發(fā)酵調(diào)味飲料酵母菌的篩選及其發(fā)酵性能研究

范洪臣，劉天，鄭威，陳寧，辛嘉英

（1.哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150076；2.哈爾濱商業(yè)大學(xué)會(huì)計(jì)學(xué)院，哈爾濱 150076；3.哈爾濱商業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與環(huán)境科學(xué)研究中心，哈爾濱 150076）

發(fā)酵調(diào)味飲料酵母菌的篩選及其發(fā)酵性能研究

范洪臣1＊，劉天2，鄭威3，陳寧3，辛嘉英1

（1.哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150076；2.哈爾濱商業(yè)大學(xué)會(huì)計(jì)學(xué)院，哈爾濱 150076；3.哈爾濱商業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與環(huán)境科學(xué)研究中心，哈爾濱 150076）

從當(dāng)?shù)刂谱髅姘婺嘀蟹蛛x酵母菌，以產(chǎn)酒精和3-羥基丁酮為參考指標(biāo)，通過(guò)三級(jí)篩選，篩選出一株適合發(fā)酵調(diào)味飲料用的產(chǎn)酒低、產(chǎn)香性能優(yōu)的酵母SD-01。通過(guò)個(gè)體形態(tài)、菌落特征、生理生化分析，SD-01鑒定為釀酒酵母。將SD-01接入到麥汁培養(yǎng)基中，不同溫度下產(chǎn)3-羥基丁酮、酒精不同，其中26℃下發(fā)酵條件最好，其酒精量為0.98g/dL，3-羥基丁酮最高為0.97g/L。在26℃下研究了菌種生長(zhǎng)、代謝還原糖、產(chǎn)酸、產(chǎn)酒、產(chǎn)3-羥基丁酮的規(guī)律，為發(fā)酵生產(chǎn)提供借鑒。最終篩選的酵母菌因其產(chǎn)酒低、3-羥基丁酮高加之發(fā)酵產(chǎn)生豐富的有機(jī)酸，為發(fā)酵調(diào)味飲料生產(chǎn)提供了一株發(fā)酵性能良好的酵母。

篩選；酵母；發(fā)酵調(diào)味飲料；酒精；3-羥基丁酮

近年來(lái)，傳統(tǒng)的碳酸飲料、新興的茶飲料、果汁飲料、蔬菜汁飲料、發(fā)酵調(diào)味飲料這些功能性飲料快速發(fā)展。其中，發(fā)酵調(diào)味飲料也不斷走向成熟，新技術(shù)不斷發(fā)展，迎合消費(fèi)者口味和理念的新產(chǎn)品不斷涌現(xiàn)［1］。發(fā)酵調(diào)味飲料是一種飲料原料通過(guò)乳酸菌、酵母菌或其他允許使用的菌種發(fā)酵后調(diào)配，酒精含量在1%（體積分?jǐn)?shù)）以下的飲料［2］。發(fā)酵調(diào)味飲料在發(fā)酵過(guò)程中微生物代謝產(chǎn)生很多小分子有機(jī)物，如有機(jī)酸、維生素等，這些有機(jī)物易于人體吸收，有利于人的身體健康，還具有抑菌作用，可以延長(zhǎng)飲料的保質(zhì)期［3］；同時(shí)酵母也具有廣泛的營(yíng)養(yǎng)和應(yīng)用價(jià)值，它具有高的蛋白質(zhì)、完全的氨基酸、豐富的B族維生素、全面的生理活性物質(zhì)如各種輔酶、細(xì)胞色素、凝血質(zhì)、谷胱甘肽等［4］，酵母里的微量元素硒、鉻能抗衰老、抗腫瘤、預(yù)防動(dòng)脈硬化，并能提高人體的免疫力，因此酵母菌對(duì)于發(fā)酵調(diào)味飲料來(lái)說(shuō)相當(dāng)重要。雖然酵母為發(fā)酵調(diào)味飲料帶入了諸多優(yōu)點(diǎn)，但是也有其弊端，一是由于大多數(shù)酵母產(chǎn)酒能力較強(qiáng)，導(dǎo)致發(fā)酵結(jié)束后酒精含量較高，不符合發(fā)酵調(diào)味飲料的定義，后期對(duì)酒精的處理成為棘手的問(wèn)題；二是風(fēng)味不突出，雖然大多數(shù)酵母產(chǎn)生有機(jī)酸，但產(chǎn)香味物質(zhì)較少，因此在發(fā)酵調(diào)味飲料調(diào)配中加入一些人工合成的香料彌補(bǔ)發(fā)酵調(diào)味飲料風(fēng)味不足。隨著人們飲食習(xí)慣的改變，對(duì)人為合成的香料越來(lái)越排斥，因此篩選適合發(fā)酵調(diào)味飲料應(yīng)用的產(chǎn)低酒精和高香味的酵母尤為重要。

目前大多數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道集中在高產(chǎn)酒精酵母［5，6］、果酒類酵母［7－10］篩選上，單純篩選發(fā)酵調(diào)味飲料用酵母尤其是產(chǎn)酒精低、風(fēng)味高的文章還沒(méi)見(jiàn)報(bào)道。2，3，5-氯化苯基四氮哇（TTC）平板法是篩選高產(chǎn)酒精酵母的常用方法，TTC作為顯色劑與酵母的代謝產(chǎn)物發(fā)生呈色反應(yīng)，顏色深的菌株呼吸酶活力強(qiáng)，有較強(qiáng)的產(chǎn)酒精能力，進(jìn)而判斷酵母產(chǎn)酒精能力的高低。本研究對(duì)TTC篩選高產(chǎn)酒精酵母的方法進(jìn)行逆向思維，選擇顏色淺、呼吸酶弱、有較弱產(chǎn)酒能力的酵母。3-羥基丁酮也稱乙偶姻、甲基乙酰甲醇，主要應(yīng)用于奶油、乳品、酸奶和草莓型飲料等食品行業(yè)。此外，3-羥基丁酮在化工、制藥、IT等行業(yè)也有廣泛應(yīng)用。目前為止，化學(xué)法、酶法以及微生物發(fā)酵法是生產(chǎn)3-羥基丁酮的主要方法，在3種方法中，微生物發(fā)酵法憑借原料廣泛、反應(yīng)條件溫和、綠色等優(yōu)點(diǎn)而備受關(guān)注。3-羥基丁酮的測(cè)定原理是在堿性介質(zhì)中，3-羥基丁酮與含胍基的化合物反應(yīng)生成紅色化合物，甲萘酚促進(jìn)紅色化合物生成，紅色化合物在可見(jiàn)光500～600nm有較強(qiáng)的光吸收，吸光值與3-羥基丁酮濃度在一定濃度范圍內(nèi)成正比［11］。本研究根據(jù)測(cè)定3-羥基丁酮的原理，向發(fā)酵后的小玻璃管中加入3-羥基丁酮顯色劑，顏色深者為高產(chǎn)3-羥基丁酮菌株，利用此方法可以簡(jiǎn)單、方便地篩選高產(chǎn)3-羥基丁酮酵母。通過(guò)3次篩選得到了酒精產(chǎn)量低、3-羥基丁酮含量高的酵母，對(duì)該酵母進(jìn)行了初步鑒定并對(duì)其生產(chǎn)性能進(jìn)行了研究，為篩選發(fā)酵調(diào)味飲料用酵母提供了方法借鑒，同時(shí)也為發(fā)酵調(diào)味飲料生產(chǎn)提供了借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 酵母菌種來(lái)源

酵母菌篩選材料來(lái)源于哈爾濱本地生產(chǎn)大列巴用的面泥。

1.1.2 一級(jí)篩選培養(yǎng)基

TTC上層培養(yǎng)基：參考文獻(xiàn)［12］TTC上層培養(yǎng)基配制。

TTC下層培養(yǎng)基：瓊脂15g，麥汁糖化液1000mL。

1.1.3 二級(jí)篩選培養(yǎng)基

麥汁糖化液。

1.1.4 三級(jí)篩選培養(yǎng)基

麥汁糖化液。

1.2 方法

1.2.1 富集培養(yǎng)

將面泥加入裝有100mL水及玻璃珠滅菌后的500mL錐形瓶中，用振蕩器振蕩1h，打碎面泥，釋放游離菌，振蕩后從菌懸液中取5mL樣品加入到滅菌后的含100μg/mL青霉素的麥汁中，26℃培養(yǎng)24h，鏡檢。若全為酵母則取1mL接入TTC篩選平板。

1.2.2 酵母菌的篩選

1.2.2.1 一級(jí)篩選

采用TTC法，將富集的酵母接入到TTC平板上，28℃培養(yǎng)48h，將TTC顯色劑覆蓋到底層培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的酵母菌落，繼續(xù)28℃培養(yǎng)16h。顏色的深淺代表產(chǎn)酒精能力，深紅色的酵母菌落產(chǎn)酒能力強(qiáng)，淺粉或無(wú)色產(chǎn)酒能力弱。將分離得到的各菌株根據(jù)上述方法試驗(yàn)重復(fù)3次，初篩出產(chǎn)酒低性狀的酵母菌株。

1.2.2.2 二級(jí)篩選

將一級(jí)篩選得到的酵母接種到裝有麥汁培養(yǎng)基的玻璃試管中28℃培養(yǎng)48h，根據(jù)3-羥基丁酮測(cè)定原理，加入1mL 10%NaOH、0.5%肌酸、5%甲萘酚，4h后觀察試管顏色，顏色變紅的試管對(duì)應(yīng)高產(chǎn)3-羥基丁酮菌株。將分離得到的各菌株根據(jù)上述方法試驗(yàn)重復(fù)3次，篩選出高產(chǎn)3-羥基丁酮的菌株。

1.2.2.3 三級(jí)篩選

將二級(jí)篩選出的菌株按接種量6×106cfu/mL接入麥芽汁培養(yǎng)基中，28℃發(fā)酵48h后測(cè)定酒精和3-羥基丁酮含量，試驗(yàn)重復(fù)3次，復(fù)篩得到性狀最為優(yōu)良的菌株。

1.3 酵母菌的鑒定

形態(tài)特征鑒定：菌種個(gè)體形態(tài)和菌落特征。

生理生化試驗(yàn)：根據(jù)《酵母菌的特征與鑒定手冊(cè)》［13，14］進(jìn)行生理生化鑒定。

1.3.1 發(fā)酵性能的研究

不同溫度下產(chǎn)酒精能力的研究：將篩選出的菌株按接種量6×106cfu/mL接入麥芽汁培養(yǎng)基中，不同培養(yǎng)溫度22，26，30℃，發(fā)酵48h后測(cè)定酒精和3-羥基丁酮含量，考察不同溫度下該酵母的產(chǎn)酒精、3-羥基丁酮能力。

發(fā)酵性能的研究：將篩選出的菌株按接種量6×106cfu/mL接入麥芽汁培養(yǎng)基中，26℃下培養(yǎng)，發(fā)酵培養(yǎng)4，12，16，20，24，28h后測(cè)定該菌產(chǎn)酸、耗糖、產(chǎn)酒、產(chǎn)3-羥基丁酮指標(biāo)。

1.3.2 測(cè)量方法

1.3.2.1 酒精的測(cè)定

酒精的測(cè)定采用GB/T 13662－2008方法測(cè)定。

1.3.2.2 3-羥基丁酮測(cè)定

3-羥基丁酮測(cè)定根據(jù)文獻(xiàn)［11］方法測(cè)定。

1.3.2.3 酸度測(cè)定

酸度用pH計(jì)直接讀數(shù)。

1.3.2.4 還原糖測(cè)定

還原糖用斐林試劑滴定法測(cè)定［15］。

2 結(jié)果分析

2.1 篩選結(jié)果

富集主要目的是將面泥中的酵母篩選出來(lái)，本實(shí)驗(yàn)將采集的樣品置于100μg/mL青霉素麥汁培養(yǎng)基中，經(jīng)培養(yǎng)將面泥中乳酸菌、醋酸菌等細(xì)菌淘汰，將酵母保留下來(lái)。

2.2 酵母菌的篩選

根據(jù)一級(jí)篩選的方法，及時(shí)觀察菌落的顏色變化，比較各菌株間的顏色深淺，其效果見(jiàn)圖1。

圖1 TTC平板篩選產(chǎn)低酒精酵母Fig.1The screening of low alcohol yeast on TTC plate

由圖1可知，平板中大多數(shù)酵母是紅色的，顏色較深，但有個(gè)別的酵母菌落顏色很淺，甚至無(wú)色，此類酵母菌同其他酵母相比菌落較小，呼吸酶可能較弱，有較弱的產(chǎn)酒能力，導(dǎo)致與TTC反應(yīng)顏色較淺。通過(guò)一級(jí)篩選共得到48株酵母。

根據(jù)二級(jí)篩選的方法，及時(shí)觀察各菌管的顏色變化，比較各菌管的顏色深淺，其效果見(jiàn)圖2。

由圖2可知，菌種產(chǎn)3-羥基丁酮，可以根據(jù)玻璃試管粉顏色的深淺判斷，產(chǎn)3-羥基丁酮越多，粉顏色越深，最終由一級(jí)篩選方法挑選出的48菌株經(jīng)二級(jí)篩選得到12株酵母，這12株酵母從一級(jí)、二級(jí)篩選效果看既產(chǎn)酒低又高產(chǎn)風(fēng)味物質(zhì)3-羥基丁酮。

根據(jù)三級(jí)篩選的方法以產(chǎn)酒、3-羥基丁酮為指標(biāo)，選出了一株既產(chǎn)酒低又高產(chǎn)3-羥基丁酮的酵母，命名為HS-01，在7°Bix麥汁下發(fā)酵液酒精含量為0.96g/dL，比對(duì)照的商用產(chǎn)酒酵母產(chǎn)酒精含量2.56g/dL低很多，滿足了發(fā)酵調(diào)味飲料低酒精的要求。生成的風(fēng)味物質(zhì)3-羥基丁酮含量達(dá)到0.93g/dL。故經(jīng)過(guò)三級(jí)篩選得到的HS-01完全達(dá)到了發(fā)酵調(diào)味飲料的要求。

2.3 菌種鑒定

2.3.1 形態(tài)特征觀察

圖3 HS-01菌株的形態(tài)（40×10）Fig.3Figure of HS-01（40×10）

由圖3可知，在麥汁平板培養(yǎng)基25℃培養(yǎng)24h，經(jīng)高倍顯微鏡觀察，HS-01為橢圓形，大小1.5～2.5μm× 2.5～8μm。

2.3.2 菌落特征

圖4 HS-01菌株菌落特征Fig.4Colony characteristics of strain HS-01

由圖4可知，HS-01菌株菌落顏色乳白色，挑起粘稠，外觀光滑、平整、有隆起。

2.3.3 生理生化鑒定

HS-01菌株能發(fā)酵葡萄糖、蔗糖、半乳糖和棉子糖，不發(fā)酵乳糖；能同化棉子糖、麥芽糖、半乳糖、甘露糖、山梨糖、海藻糖、纖維二糖、乙醇、甘油、菊粉、D-甘露醇、α-甲基-葡萄糖苷、水楊苷、檸檬酸、琥珀酸；不能同化乳糖、D-木糖、D-核糖、蜜二糖、L-阿拉伯糖、D-阿拉伯糖、可溶性淀粉、乳酸、赤蘚醇、肌醇和核糖醇；不能同化硝酸鉀和亞硝酸鈉，鹽酸乙胺和鹽酸尸胺同化為陰性，在無(wú)維生素培養(yǎng)基上能生長(zhǎng)，37℃能生長(zhǎng)，50%葡萄糖能生長(zhǎng)，產(chǎn)淀粉試驗(yàn)為陰性。放線菌素酮抗性試驗(yàn)為陰性。根據(jù)HS-01菌株的形態(tài)、生理生化試驗(yàn)，結(jié)合《酵母菌的特征與鑒定手冊(cè)》，可將HS-01菌株鑒定為釀酒酵母。

2.4 HS-01酵母菌的發(fā)酵性能

為了確保篩選得到的菌株能夠用于發(fā)酵調(diào)味飲料實(shí)際生產(chǎn)，對(duì)酵母HS-01菌株的生長(zhǎng)特性產(chǎn)酸、耗糖、產(chǎn)酒和產(chǎn)3-羥基丁酮能力進(jìn)行研究，為發(fā)酵生產(chǎn)提供借鑒。

2.5 溫度對(duì)HS-01產(chǎn)酒精、3-羥基丁酮的影響

在22，26，30℃下HS-01產(chǎn)酒精、3-羥基丁酮能力見(jiàn)圖5和圖6。

圖5 不同溫度下HS-01產(chǎn)酒精能力Fig.5Alcohol production ability of HS-01 at different temperatures

圖6 不同溫度下HS-01產(chǎn)3-羥基丁酮能力Fig.6Acetoin production ability of HS-01 at different temperatures

由圖5可知，隨著溫度的升高，酒精含量呈先升后降的趨勢(shì)，酒精含量在26℃最高，達(dá)到了0.98g/dL。

由圖6可知，隨著溫度的升高，3-羥基丁酮含量呈先升后降的趨勢(shì)，3-羥基丁酮含量在26℃最高，達(dá)到了0.97g/L。從產(chǎn)酒結(jié)果看，在低溫22℃和高溫30℃時(shí)產(chǎn)酒能力較弱，低溫時(shí)酵母生長(zhǎng)較慢導(dǎo)致酒精含量低，高溫時(shí)溫度影響了酵母中合成酒精的代謝酶類活性從而影響了產(chǎn)酒精能力。但從產(chǎn)3-羥基丁酮能力看，26℃產(chǎn)量最高，可能在26℃下合成3-羥基丁酮的酶類代謝活躍。綜合酒精和3-羥基丁酮這兩個(gè)指標(biāo)，發(fā)酵溫度26℃對(duì)發(fā)酵生產(chǎn)更有力，有益于獲得香氣好、酒精度適合的發(fā)酵調(diào)味飲料。

2.6 HS-01產(chǎn)酸規(guī)律

圖7 HS-01產(chǎn)酸曲線Fig.7Acid yield curve of HS-01

由圖7可知，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，pH逐漸變低，尤其是在16～24hpH下降最快，在28hpH達(dá)到3.5。這說(shuō)明HS-01在發(fā)酵過(guò)程中具有較強(qiáng)的產(chǎn)酸能力，通過(guò)品嘗，酸味較柔和，由此帶來(lái)良好的酸味，豐富了發(fā)酵調(diào)味飲料風(fēng)味，為發(fā)酵調(diào)味飲料的后期調(diào)制和新產(chǎn)品開(kāi)發(fā)提供了有利因素。

2.7 HS-01耗糖規(guī)律

圖8 HS-01耗糖曲線Fig.8The curve of HS-01sugar consumption

由圖8可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的增長(zhǎng)，還原糖含量不斷降低，其中在16～28h還原糖降速最快，綜合產(chǎn)酸曲線、產(chǎn)酒曲線和產(chǎn)3-羥基丁酮曲線，HS-01利用還原糖主要在這個(gè)階段合成了有機(jī)酸、酒精和3-羥基丁酮，所以耗糖速度較快。

2.8 HS-01產(chǎn)酒精規(guī)律

圖9 HS-01產(chǎn)酒精曲線Fig.9The curve of HS-01alcohol production

由圖9可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的增長(zhǎng)，酒精含量逐漸升高，尤其是在16～24h酒精含量升速最快，在28h達(dá)到0.98g/dL。

2.9 HS-01產(chǎn)3-羥基丁酮規(guī)律

圖10 HS-01產(chǎn)3-羥基丁酮曲線Fig.10The curve of HS-01acetoin production

由圖10可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的增長(zhǎng)，3-羥基丁酮含量逐漸升高，28h達(dá)到最高，為0.97g/L。3-羥基丁酮4h時(shí)開(kāi)始出現(xiàn)，至28h基本結(jié)束，在16～28h生成速率增快，與菌體的生長(zhǎng)、耗糖相對(duì)應(yīng)，說(shuō)明HS-01產(chǎn)3-羥基丁酮是隨著菌體的生長(zhǎng)而產(chǎn)生的。由于HS-01原始菌株產(chǎn)3-羥基丁酮較高，可以考慮在將來(lái)的研究中用該菌種直接生產(chǎn)天然的香料3-羥基丁酮。

3 結(jié)論

從生產(chǎn)面包的面泥中利用三級(jí)篩選的方法得到了一株產(chǎn)酒精低、3-羥基丁酮高的酵母菌HS-01，通過(guò)對(duì)其發(fā)酵性能進(jìn)行研究，HS-01在26℃時(shí)產(chǎn)酒精0.98g/dL，3-羥基丁酮0.97g/L，產(chǎn)酸也比較好，是一株能夠用于發(fā)酵調(diào)味飲料的良好菌種。經(jīng)過(guò)生理生化鑒定HS-01為釀酒酵母。隨著發(fā)酵調(diào)味飲料的發(fā)展，國(guó)內(nèi)飲料企業(yè)已將發(fā)酵菌種、發(fā)酵調(diào)味飲料的生產(chǎn)及新型發(fā)酵調(diào)味飲料的開(kāi)發(fā)作為重點(diǎn)，因此，HS-01用于發(fā)酵調(diào)味飲料生產(chǎn)及開(kāi)發(fā)新型發(fā)酵調(diào)味飲料產(chǎn)品是我們將來(lái)主要研究的內(nèi)容。

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Screening of Yeast for Fermented Drink Production and Research on Yeast Fermentation Capability

FAN Hong-chen1＊，LIU Tian2，ZHENG Wei3，CHEN Ning3，XIN Jia-ying1
（1.Key Laboratory for Food Science ＆Engineering，Harbin University of Commerce，Harbin 150076，China；2.College of Accounting，Harbin University of Commerce，Harbin 150076，China；3.Center of Research and Development on Life Sciences and Environmental Sciences，Harbin University of Commerce，Harbin 150076，China）

A strain of yeast named SD-01for fermented drink production is screened from the bread dough with different grades of maturity after three level screening.The content of alcohol and acetoin is determined by three level screening.SD-01is identified asSaccharomycescerevisiaeon the basis of morphological characteristics，colony morphology，physiological and biochemical tests.The result indicates that the optimal fermentation temperature is 26℃，with alcohol of 0.98g/dL and acetoin of 0.97g/L.The fermentation technique of metabolism reducing sugar，acid production，alcohol production，acetoin production is researched at 26℃.SD-01has low alcohol，high acetoin and rich organic acids，is feasible for fermented drink production.

screening；yeast；fermented drink；alcohol；acetoin

TS261.13

A

10.3969/j.issn.1000-9973.2017.03.007

1000-9973（2017）03-0026-05

2016－09－09 ＊通訊作者

黑龍江省科技廳項(xiàng)目（GC12B403）

范洪臣（1978－），男，黑龍江哈爾濱人，助理工程師，博士，研究方向：食品科學(xué)。