黃敏，倪慶峰

（南通大學(xué)附屬醫(yī)院 普通外科，江蘇 南通 226000）

環(huán)境污染、遺傳以及無(wú)保護(hù)的輻射環(huán)境，均促進(jìn)了甲狀腺癌的發(fā)生，不同的甲狀腺癌病理類型來(lái)源與患者的手術(shù)方式以及預(yù)后轉(zhuǎn)歸具有重要的關(guān)聯(lián)。甲狀腺乳頭狀癌術(shù)后5年生存率較高，中位生存時(shí)間較長(zhǎng)，而未分化癌等分化較差的腫瘤其術(shù)后容易發(fā)生轉(zhuǎn)移、局部復(fù)發(fā)，進(jìn)而增加5年內(nèi)病死率。對(duì)于甲狀腺癌病因的研究以及預(yù)后探討有助于臨床上合理準(zhǔn)確評(píng)估患者術(shù)后臨床轉(zhuǎn)歸，并延長(zhǎng)生存時(shí)間[1-2]。第10號(hào)染色體缺失的磷酸酶和張力蛋白同源物基因（phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten，PTEN）的突變以及染色體交聯(lián)缺失可導(dǎo)致細(xì)胞正常周期調(diào)節(jié)異常，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生，而自噬相關(guān)基因Beclin-1對(duì)于細(xì)胞的生理性自噬過(guò)程起到重要的調(diào)節(jié)作用[3-5]。本研究重在探討B(tài)eclin-1、PTEN蛋白在甲狀腺癌中的表達(dá)變化及與患者臨床病理特征、預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取本院病理科2010年1月—2010年12月收集的術(shù)后確診甲狀腺癌患者的組織標(biāo)本79例（甲狀腺癌組）和因外科其他原因進(jìn)行甲狀腺活檢或手術(shù)采集的正常甲狀腺組織標(biāo)本40例（正常組）。甲狀腺癌組年齡31～74歲，平均年齡（41.7±11.2）歲；其中男28例，女51例；病理類型：乳頭狀癌18例，濾泡癌22例，髓樣癌20例，未分化癌19例；發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移36例；TNM分期：I期14例，II期20例，III期27例，IV期18例，腫瘤直徑：≥4 cm 30例，＜4 cm 49例。正常組年齡26～70歲，平均年齡（38.8±15.2）歲；其中男15例，女25例。兩組研究對(duì)象的年齡、性別構(gòu)成差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。

1.2 納入排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：⑴ 甲狀腺癌標(biāo)本來(lái)源于本院手術(shù)后標(biāo)本經(jīng)病理學(xué)證實(shí)的患者，正常甲狀腺組織來(lái)源于因外科原因手術(shù)或病理活檢證實(shí)的正常甲狀腺組織；⑵ 甲狀腺癌患者術(shù)前未接受放療、化療等其他治療措施；⑶ 兩組組織標(biāo)本研究對(duì)象的各項(xiàng)資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：⑴ 未經(jīng)證實(shí)的甲狀腺癌患者；⑵ 淋巴瘤等其他惡性腫瘤患者；⑶ 各項(xiàng)資料不完整，不能進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析及預(yù)后觀察的甲狀腺癌患者。

1.3 免疫組化方法

Beclin-1、PTEN蛋白表達(dá)情況采用SP法進(jìn)行檢測(cè)（選自2010年1月—2010年12月的連續(xù)病例），4%甲醛固定，具體操作按照免疫組化說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，石蠟固定脫水，檸檬酸進(jìn)行抗原修復(fù)，山羊一抗封閉孵育30 min，二抗采用小鼠抗體（一抗以及二抗均購(gòu)自Santa cruz公司），濃度稀釋按1:1 000進(jìn)行，用已知的陽(yáng)性切片作為陽(yáng)性對(duì)照，PBS作為陰性對(duì)照。

1.4 觀察標(biāo)準(zhǔn)

免疫組化結(jié)果判斷[5]：Beclin-1定位于細(xì)胞質(zhì)、PTEN蛋白定位于細(xì)胞核，陽(yáng)性著色表達(dá)呈黃色、棕黃色、褐色表達(dá)。根據(jù)著色強(qiáng)度：0分為無(wú)色，1分為淡黃色，2分為棕黃色，3分為褐色，黑色；根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞比例：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目所占比例＜5%為0分，陽(yáng)性細(xì)胞所占比例5%～25%為1分，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)＞25%～50%為2分，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)＞50%～75%為3分，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)所占比例＞75%為4分；兩種積分之和總分≤3分為陰性，＞3分為陽(yáng)性[4]。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)分析及統(tǒng)計(jì)在專業(yè)軟件SAS 9.0軟件包中處理，計(jì)量指標(biāo)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，計(jì)數(shù)資料采用百分率或構(gòu)成比（%）表示，比較采用χ2檢驗(yàn)；生存分析采用Kaplan-Meier法，生存時(shí)間比較采用Log-rank法；P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩組標(biāo)本中Beclin-1、PTEN蛋白的表達(dá)情況

甲狀腺癌組標(biāo)本中Beclin-1蛋白的陽(yáng)性率（31.7%）、PTEN蛋白陽(yáng)性率（29.1%）均低于正常組（87.5%、90.0%），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）（表1）。

2.2 Beclin-1、PTEN蛋白的表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系

甲狀腺癌組標(biāo)本中Beclin-1蛋白與PTEN蛋白的陽(yáng)性表達(dá)均與患者是否發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期有關(guān)（均P＜0.05），而與患者的年齡、性別、病理類型及腫瘤直徑大小無(wú)關(guān)（均P＞0.05）（表2）。

表1 兩組標(biāo)本中Beclin-1、PTEN蛋白的表達(dá)情況[n（%）]

表2 Beclin-1/PTEN蛋白的表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系[n（%）]

2.3 Beclin-1、PTEN蛋白與患者預(yù)后的關(guān)系

Beclin-1、PTEN蛋白陽(yáng)性表達(dá)的甲狀腺癌患者5年生存率均為100.0%，而陰性表達(dá)患者分別為87.0%和87.5%，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）（表3）；Beclin-1、PTEN蛋白陽(yáng)性表達(dá)的甲狀腺癌患者與其陰性表達(dá)患者的生存時(shí)間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）（圖1）。

表3 Beclin-1、PTEN蛋白與患者5年生存率的關(guān)系

圖1 患者術(shù)后生存曲線 A：不同Beclin-1蛋白表達(dá)狀態(tài)患者；B：不同PTEN蛋白表達(dá)狀態(tài)患者

3 討 論

甲狀腺癌是最常見(jiàn)的甲狀腺惡性腫瘤，約占全身惡性腫瘤的1%。除髓樣癌外，絕大部分甲狀腺癌起源于濾泡上皮細(xì)胞。早期臨床上可無(wú)特異性的表現(xiàn)，主要表現(xiàn)為一側(cè)甲狀腺葉或者峽部無(wú)痛性結(jié)節(jié)，可自行觸診或者體檢發(fā)現(xiàn)。對(duì)于非未分化型甲狀腺癌，主要采用手術(shù)切除的治療方式，切除的范圍根據(jù)術(shù)前的B超檢查以及全身性檢查決定，一般需要切除甲狀腺病變側(cè)葉以及峽部，同時(shí)切除對(duì)側(cè)甲狀腺組織并適當(dāng)進(jìn)行頸部淋巴結(jié)清掃[6-8]。甲狀腺雖然屬于惡性腫瘤，但其術(shù)后5年生存率多數(shù)可達(dá)60%以上，分化較好的甲狀腺乳頭狀癌術(shù)后生存時(shí)間較長(zhǎng)[9-11]。然而中晚期的甲狀腺癌以及未分化癌等病理類型的腫瘤，其手術(shù)治療的效果較差，術(shù)后5年內(nèi)復(fù)發(fā)率較高，同時(shí)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移以及淋巴結(jié)侵襲的幾率較高，如何早期診斷以及對(duì)于中晚期甲狀腺癌進(jìn)行可靠的預(yù)后評(píng)估隨訪，是普外科以及甲乳外科醫(yī)生重點(diǎn)關(guān)注的課題。Beclin-1、PTEN蛋白參與到了細(xì)胞遺傳基因的突變、細(xì)胞生理性自噬凋亡過(guò)程，已經(jīng)證實(shí)的是Beclin-1、PTEN蛋白顯著參與到了乳腺癌、肝癌以及結(jié)直腸癌等發(fā)病過(guò)程[12-14]，但其在甲狀腺癌發(fā)生發(fā)展以及疾病預(yù)后等方面的研究較少。

PTEN作為抑癌基因，在細(xì)胞凋亡、分化、周期調(diào)控以及增殖等方面發(fā)揮了重要的調(diào)節(jié)作用，并有研究[15-17]證實(shí)PTEN在部分內(nèi)分泌性腫瘤中可以促進(jìn)原位癌的侵襲以及淋巴結(jié)組織的破壞等過(guò)程。自噬過(guò)程為細(xì)胞內(nèi)溶酶體膜破裂后溶解自身細(xì)胞蛋白以及脂質(zhì)成分的過(guò)程，自噬過(guò)程的平衡對(duì)于維持細(xì)胞穩(wěn)定、抑制細(xì)胞過(guò)度增殖方面具有很重要作用。甲狀腺癌組標(biāo)本中Beclin-1、PTEN蛋白陽(yáng)性率均明顯高于正常甲狀腺組織，提示了兩者可能參與到了甲狀腺癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。免疫組化染色可見(jiàn)甲狀腺癌細(xì)胞異型性較高的部位，Beclin-1、PTEN的染色強(qiáng)度較強(qiáng)，染色相對(duì)均一，同時(shí)Beclin-1、PTEN在甲狀腺癌脈管周邊的分布較少，SP染色強(qiáng)度較弱，提示了其可能影響到了淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移這一病理過(guò)程。甲狀腺癌組標(biāo)本中Beclin-1、PTEN蛋白的陽(yáng)性率表達(dá)與患者是否發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期及腫瘤直徑大小具有顯著的關(guān)系，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的增多以及侵襲破壞的增強(qiáng)，抑癌基因的表達(dá)明顯受到抑制。仲崇威等[18-19]研究認(rèn)為，甲狀腺癌發(fā)生過(guò)程中PI3K、MAPK信號(hào)通路的激活可以顯著抑制Beclin-1、PTEN轉(zhuǎn)錄基因的表達(dá)，減少mRNA的翻譯表達(dá)。Beclin-1基因的轉(zhuǎn)錄翻譯的下降，降低了甲狀腺異常增殖細(xì)胞的自噬反應(yīng)能力，減輕了對(duì)于自噬性腫瘤細(xì)胞死亡的誘導(dǎo)分化能，從而促進(jìn)甲狀腺腫瘤的增殖和對(duì)于基底膜的突破作用。而PTEN基因突變后誘導(dǎo)Akt/Notch/cyc通路的激活，繼而促進(jìn)其對(duì)于細(xì)胞周期的促增殖效應(yīng)，同時(shí)其可抑制甲狀腺細(xì)胞的自噬作用，體現(xiàn)出兩者的協(xié)同作用效應(yīng)。但本研究并未發(fā)現(xiàn)不同病理類型甲狀腺癌組織中Beclin-1、PTEN表達(dá)的差異，一方面考慮兩者在不同上皮來(lái)源的甲狀腺組織中恒定表達(dá)，表現(xiàn)為“管家基因”的效應(yīng)[20-22]，另一方面考慮本研究的納入病例數(shù)量有限，相關(guān)仍然需要進(jìn)一步證實(shí)。最后本研究初步探討了Beclin-1、PTEN蛋白與患者預(yù)后的關(guān)系，Beclin-1、PTEN蛋白陽(yáng)性表達(dá)的甲狀腺癌患者5年生存率較高，但并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

Beclin-1、PTEN蛋白表達(dá)下調(diào)與甲狀腺癌的發(fā)生發(fā)展具有一定的關(guān)系，兩者的聯(lián)合檢測(cè)對(duì)于評(píng)估甲狀腺癌的侵襲、轉(zhuǎn)移以及分化等病理過(guò)程具有一定的臨床價(jià)值。通過(guò)進(jìn)一步探討其基因突變以及細(xì)胞周期調(diào)控機(jī)制，有利于為臨床上甲狀腺癌的生物分子學(xué)治療提供理論依據(jù)。

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