黃浴日 向凱樂 饒立榮

邵陽學(xué)院 湖南省邵陽市 422000

肺炎支原體滲透壓誘導(dǎo)蛋白C的分子生物克隆及生物活性分析

黃浴日 向凱樂 饒立榮

邵陽學(xué)院 湖南省邵陽市 422000

目的：用生物克隆的方法表達(dá)肺炎支原體（Mycoplasmsa pneamoniae, Mp）滲透壓誘導(dǎo)蛋白C（Osmotically inducible protein C, OsmC）并測定其生物活性活性。方法：根據(jù)Mp的OsmC基因序列設(shè)計特定引物，PCR擴(kuò)增OsmC基因。通過構(gòu)建重組質(zhì)粒pET28a-MpOsmC，并轉(zhuǎn)化入大腸埃希菌BL21（DE3），來誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá)。我們采用鎳柱親和層析法對OsmC蛋白進(jìn)行純化，再用氧化鐵二甲酚橙試劑（FOX）測定OsmC蛋白的活性。結(jié)果：我們用生物克隆的方法得到Mp的OsmC基因片段，并成功構(gòu)建重組質(zhì)粒pET28a-MpOsmC。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸埃希菌BL21(DE3)后經(jīng)過表達(dá)我們得到重組Mp OsmC蛋白，再經(jīng)親和層析得到高純度的目的蛋白，且具有分解H2O2的活性。結(jié)論：重組Mp OsmC蛋白具有過氧化物酶的活性，為研究肺炎支原體的抗氧化機(jī)制提供了理論依據(jù)。

肺炎支原體；滲透壓誘導(dǎo)蛋白C；分子克隆；分子活性

支原體是自然界中存在的最小的原核生物。這些無壁的，可塑的生物可以通過細(xì)胞過濾器，并在體外在無細(xì)胞條件下生長和繁殖。肺炎支原體（Mycoplasmsa pneamoniae, Mp）是被檢出最多的支原體，除了引起非典型肺炎和社區(qū)獲得性肺炎等主要呼吸道癥狀外，肺炎支原體還可能引起血液，心血管系統(tǒng)，胃腸道和皮膚中的自身免疫性溶血性貧血和其他疾病，并可誘發(fā)心包炎，心肌炎，腎炎和腦膜炎。肺炎支原體的致病作用與其產(chǎn)生超氧自由基有關(guān)，超氧自由基可以抑制宿主細(xì)胞過氧化氫酶，從而增加自由基損傷的作用。現(xiàn)有研究表明肺炎支原體表達(dá)的滲透壓誘導(dǎo)蛋 白 C（Osmotically inducible protein C, OsmC）被認(rèn)為有抗氧化的作用，可以緩解自由基帶來的損傷作用。本研究通過克隆并純化得到OsmC重組蛋白，并證明OsmC的抗氧化作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種和質(zhì)粒

Mp標(biāo)準(zhǔn)株M129(ATCC 29342)由南華大學(xué)病原生物學(xué)研究所保存；大腸桿菌BL21(DE3) 和 Top10; 表達(dá)質(zhì)粒pET28a由邵陽學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗學(xué)院保存。

1.1.2 試劑與材料

細(xì)菌DNA提取試劑盒、Taq酶、Reaction Buffer、dNTP、 蛋 白 Marker、DNA Marker、質(zhì)粒DNA提取試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒、T4連接酶購自Takara公司；限制性內(nèi)切酶EcoR I、XhoI由本實驗室提供； Ni2+親和層析柱購買自美國GE公司；IPTG，卡那霉素，SDS，丙烯酰胺等化學(xué)試劑購自上海生工生物公司；蛋白胨和酵母提取物購自英國Oxiod公司。

1.2 方法

1.2.1 Mp OsmC基因的信息學(xué)分析

用 Blast軟件篩選Mp OsmC基 因(accession number: WP_012697836) 的 編碼序列，利用Clustal軟件將Mp OsmC蛋 白 與 大 腸 桿 菌 (E.coli， accession number WP_000152320)、結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，accession number:GAA46570.1）、 生 殖 支 原 體（Mycoplasma Genitalium，accession number: WP _009885605）) 和根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens，At，accession number: WP_010971192.1) 的OsmC蛋白序列進(jìn)行同源性分析。

1.2.2 OsmC基因的擴(kuò)增

根 據(jù) 軟 件 primer 5.0設(shè)計 OsmC 的 上 游 引 物 FP : 5'AACATATGAAGGCAAGGCTCAAGCA 3'，下游引物RP：5'CCAAGCTTTCATTC CACTTCAATCAGGCTGA 3'，由華大基因合成；培養(yǎng)Mp，提取Mp基因組DNA，以此為模板PCR擴(kuò)增OsmC基因。PCR反應(yīng)條件：95℃ 5min; 94℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 1min,共35個循環(huán)；72℃ 7min。PCR產(chǎn)物經(jīng)過1%瓊脂糖凝膠電泳后回收目的片段。

1.2.3 構(gòu)建pET28a-MpOsmC載體

分別用EcoR I、XhoI內(nèi)切酶將OsmC基因和pET28a進(jìn)行雙酶切，再用T4連接酶在16℃時將剪切片段進(jìn)行連接，再用轉(zhuǎn)染的方法將連接好的片段轉(zhuǎn)進(jìn)大腸桿菌Top10。

1.2.4 過氧化物還原酶的表達(dá)與純化

將質(zhì)粒pET28a-MpOsmC轉(zhuǎn)化大腸埃希菌BL21(DE3)，經(jīng)過培養(yǎng)后挑取單個菌落接種于LB培養(yǎng)基，恒溫?fù)u床上培養(yǎng)過夜。然后按照 1: 100 的體積比接種到新鮮LB液體培養(yǎng)基上培養(yǎng)至A600值約 等于0.8，加入終濃度為0.2mmol/L的IPTG，32℃誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá)，培養(yǎng)6 h收集菌體， 然后用PBS溶液洗滌并重懸菌體，冰浴超聲破碎細(xì)菌，12 000 r/min離心 20 min，收集上清，用0.45μm的濾膜過濾上清液，然后過Ni2+親和層析柱，用洗滌緩沖液(50mmol/ L NaH2PO4，0.1mol/L NaCl，50mmol/L咪唑，PH 8.0) 洗脫非特異結(jié)合蛋白，用300 mmol / L咪唑洗脫并收集 Osm C蛋白，將OsmC蛋白透析，濃縮， SDS-PAGE檢測純化結(jié)果， Bradford法測定 Osm C蛋白的含量。

1.2.5 OsmC蛋白酶活性分析

利用氧化鐵二甲酚橙試劑(FOX) 法測定OsmC蛋白的過氧化物酶活性。將0.25mg/m L、0.50mg/mL OsmC蛋白與5 mmol/L DTT于冰上孵育 1h，然后加入反應(yīng)試劑(1 mmol/L DTT和 500 μmol/L H2O)，以沒有加 OsmC蛋白的 PBS溶液為對照，間隔5 min取 100μL反應(yīng)產(chǎn)物到空試管，立即加入20μL 0.25mol/L H2SO4終止反應(yīng)，收集完所有樣品后，以50μmol/ L～500μmol/L H2O2為標(biāo)準(zhǔn)曲線，在每個試管中加入880μL新配置的FOX試劑，反應(yīng) 20min，測定 560nm處的吸光值，計算每管剩余的H2O2的量。實驗重復(fù) 3次，取平準(zhǔn)值作圖。

2 結(jié)果

2.1 Mp OsmC蛋白序列結(jié)果

經(jīng)過序列對比及測序我們發(fā)現(xiàn)Mp基因組含有一個編碼OsmC的基因Mpn625。

2.2 重組質(zhì)粒pET28a-MpOsmC的構(gòu)建

PCR擴(kuò)增Mpn625基因，經(jīng)雙酶切反應(yīng)及T4連接酶連接后得到重組質(zhì)粒pET28a-MpOsmC，經(jīng)PCR驗證，送陽性克隆測序驗證正確。

2.3 目的蛋白的表達(dá)與純化

將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌，利用IPTG誘導(dǎo)OsmC蛋白的表達(dá)。通過Ni2+親和層析法純化得到高純度的OsmC蛋白。

2.4 Mp OsmC蛋白的過氧化物酶活性測定

分別用0.25mg/mL、0.50mg/mL的Mp OsmC蛋白降解H2O2，發(fā)現(xiàn)兩種濃度的Mp OsmC蛋白均可降解H2O2，且0.50 mg/ mL的Mp OsmC蛋白降解H2O2速度更快。

3 討論

肺炎支原體是感染人類最常見的致病病原體。這是一種非典型的呼吸道細(xì)菌，在所有年齡段的兒童和成人中均可導(dǎo)致社區(qū)獲得性肺炎（CAP）。自由基介導(dǎo)的細(xì)胞損傷是肺炎支原體影響呼吸道上皮的途徑之一。氧化應(yīng)激作為肺炎支原體發(fā)病機(jī)理的重要一步，由生物體產(chǎn)生的過氧化氫、超氧自由基以及宿主免疫系統(tǒng)一起產(chǎn)生。超氧自由基還可以通過抑制宿主細(xì)胞過氧化氫酶的產(chǎn)生，從而增加自由基損傷的作用。

OsmC最早在生殖支原體中發(fā)現(xiàn)，是細(xì)菌在面臨滲透脅迫時表達(dá)的一類蛋白質(zhì)，它可以分成OsmC和Ohr兩大類，研究發(fā)現(xiàn)這種OsmC蛋白都具有抗氧化功能，在氧化過激所造成的機(jī)體損傷中均起保護(hù)性的作用。當(dāng)表達(dá)OsmC的基因缺失或者人為敲除后，這些突變株或敲除株會出現(xiàn)強(qiáng)烈的氧化損傷作用，對氧化脅迫極其敏感。

本研究通過克隆肺炎支原體中的OsmC基因，并構(gòu)建重組質(zhì)粒誘導(dǎo)OsmC蛋白表達(dá)，發(fā)現(xiàn)高濃度的OsmC蛋白可以更多的降解H2O2，有此我們可以推斷當(dāng)機(jī)體受到肺炎支原體感染并損傷后，肺炎支原體中可以通過表達(dá)OsmC蛋白來減輕這種損傷。但這僅僅是我們目前所觀察到的部分現(xiàn)象，想要進(jìn)一步確證OsmC蛋白的作用，仍需過表達(dá)或者敲除OsmC基因來觀察機(jī)體氧化損傷作用。本研究為探索Mp中OsmC蛋白的抗氧化機(jī)制提供了堅實的基礎(chǔ)。

[1]孫紅,孫紅妹.肺炎支原體直接損傷及其免疫學(xué)致病機(jī)制研究進(jìn)展[J].中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志,2015(01):65-68.

[2]唐愈菲,朱翠明,黃澤智,趙爽.肺炎支原體OsmC蛋白的原核表達(dá)及活性分析[J].中國病原生物學(xué)雜志,2016(05):393-396+400.

[3]黃海,游曉星,李冉輝.香港海鷗菌OsmC蛋白的原核表達(dá)、純化及活性研究[J].生物技術(shù),2015(06):535-539.

湖南省大學(xué)生研究性學(xué)習(xí)和創(chuàng)新性實驗計劃項目（2016-1025）。

黃浴日，男，邵陽學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗學(xué)院2015級檢驗二班，學(xué)號1015040216。