化的基礎(chǔ)上，對菌種配比進行優(yōu)化。在混菌發(fā)酵中，為了綜合協(xié)調(diào)不同菌株的生長特點，進而盡最大化地提高發(fā)酵產(chǎn)物含量或者發(fā)酵效果，常常有2個策略[5]：（1）延遲接種：將特定的菌株延遲接種，從而至少保證其中1株菌在前期位于優(yōu)勢菌株地位；（2）菌株配比：將不同菌株的接種量根據(jù)需求進行調(diào)整，提高需要作為優(yōu)勢菌的菌株接種量，降低需要作為劣勢菌的菌株接種量。

本次試驗使用3因素2水平正交試驗表進行發(fā)酵菌株配比的優(yōu)化，試驗結(jié)果如表3所示。將黑曲霉、釀酒酵母和枯草芽孢桿菌分別設(shè)置在第1、2、4列，以區(qū)分主效應(yīng)和交互作用。相比較混料試驗優(yōu)化物料配比，之所以使用正交試驗來優(yōu)化接種配比的原因是接種配比對發(fā)酵結(jié)果的影響較為粗放，很難使用響應(yīng)面優(yōu)化或者混料試驗一樣的試驗設(shè)計方法來對接種配比進行精確的定量模型分析，而使用正交試驗的定性優(yōu)化在此時會更有意義。

根據(jù)Design Expert計算，總酚含量、黃酮含量和蛋白質(zhì)含量的模型均不顯著，不具備統(tǒng)計學(xué)效應(yīng)，因此不再衡量三者的主效應(yīng)和交互作用。由于正交試驗的試驗點分布均勻，此時可以使用總數(shù)據(jù)趨勢來對結(jié)果進行進一步衡量。正交試驗的總數(shù)據(jù)圖如圖3所示，以接種配比為橫坐標，總酚含量、黃酮含量和蛋白質(zhì)含量為縱坐標。從圖3中可見，除了黑曲霉 ∶釀酒酵母 ∶枯草芽孢桿菌為2 ∶10 ∶2之外，其他接種配比的黃酮、總酚、蛋白質(zhì)含量均超過了混料試驗的預(yù)測結(jié)果：黃酮含量在2.75 mg/g以上、總酚在3 mg/g以上、蛋白質(zhì)含量在28%以上，完好地驗證了混料試驗結(jié)果的正確性和有效性。接種配比在2 ∶10 ∶2處時，三者的數(shù)值明顯低于其他的接種配比，此時的總酚、黃酮、蛋白質(zhì)含量和其他配比

下的含量值差異明顯，這可能和發(fā)酵過程中的菌株相互作用有關(guān)，在初期釀酒酵母作為優(yōu)勢菌的情況下，釀酒酵母會迅速的利用可發(fā)酵糖，從而影響了枯草芽孢桿菌分泌淀粉酶和蛋白酶以及黑曲霉分泌纖維素酶、淀粉酶和糖化酶。根據(jù)正交試驗結(jié)果，在8個接種配比中，接種配比為 10 ∶10 ∶2 時，總酚、黃酮、蛋白質(zhì)含量最大，因此選擇 10 ∶10 ∶2 作為最優(yōu)的接種配比。

3.3 驗證試驗

根據(jù)混料試驗和正交試驗的結(jié)果，整合最后的最佳發(fā)酵條件，并在最佳的發(fā)酵條件下，設(shè)計驗證試驗驗證最佳發(fā)酵條件的可行性和有效性。圖4為驗證試驗各組的黃酮含量、總酚含量和蛋白質(zhì)含量，從圖中可以看出，驗證組的黃酮含量、總酚含量和蛋白質(zhì)含量分別為2.95 mg/g、3.48 mg/g、30.1%，相比較空白對照，黃酮含量提高了111.3%，總酚含量提高42.5%，蛋白質(zhì)含量提高了26.6%，表明發(fā)酵效果顯著，混料試驗和正交試驗的優(yōu)化結(jié)果具備實際意義，完好地驗證了聯(lián)合試驗設(shè)計思路的有效性和可行性。

3 結(jié)論

使用混料試驗對麥糟、辣蓼和木薯渣的物料配比進行了優(yōu)化，4個待優(yōu)化變量的模型擬合優(yōu)秀，并找到了滿足臨界條件黃酮2.75 mg/g、總酚3 mg/g、蛋白質(zhì)含量28%和蛋白質(zhì)增量40%的物料配比，其值為麥糟 ∶辣蓼 ∶木薯渣=59 ∶10 ∶31。正交試驗用于優(yōu)化接種配比，根據(jù)全數(shù)據(jù)變化趨勢，驗證了混料試驗結(jié)果的有效性和可行性，同時得出了最佳的物料配比為10 ∶10 ∶2。最后在選定的混料配比和接種配比下進行驗證試驗，試驗結(jié)果表明，聯(lián)合試驗設(shè)計合理可行，驗證了2個試驗設(shè)計所優(yōu)化的生產(chǎn)工藝的正確性。本試驗所研發(fā)的辣蓼飼料添加不僅為中藥的現(xiàn)代化研究做了探索，而且也為廣義試驗設(shè)計的運用做了新的嘗試。

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