劉鴿，范子儀，張培生，楊慧敏，屈勇剛

(石河子大學動物科技學院，石河子 832003）

隱性乳房炎患牛乳中病原菌的分離與鑒定

劉鴿，范子儀，張培生，楊慧敏，屈勇剛

(石河子大學動物科技學院，石河子 832003）

乳房炎是奶牛的一種常見性疾病，一般分為臨床型乳房炎和隱性乳房炎兩類。由于隱性乳房炎癥狀輕微，常被人們所忽視，不僅嚴重影響患牛的產(chǎn)奶量、乳品質(zhì)，推遲產(chǎn)后發(fā)情和妊娠時間，而且易在牛群中傳播，給奶牛業(yè)造成嚴重損失，同時牛奶品質(zhì)發(fā)生變化，還會危及人類健康。因此，積極預防控制奶牛隱性乳房炎的意義十分重大。本研究從隱性乳房炎患牛的乳汁中分離鑒定出沙雷氏菌、葡萄球菌和大腸桿菌，同時對隱性乳房炎患牛的乳汁進行了微生物多樣性分析，旨在為奶牛臨床型乳房炎及隱性乳房炎的防治提供理論基礎。

隱性乳房炎；分離鑒定；多樣性；防治

奶牛乳房炎是奶牛乳腺受到外界的綜合刺激（物理、化學、微生物方面）后而發(fā)生的一種炎性反應，是奶牛場中最常見、經(jīng)濟損失最為嚴重的疾病之一，幾乎每個牛場中都存在，其中半數(shù)以上為隱性乳房炎，是造成經(jīng)濟損失的主要原因。奶牛隱性乳房炎又稱亞臨床型乳房炎(Nonclinical or subclinical mastitis)，其特征是無可見的臨床癥狀，乳汁感官無可見變化，但乳汁在理化性質(zhì)、細菌學上已發(fā)生改變。由于隱性乳房炎的乳汁無肉眼可見異常變化，乳房不出現(xiàn)或僅輕微出現(xiàn)發(fā)熱、腫脹、疼痛等癥狀，所以常被人們所忽視，對奶牛業(yè)、乳品業(yè)的發(fā)展及消費者健康有著嚴重的危害[1]。

在奶牛場生產(chǎn)中，隱性乳房炎的感染率和發(fā)病率都比較高，是導致暴發(fā)臨床型乳房炎的最主要因素，給奶牛養(yǎng)殖企業(yè)造成的經(jīng)濟損失也最為明顯的，常是臨床型乳房炎損失的2倍，甚至更多。據(jù)報道，在美國，26.5%被淘汰奶?；加腥榉垦祝辉诜姨m、挪威和瑞典等國，因為乳房健康問題而被淘汰的奶牛分別占35%、19%和22%[2]。隱性乳房炎患牛的產(chǎn)奶量隨感染程度的加劇，乳汁中體細胞數(shù)量隨之增多[3]。根據(jù)感染程度不同，病牛每天可少產(chǎn)奶2～4kg[4]。據(jù)NMC（美國國家乳房炎委員會）報道[5]，隱性乳房炎患牛的每個感染乳區(qū)，在泌乳期少產(chǎn)奶636～773kg。細菌性致病因素常被分為兩大類：接觸傳染性病原微生物和環(huán)境性病原微生物。病原微生物主要包括無乳鏈球菌、停乳鏈球菌和金黃色葡萄球菌[6,7]。因此，通過對隱性乳房炎患牛乳汁中的細菌分離鑒定，確定引起奶牛隱性乳房炎主要的細菌種類，并對隱性乳房炎奶牛乳汁中微生物的多樣性進行分析，旨在為奶牛臨床型乳房炎及隱性乳房炎的防治提供一定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集

從石河子周邊某個規(guī)?；膛龅?8頭隱性乳房炎患牛乳房中采集18個乳樣，依次編號1～18。按照LMT的檢測標準取樣檢測，并按LMT的判定標準進行判定。選取LMT檢測陽性牛，無菌采集每個乳頭的奶樣品10mL，置無菌采樣瓶中加蓋密封后用冰袋冷凍保存。樣品帶回實驗室放-20℃冰箱保存?zhèn)溆?。?jīng)LMT普查、篩選，判斷隱性乳房炎陽性乳樣品，供實驗室細菌分離與鑒定。

1.1.2 試劑及培養(yǎng)基

蘭州奶牛乳房炎檢測試劑（LMT），營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（NA），三糖鐵斜面培養(yǎng)基，檸檬酸鹽培養(yǎng)基，甘露醇培養(yǎng)基。

1.2 方法

1.2.1 細菌富集

將采集的乳樣首先進行細菌富集：先搖勻乳樣，無菌取適量乳樣加入到滅菌普通營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，37℃搖床培養(yǎng)12h，觀察結(jié)果。

1.2.2 細菌的分離鑒定與純化

將富集的菌液分別在普通瓊脂平板培養(yǎng)基上劃線接種，置37℃溫箱溫育24h，然后觀察菌落的形態(tài)，及時挑取具有典型特征的菌落進行涂片、革蘭氏染色、鏡檢。根據(jù)菌體形態(tài)和染色特性判定細菌的類屬，再經(jīng)純化培養(yǎng)，最后作出判斷。

1.2.3 細菌生化鑒定

待檢細菌經(jīng)分離培養(yǎng)后，分別進行甲基紅試驗（M.R），DNA酶試驗，接種三糖鐵斜面、檸檬酸鹽、吲哚、V-P、甘露醇、葡萄糖、乳糖、麥芽糖和蔗糖培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)12～48h，觀察試驗結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 菌株富集

從采集的18份乳樣中分別取適量乳樣加入到已滅菌的普通營養(yǎng)肉湯中進行細菌富集，如圖1所示。

圖1 細菌富集

2.2 菌株分離鑒定與純化

菌液經(jīng)12h搖床培養(yǎng)后，在普通瓊脂培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，分離菌株形成三種不同形態(tài)的菌落。第一種菌落呈紅色，不透明，邊緣圓整，表面光滑、隆起呈金屬光澤，色素不擴散到培養(yǎng)基中，及直徑為1.0～1.5mm（圖2）；涂片、革蘭氏染色鏡檢，可見革蘭氏陰性、紅色、兩端鈍圓的直桿狀菌（圖3）。第二種菌落為小圓形，邊緣整齊表面光滑，濕潤，有隆起，呈白色，不透明，直徑為1.0～2.0mm（圖4）；涂片、革蘭氏染色后鏡檢，可見革蘭氏陽性、紫色、圓形或卵圓形球菌（圖5）。第三種菌落是乳白色，圓形，菌落邊緣整齊，表面光滑，表面和背面顏色一致，半透明，有小凸起，直徑為1.0～1.5mm（圖6）；涂片、革蘭氏染色后鏡檢，可見革蘭氏陰性、紅色、兩端鈍圓的短桿狀菌（圖7）。

圖2

圖3

圖4

圖5

圖6

圖7

2.3 菌株生化鑒定

挑選第一種分離菌的8組菌株進行試驗。其中，8個組甲基紅（M.R）反應變?yōu)辄S色，呈陰性；7個組V-P反應變紅色呈陽性；7個組吲哚反應變?yōu)榧t色，為陽性；8個組可發(fā)酵并利用葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、甘露醇和檸檬酸鹽產(chǎn)酸，有的能產(chǎn)氣，7個組不能分解乳糖；8個組DNA酶試驗反應均為陽性。該試驗結(jié)果符合沙雷氏菌的生化鑒定特征。

挑選第二種分離菌的8組菌株進行試驗。8個組均可分解葡萄糖、麥芽糖，1個組不能分解乳糖、蔗糖和甘露醇；8個組在三糖鐵斜面產(chǎn)酸不產(chǎn)氣；7個組甲基紅（M.R）反應變?yōu)榧t色呈陽性；7個組V-P反應為紅色呈陽性；7個組DNA酶試驗反應為陽性。該試驗結(jié)果符合葡萄球菌的生化鑒定特征。

挑選第三種分離菌的8組菌株進行試驗。7個組在三糖鐵斜面能產(chǎn)氣、產(chǎn)酸，不生成硫化氫；8個組可分解乳糖、葡萄糖、麥芽糖和甘露醇，2個組不能分解蔗糖；7個組甲基紅（M.R）反應變?yōu)榧t色呈陽性；7個組V-P反應不變色為陰性；6個組吲哚反應變?yōu)榧t色為陽性；7個組檸檬酸鹽反應沒有發(fā)生變色現(xiàn)象，判為陰性。該試驗結(jié)果符合大腸桿菌的生化鑒定標準特征。

2.4 乳樣中病原菌的分布

表1 病原菌在各乳樣中的存在情況

樣品1～18中，只有8、12號樣品中含有大腸桿菌、沙雷氏菌和葡萄球菌中的一種菌；6、10和15號都含有大腸桿菌、沙雷氏菌和葡萄球菌，其余樣品含有大腸桿菌、沙雷氏菌和葡萄球菌中的兩種。大腸桿菌和葡萄球菌在各樣品中的檢出率均為77.78%（14/18)，沙雷氏菌的檢出率為50.00%（9/18）。

3 討論

本試驗從采集的乳樣中分離出了三種菌株，通過形態(tài)學觀察、生化特性分析對其進行鑒定，最終確定為大腸桿菌、沙雷氏菌和葡萄球菌。

試驗結(jié)果顯示，隱性乳房炎乳樣含有葡萄球菌、大腸桿菌和沙雷氏菌等多種細菌，奶牛乳房炎常由2～3種甚至3種以上的病原菌引起的。張玉玲[8]等人2014年從銀川市某規(guī)?；膛龅?0頭隱性乳房炎患牛的乳樣中檢出金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌、大腸桿菌。林源[9]等人研究發(fā)現(xiàn)，在隱性乳房炎患牛的乳樣中檢出金黃色葡萄球菌、凝固酶陰性葡萄球菌、無乳鏈球菌、犬鏈球菌、其他鏈球菌、大腸桿菌、牛棒狀桿菌。

在自然狀態(tài)下，乳房細胞在一定程度上能防御病原微生物的侵害[10]。但由于某些因素造成奶牛乳頭受損或在奶牛機體發(fā)生比較嚴重感染時，機體的防御平衡就會被打破，病原微生物就會趁機入侵，或原來寄居于乳房內(nèi)的條件性病原微生物開始活化，并大量增殖而使乳房致病。大多數(shù)奶牛場只重視臨床型乳房炎，只要發(fā)現(xiàn)就及時治療，但對隱性乳房炎的危害性認識不足。搞好奶牛乳房炎的防治工作是一項非常重要的長期工作，必須引起奶牛場工作人員的高度重視。

[1] 儲明星,石萬海,鄺霞,等.奶牛乳房炎與經(jīng)濟性狀之間的關(guān)系研究進展[J].中國畜牧雜志,2002,38(5):44-45.

[2] 李勇,葛秀國.奶牛隱性乳房炎研究進展[J].黃牛雜志,2003, 29:38-41.

[3] 魏學良,張家驊.重慶地區(qū)奶牛隱性乳房炎的調(diào)查[J].黃牛雜志,2003,(6):15-21.

[4] 李國江,鄒風馳.奶牛隱性乳房炎的監(jiān)測與評估[J].中國奶牛, 1998,(3):16-17.

[5] Lund T. F, Miglior. J. C. M Dekkers and E B, Burnside Genetic relationships between clinical mastitis， somatic cell count， and udder conformation in Danish Holsteins[J]. Livest Prod Sci, 1994, 39:243-251.

[6] 威廉.C.雷布漢.趙德明,沈建忠,譯.奶牛疾病學.第八版[M]. 北京:中國農(nóng)業(yè)大學出版社,1999,35-51.

[7] 王印魁. 奶牛隱性乳房炎的發(fā)病原因及綜合防制[J].中國乳業(yè),2007,11:53-56.

[8] 張玉玲,吳亞文,李志紅,等. 某規(guī)模奶牛場奶牛隱性乳房炎致病菌的檢測及藥敏試驗[J]. 黑龍江畜牧獸醫(yī),2015,8:99-100.

[9] 林源,何生虎,李生虎,等. 奶牛隱性乳房炎致病菌的微生物學鑒定[J]. 中國乳業(yè),2007,11:60-61.

[10] Riekerink R.G.M.O, Barkema H. W. Veenstra S.et al. Prevalence of contagious mastitis pathogen sinbulk tank milk in Prince Edward Island[J].Can.Vet.J.,2006,47:566-573.

Isolation and Identification of Pathogenic Bacteria of Mastitis in Milk

LIU Ge, FAN Zi-yi, ZHANG Pei-sheng, YANG Hui-min, QU Yong-gang
(College of animal science and technology, Shihezi University, Shihezi 832003)

Mastitis is a common disease of dairy cows which is generally divided into clinical mastitis and subclinical mastitis categories.Since the symptoms are mild subclinical mastitis and often been ignored, not only seriously affect the diseased cow,s milk production, milk quality, prolong postpartum estrus and pregnancy time, and easy to spread popular in the herd, causing serious losses to the dairy industry, at the same time the quality of the milk changes, but also endanger human health.Therefore, the active prevention and control of bovine subclinical mastitis is significance.In this study, Serratieae, Staphylococcus and Escherichia coli were punfied and iedentified from samples of subclinical mastitis cows milk and microbial diversity analysis of milk from subclinical mastitis cows was done. The result provide a theoretical basis for the cow mastitis and subclinical mastitis prevention.

Subclinical mastitis; Separation identification; Diversity; Prevention and Cure

S858.23

A

1004-4264（2017）02-0038-04

10.19305/j.cnki.11-3009/s.2017.02.010

2016-06-20

國家自然基金，“新疆北疆地區(qū)奶牛乳房中微生物多樣性及其功能分析”（編號：31560699)。

劉鴿（1986-），男，山東省淄博人，碩士研究生，主要從事動物傳染病診斷與防治工作。

屈勇剛（1971-），男，陜西省渭南人，副教授，主要從事動物傳染病診斷與防治工作，