陳旭玉，鐘錦玲，賀春萍，黃 嫻，甘炳春

(1.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院﹠北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院，藥用植物研究所海南分所(海南省南藥資源保護(hù)與開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室)，海南萬寧 571533； 2.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院﹠北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院，藥用植物研究所，北京 100193；3.嶺南師范學(xué)院，廣東湛江 524048； 4.中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所(農(nóng)業(yè)部熱帶作物有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室)， ?？?571101；5.海南碧凱醫(yī)藥研究所，?？?570216)

溫郁金根腐病病原菌生物學(xué)特性及殺菌劑篩選

陳旭玉1,2，鐘錦玲3，賀春萍4，黃 嫻5，甘炳春1

(1.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院﹠北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院，藥用植物研究所海南分所(海南省南藥資源保護(hù)與開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室)，海南萬寧 571533； 2.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院﹠北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院，藥用植物研究所，北京 100193；3.嶺南師范學(xué)院，廣東湛江 524048； 4.中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所(農(nóng)業(yè)部熱帶作物有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室)， ?？?571101；5.海南碧凱醫(yī)藥研究所，海口 570216)

旨在對(duì)溫郁金根腐病病原菌進(jìn)行生物學(xué)特性研究及殺菌劑篩選。采用平板培養(yǎng)法測(cè)定和平板對(duì)峙法進(jìn)行病原菌生物學(xué)特性研究和藥劑篩選。結(jié)果發(fā)現(xiàn)溫郁金根腐病病原菌最適培養(yǎng)基是查氏瓊脂培養(yǎng)基，最適溫度為28 ℃，碳源和pH對(duì)其生長(zhǎng)影響不大，最適氮源為牛肉浸膏。殺菌劑篩選結(jié)果表明，430 g/L戊唑醇SC和w=50%的咪鮮胺錳鹽WP的抑制效果較強(qiáng)，其EC50分別為0.002 和0.024 g/L，其次為w=50%多菌靈WP和w=10%苯醚甲環(huán)唑WG，EC50分別為2.225和2.646 g/L。430 g/L戊唑醇SC、w=50%咪鮮胺錳鹽WP、w=50%多菌靈WP和w=10%苯醚甲環(huán)唑WG均可有效抑制溫郁金根腐病菌的生長(zhǎng)，可進(jìn)一步用于田間試驗(yàn)。

溫郁金；根腐??；病原菌；生物學(xué)特性；殺菌劑篩選

溫郁金CurcumawenyujinY.H.Chen et C.Ling系姜科(Zingiberaceae)姜黃屬(CurcumaL.)植物[1]，為溫州市著名的道地藥材，具有利膽保肝、清心解郁之功效[2-3]。溫郁金是海南保婦康栓的主要植物材料，年銷售2億以上，但溫郁金根腐病嚴(yán)重，影響其產(chǎn)量和質(zhì)量。溫郁金根腐病主要發(fā)生在根莖部，嚴(yán)重時(shí)根莖無法吸收和輸送營(yíng)養(yǎng)和水分，最終導(dǎo)致整株枯死。溫郁金引種至海南種植6月開始發(fā)病，7月達(dá)到高峰，連作嚴(yán)重的地塊發(fā)病率達(dá)50%[4]。如果能找到根腐病的病原菌和防治方法，對(duì)提高溫郁金產(chǎn)量和質(zhì)量有重要意義。溫郁金栽培種植過程中用w=50%退特靈、w=50%甲基托布津、w=70%代森錳鋅或w=75%百菌清對(duì)根腐病初步防治[5-6]，但沒有對(duì)溫郁金根腐病病原菌、生物學(xué)特性及藥劑篩選進(jìn)行深入研究。本文通過溫郁金根腐病病原菌的分離和鑒定、生物學(xué)特性及藥劑篩選研究，以期進(jìn)一步明確溫郁金根腐病病原菌、病原菌生物學(xué)特性并篩選出較好的藥劑，為病害的大田防治提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試菌株 溫郁金根腐病病原菌由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所海南分所分離鑒定并保存，備用。

1.1.2 供試殺菌劑 采用生長(zhǎng)速率法進(jìn)行初步的質(zhì)量濃度篩選，在預(yù)試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，確定各藥劑的最低抑制質(zhì)量濃度，以此為依據(jù)配制5個(gè)質(zhì)量濃度梯度的含毒馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基(PDA)平板。殺菌劑種類、廠家及供試質(zhì)量濃度范圍見表1。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 生物學(xué)特性研究 不同培養(yǎng)基、溫度、pH、碳源及氮源對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響參照文獻(xiàn)[7]進(jìn)行。

1.2.2 室內(nèi)毒力測(cè)定 將菌餅接入不同藥劑處理的含毒平板培養(yǎng)基中，每個(gè)質(zhì)量濃度3個(gè)重復(fù)，不加藥劑的PDA作為對(duì)照。在28 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，7 d后用十字交叉法測(cè)量菌落生長(zhǎng)直徑，并計(jì)算每個(gè)處理菌落的平均值及抑菌率。

表1 不同藥劑質(zhì)量濃度Table 1 Different of fungicides and mass concentration g/L

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

將菌絲生長(zhǎng)抑制率換算成機(jī)率值(y)，殺菌劑質(zhì)量濃度(g/L)轉(zhuǎn)換成以10為底的對(duì)數(shù)值(x)，以抑制機(jī)率值為縱坐標(biāo)，以對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，作毒力回歸直線，求出毒力回歸方程(y=ax+b)，相關(guān)系數(shù)(r2)和抑制有效質(zhì)量濃度(EC50)，以表示殺菌劑對(duì)溫郁金根腐病菌抑制作用的強(qiáng)弱，應(yīng)用Excel軟件求出各藥劑毒力回歸方程、EC50值和相關(guān)系數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 溫郁金根腐病的癥狀及病原菌分離鑒定

溫郁金根腐病主要發(fā)生在根莖部，嚴(yán)重時(shí)根莖部腐爛導(dǎo)致無法吸收和輸送營(yíng)養(yǎng)和水分，造成地上部葉片大量干枯，導(dǎo)致整株死亡。病原菌分離后，將菌株進(jìn)行DNA提取，引物為ITS1 (5′-TCCGATGGTGAACCTGCGG-3′) 和 ITS4 (5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′) 進(jìn)行PCR擴(kuò)增測(cè)序，測(cè)序序列比對(duì)后發(fā)現(xiàn)該菌株與Fusariumproliferatum(KM592959, EU151488, HF930594)的序列相似性為99%。結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定的結(jié)果，將菌株確定為層出鐮孢菌(F.proliferatum)。

2.2 層出鐮孢菌的生物學(xué)特性

2.2.1 不同培養(yǎng)基對(duì)層出鐮孢菌菌絲生長(zhǎng)的影響 層出鐮孢菌(F.proliferatum)在燕麥瓊脂培養(yǎng)基(OA)、玉米粉瓊脂培養(yǎng)基(CMA)、PDA、胡蘿卜瓊脂培養(yǎng)基(CA)、查式瓊脂培養(yǎng)基(CZ)上均能很好的生長(zhǎng)，但在CZ培養(yǎng)基上生長(zhǎng)速度最快，其次為CA培養(yǎng)基(圖1)。

圖1 菌絲在不同培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的結(jié)果Fig.1 Results of mycelia growth on different medium

2.2.2 不同溫度對(duì)鐮孢菌菌絲生長(zhǎng)的影響 鐮孢菌(F.proliferatum)菌絲在15～35 ℃均能生長(zhǎng)，適宜溫度為28～30 ℃，最適溫度為28 ℃，35 ℃時(shí)菌絲生長(zhǎng)明顯受到抑制，40 ℃時(shí)菌絲停止生長(zhǎng)(圖2)。

2.2.3 不同pH對(duì)鐮孢菌菌絲生長(zhǎng)的影響 鐮孢菌(F.proliferatum)菌絲對(duì)酸堿度的適宜范圍很廣，菌絲在pH為7～11均能生長(zhǎng)，當(dāng)pH<5時(shí)，菌絲生長(zhǎng)受到明顯抑制。說明適宜溫郁金根腐病病原菌生長(zhǎng)的環(huán)境為偏堿性，過酸對(duì)病原菌的生長(zhǎng)不利(圖3)。

圖2 菌絲在不同溫度下生長(zhǎng)的結(jié)果Fig.2 Rresults of mycelia growth on different temperatures

圖3 菌絲在不同的pH生長(zhǎng)的結(jié)果Fig.3 Results of mycelia growth on pH

2.2.4 不同碳源對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響 不同碳源對(duì)鐮孢菌菌絲的生長(zhǎng)影響不大，適宜碳源為D-山梨醇、葡萄糖和乳糖、果糖、麥芽糖、蔗糖和可溶性淀粉(圖4)。

2.2.5 不同氮源對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響 不同氮源對(duì)鐮孢菌菌絲生長(zhǎng)的影響有差異，最適氮源為牛肉浸膏，鐮孢菌在含有硫酸銨和硝酸銨的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)緩慢(圖5)。

2.3 室內(nèi)抑菌效果測(cè)定

2.3.1 供試殺菌劑對(duì)溫郁金根腐病菌絲生長(zhǎng)的影響 由表2可知，隨著各種殺菌劑質(zhì)量濃度的增加，病菌抑制率增大，說明藥劑質(zhì)量濃度與抑制率成正相關(guān)。8 種殺菌劑中，在較低的質(zhì)量濃度下，即1 g /L，w=50%咪鮮胺錳鹽WP表現(xiàn)出較高的抑制率。在質(zhì)量濃度為100 g /L時(shí)，w=80%代森錳鋅WP的抑菌率為100%，病菌生長(zhǎng)完全受到限制；w=10%苯醚甲環(huán)唑WG次之，抑菌率為94.3%；250 g/L嘧菌酯SC在最高質(zhì)量濃度中抑菌率表現(xiàn)最差，僅為52.7%。

2.3.2 供試藥劑對(duì)溫郁金根腐病菌絲的室內(nèi)毒力測(cè)定 從表3可知，430 g/L戊唑醇SC、w=50%咪鮮胺錳鹽WP、w=50%多菌靈WP、w=10%苯醚甲環(huán)唑WG對(duì)溫郁金根腐病菌的EC50較小，分別為0.002、0.024、2.225和2.646 g/L，表現(xiàn)較敏感，其中430 g/L戊唑醇SC對(duì)根腐病菌的毒力最強(qiáng)，w=80%代森錳鋅WP、w=70%甲基硫菌靈WP和250 g/L嘧菌酯SC對(duì)溫郁金根腐病菌的毒力相對(duì)較弱，其EC50分別為13.279、32.584和61.421 g/L。

圖4 菌絲在不同的碳源下生長(zhǎng)的結(jié)果Fig.4 Results of mycelia grow on different carbon sources

圖5 菌絲在不同氮源下生長(zhǎng)的結(jié)果Fig.5 Results of mycelia growth on different nitrogen sources

3 討 論

溫郁金根腐病是溫郁金生產(chǎn)中較為嚴(yán)重的病害之一，溫郁金根腐病在原產(chǎn)地有報(bào)道但沒有確定病原、生物學(xué)特性及防治藥劑[8]。本文首次報(bào)道溫郁金根腐病病原菌及生物學(xué)特性，溫郁金根腐病菌鑒定為層出鐮孢菌(F.proliferatum)。層出鐮孢菌(F.proliferatum)可侵染水稻、小麥、玉米、大豆、蘆筍、大蒜、洋蔥等作物，引起枯萎病、腐爛病、軟腐病等[9-10]。如王葉[11]報(bào)道的層出鐮孢菌(F.proliferatum)可引起棗田間軟腐病，徐鵬[12]報(bào)道層出鐮孢菌(F.proliferatum)是玉米鞘腐病的主要致病菌，病菌主要通過分泌胞壁降解酶和毒素導(dǎo)致寄主發(fā)病。由于層出鐮孢菌(F.proliferatum)常引起根腐爛病、枯萎病和軟腐病等，可以初步確定分離的層出鐮孢菌(F.proliferatum)是溫郁金根腐病的病原之一。此外，李鵬昌[13]報(bào)道平臍蠕孢菌、黃色鐮孢菌和層出鐮孢菌均能引起小麥發(fā)病，但發(fā)病病情指數(shù)有差異。盧維宏等[14]報(bào)道擬輪枝鐮孢菌F.verticillioides、層出鐮孢菌F.proliferatum和亞黏團(tuán)鐮孢菌(F.subglutinans)均引起玉米穗腐病，只是發(fā)病指數(shù)有差別。由此可知，層出鐮孢菌F.proliferatum是引起溫郁金發(fā)病的病原之一，不一定是唯一病原菌。呂延超等[15]報(bào)道杧果畸形病的病原菌為層出鐮孢菌(F.proliferatum)，其生物學(xué)特性研究結(jié)果表明，病原菌生長(zhǎng)的最適溫度為 24 ℃，最適 pH為 10；本研究結(jié)果表明，28 ℃下生長(zhǎng)最好，pH 7～11時(shí)對(duì)其生長(zhǎng)影響不大。最適溫度及生長(zhǎng)條件不一致的原因可能是培養(yǎng)基成分不一致。pH 7～11均能生長(zhǎng)說明適宜溫郁金根腐病病原菌生長(zhǎng)的環(huán)境為偏堿性，如果土壤環(huán)境偏酸則不利發(fā)病。目前對(duì)根腐病病害防治鮮有報(bào)道，筆者確認(rèn)430 g/L戊唑醇SC、w=50%咪鮮胺錳鹽WP、w=50%多菌靈WP和w=10%苯醚甲環(huán)唑WG對(duì)病原菌的抑制效果較好，但田間防治試驗(yàn)是否穩(wěn)定仍需進(jìn)一步研究。

表2 不同殺菌劑的室內(nèi)抑菌作用Table 2 Inhibition effects of different fungicides on the mycelium growth

表3 8種殺菌劑對(duì)溫郁金根腐病菌菌絲生長(zhǎng)的回歸方程及EC50Table 3 Regression equation and EC50 of 8 fungicides against Fusarium proliferatum

4 結(jié) 論

溫郁金根腐病菌為層出鐮孢菌(F.proliferatum)，最適培養(yǎng)基是查氏瓊脂培養(yǎng)基，最適溫度為28 ℃，pH和碳源對(duì)其生長(zhǎng)影響不大，最適氮源為牛肉浸膏。另外，室內(nèi)藥劑篩選結(jié)果表明 430 g/L戊唑醇SC、w=50%咪鮮胺錳鹽WP、w=50%多菌靈WP和w=10%苯醚甲環(huán)唑WG在室內(nèi)均可有效抑制溫郁金根腐病菌的生長(zhǎng)，可進(jìn)一步用于田間試驗(yàn)。

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(責(zé)任編輯：顧玉蘭 Responsible editor:GU Yulan)

Biological Characteristics and Fungicides Screening for Pathogen of Root Rot onCurcumawenyujinY. H. Chen et C.Ling

CHEN Xuyu1,2, ZHONG Jinlin3, HE Chunping4, HUANG Xian5and GAN Bingchun1

(1.Hainan Provincial Key Laboratory of Resources Conservation and Development of Southern Medicine,Hainan Branch Institute of Medicinal Plant,Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Wanning Hainan 571533,China; 2.Institute of Medicinal Plant Development, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College,Beijing 100193,China; 3.Lingnan Normal University,Zhanjiang Guangdong 5240483, China; 4.Key Laboratory of Integrated Pest Management on Tropical Crops of Ministry of Agriculture,China Aacdenay of Tropical Agricultural Sciences,Environment and Plant Protection Institute, Hainan, Haikou 5711013,China; 5.Hainan Bikai Pharmaceutical Research Institute Co. Ltd., Haikou 570216,China)

In order to master and control the pathogen causing the root rot of theCurcumawenyujinY. H. Chen et C. Ling, biological characteristics and fungicides screening for the pathogen were studied. The biological characteristics and fungicides screening by PDA medium and the Face-to-face culturing on PDA plates, respectively. The results showed that the optimum medium and temperature for the pathogen mycelial growth were Czapek medium and 28 °C, respectively. Carbon sources and pH value did not affect the growth of mycelia of pathogen. In addition, the toxicological tests showed that 430 g/L tebuconazole SC andw=50% prochloraz-manganese chloride complex WP had strong activity against mycelia growth, itsEC50values were 0.002 g/L and 0.024 g/L. Follow by thew=50% Carbendazim WP andw=10% difenoconazole WG, theirEC50values were 2.225 g/L and 2.646 g/L, respectively. 430 g/L tebuconazole SC,w=50% prochloraz-manganese chloride complex WP,w=50% carbendazim WP andw=10% difenoconazole WG effectively inhibited the growth of pathogen and could be used in flied trials.

Curcumawenyujin；Root rot；Pathogen；Biological characterization；Fungicides screening

CHEN Xuyu, female,associate research fellow. Research area: plant protection and microbiology applied. E-mail: chenxuyu-11@163.com

GAN Bingchun,male, research fellow. Research area: pest control. E-mail:ganbingchun@126.com

2015-10-23

2016-03-11

國(guó)家科技重大專項(xiàng) (2012ZX09304006)；海南省重大專項(xiàng) (ZDZX2013008)。

陳旭玉，女，副研究員，研究方向?yàn)樗幱弥参锉Ｗo(hù)及微生物資源開發(fā)。Email: chenxuyu-11@163.com

甘炳春，男，研究員，研究方向?yàn)椴∠x害防治。Email: ganbingchun@126.com

日期：2016-12-20

S682

A

1004-1389(2017)01-0137-07

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20161220.1645.034.html

Received 2015-10-23 Returned 2016-03-11

Foundation item Special Important Program of the National Science and Technology (No.2012ZX09304006); Special Important Program of Hainan Province(No.ZDZX2013008).