李鵬程+劉濤+伍月+張倩+付春梅+劉翠

[摘要]運用纖維蛋白原平板法，以凝血酶為參照，建立體外凝血活性測定的方法，以體外凝血活性為指標，篩選黃槐復方提取路線，并在單因素試驗基礎上，以黃芩苷、蘆丁提取轉移率和浸膏得率的綜合評分值為因變量，乙醇濃度、溶劑用量、提取時間為影響因素，利用星點設計3因素5水平試驗，進行二次多項式擬合，通過效應面法優(yōu)選黃槐復方提取工藝，并測定其凝血活性。結果表明凝血酶濃度在04～16 U·mL-1與沉淀圈面積呈良好線性關系，r=0997 5；平均加樣回收率為1038%，RSD 47%；黃槐合提浸膏的沉淀圈面積3881 mm2，比分提浸膏沉淀圈面積大；黃槐浸膏的日用量的活性8428 U。黃槐復方的最佳提取工藝為加6倍量40%乙醇，提取3次，每次2 h，綜合評分值預測值為9426，驗證值為8834，與預測值偏差為628%，最佳提取工藝制得的中間體凝血活性較好。所建立的方法可以簡便、快速、準確地測定黃槐復方的凝血活性，可用于后續(xù)工藝的篩選以及質(zhì)量控制。

[關鍵詞]黃槐復方； 凝血活性； 纖維蛋白原平板法； 星點設計效應面法

Optimization of extraction technology from compound Huanghuai

based on coagulation activity and central composite design

response surface methodology

LI Pengcheng1， LIU Tao2*， WU Yue2， ZHANG Qian2， FU Chunmei2， LIU Cui2

（1 Sichuan Industrial Institute of Antibiotics， Chengdu University， Chengdu 610052， China；

2 College of Pharmacy and Biological Engineerin， Chengdu University， Chengdu 610106， China）

[Abstract]To establish a method for the determination of coagulation activity in vitro by using fibrinogen plate method The extraction route of compound Huanghuai was optimized by selecting thrombin as the reference substance The comprehensive score of extract yield and the extraction transfer rate of baicalin and rutin was set as the dependent variable， with alcohol concentration， solvent volume and extraction time as the influence factors in central composite design for quadratic fitting， and the extraction process of compound Huanghuai was optimized by using response surface methodology The results of thrombin concentration and precipitation zone area showed a good linear relationship in 0416 U·mL-1， r=0997 5 The average recovery rate was 1038% and the RSD was 47 %. The circle of precipitation area of compound Huanghuai combined extract was 3881 mm2， which was bigger than that of fractionated extract The activity on the daily amount of compound Huanghuai extract was 8428 U； and the optimum extraction technology was as follows： alcohol concentration 40%， extracted 3 times， the liquidsolid ratio 6∶1， and extraction time 2 h The predicted value of comprehensive score was 9426 and the measured value was 8834， respectively， with a relative deviation of 628% The coagulation activity of the intermediate obtained by optimal extraction process was better So the method established in this paper was simple， fast and accurate for determination of coagulation activity of compound Huanhuai， which can be also used for the screening of followup process and quality control

[Key words]compound Huanghuai； coagulation activity； fibrinogen plate method； central composite designresponse surface methodology

崩漏是婦科常見病，當前臨床應用的化學藥物有縮宮素（oxytocin）和前列腺素（prostaglandins）等制劑[1]，這些藥物都有程度不同的副作用。中醫(yī)藥治療包括產(chǎn)后出血在內(nèi)的婦科出血癥，有著悠久的歷史，無明顯副作用。黃槐酒為《濟陰綱目》中提的傳統(tǒng)經(jīng)典方[2]。由黃芩及槐米組成，以黃酒為溶劑，以燒紅的稱砣為熱源進行提取。方中黃芩性苦，寒。具有清熱燥濕，瀉火解毒，止血的功效[3]?；泵仔钥啵⒑?，涼血止血，具有清肝瀉火之功[3]。兩者合用達到瀉火解毒，涼血止血之功，中藥復方的提取工藝路線（分提或合提）對復方藥效有著重要的影響，目前研究多以指標成分確定復方提取工藝路線，本研究采用纖維蛋白原平板法[4]對復方提取工藝路線所得的提取物的藥效進行評價，可解決指標成分不能直接反應療效的問題。鑒于文獻中黃槐酒的提取溶劑為酒，而古代所用的酒含醇量為20%左右，因此，本文采用20%乙醇作為提取溶劑，另外本實驗在單因素試驗基礎上，采用星點設計效應面法優(yōu)選黃槐復方的提取工藝。

1材料

SQP Satorious電子天平[賽多利斯科學儀器（北京）有限公司]；XFS280MB手提式壓力蒸汽滅菌器（浙江新豐醫(yī)療器械有限公司）；DH系列電熱恒溫箱（西安禾普生物科技有限公司）；醫(yī)用型潔凈工作臺（蘇州市金凈凈化設備科技有限公司）；HS3120超聲波清洗器（天津市恒奧科技發(fā)展有限公司）；702N Hamilton微量進樣器（瑞士哈美頓博納圖斯股份公司）；P230Ⅱ型高效液相色譜儀（大連依利特分析儀器有限公司）；DZF6050A 型真空干燥箱（北京中興偉業(yè)儀器有限公司）；BS6KH 型電子天平（上海友聲衡器有限公司）；FA2004 型電子分析天平（上海良平儀器儀表有限公司生產(chǎn)）。

黃芩、槐米藥材均購自四川省荷花池中藥材市場，經(jīng)成都大學劉濤研究員鑒定為唇形科黃芩植物的干燥根和豆科植物槐的干燥花蕾。黃芩苷對照品（批號150725，純度>98%，四川省維克奇生物科技有限公司）；蘆丁對照品（批號150622，純度>98%，四川省維克奇生物科技有限公司）；牛凝血酶試劑（上海經(jīng)科化學科技有限公司，批號T201503）；牛血纖維蛋白原試劑（上海經(jīng)科化學科技有限公司，批號F20150901）；生理鹽水（四川科倫藥業(yè)有限公司，批號B15042001）；黃槐合提、分提浸膏（由實驗室制得，批號分別為20160302，20160303）；甲醇為色譜純，水為娃哈哈純凈水，其余試劑均為分析純。

2方法與結果

21凝血活性的測定方法

211纖維蛋白原平板的制備取經(jīng)滅菌的直徑為10 cm的培養(yǎng)皿，分別加入1%瓊脂溶液25 mL、03%纖維蛋白原溶液20 mL，搖勻，靜置30 min使其凝固后，用打孔器打出直徑為3 mm的小孔，備用[5]。

212黃槐分提與合提的浸膏制備精密稱取黃芩100 g，槐米25 g，加入8倍量20%乙醇，提取3次，每次1 h，濾過，合并提取液，減壓濃縮干燥（60 ℃，-008 MPa），即得黃槐合提浸膏；精密稱取黃芩100 g，槐米25 g，分別加入8倍量20%乙醇，提取3次，每次1 h，濾過，分別合并提取液，減壓濃縮干燥（60 ℃，-008 MPa），即得黃槐分提浸膏。

213供試品溶液的制備精密稱取黃槐浸膏2份，每份1 g，置2個具塞錐形瓶中，分別加入生理鹽水、純凈水各10 mL，稱定質(zhì)量，超聲5 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用相應的試劑補足失重，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

214溶劑的考察分別精密移取2種供試品溶液、生理鹽水、純凈水各25 μL，進行同板點樣，同一板內(nèi)點樣2次，平行實驗2次。37 ℃恒溫培養(yǎng)17 h后測定沉淀圈的面積，見表1。實驗結果得到生理鹽水制備的供試品沉淀圈清晰可見且面積較大，空白樣品無干擾。故選用生理鹽水作為供試品制備的溶劑。

22標準曲線的繪制

分別精密移取04，4，8，12，16 U·mL-1凝血酶溶液25 μL，進行同板點樣（點入上述纖維平

板的小孔中），共點5次， 37 ℃恒溫培養(yǎng)17 h后測定沉淀圈的面積，以凝血酶濃度為橫坐標，沉淀圈面積為縱坐標，得線性方程為Y=1764X+4739，r=0997 5，結果表明，凝血酶在濃度為04～16 U·mL-1與沉淀圈面積呈良好的線性關系。

23精密度試驗

231同板精密度試驗分別精密吸取冷藏于4 ℃的10 U·mL-1凝血酶溶液25 μL，進行同板點樣（點入上述纖維平板的小孔中），共點6次，37 ℃恒溫培養(yǎng)17 h后測定沉淀圈的面積，計算RSD。結果RSD 49%，同板精密度良好。

232異板精密度試驗分別精密吸取冷藏于4 ℃的10 U·mL-1凝血酶溶液25 μL，進行異板點樣（點入上述纖維平板的小孔中），共點6次，37 ℃恒溫培養(yǎng)17 h后測定沉淀圈的面積，計算RSD。結果RSD 40%，異板精密度良好。

24重復性試驗

取同一批號的黃槐合提浸膏（批號20160302）1 g，精密稱定，按212項下方法，用生理鹽水作為溶劑，平行制備6份供試品溶液，分別精密吸取供試品溶液25 μL，進行同板點樣（點入上述纖維平板的小孔中），37 ℃恒溫培養(yǎng)，17 h后測定沉淀圈的面積，計算面積與取樣量的比值，并計算RSD。結果RSD 38%，重復性良好。

25穩(wěn)定性試驗

取同一批號的黃槐合提浸膏（批號20160302）1 g，精密稱定，按212項下方法，用生理鹽水作為溶劑，制備供試品溶液，分別于0，05，1，15，2，25 h進行同板點樣（點入上述纖維平板的小孔中），每次點樣量為25 μL，37 ℃恒溫培養(yǎng)，17 h后測定沉淀圈的面積，計算RSD。結果RSD 24%，穩(wěn)定性良好。

26加樣回收試驗

取同一批號的黃槐合提浸膏（批號20160302，活性292 U·g-1）6份，每份05 g，精密稱定，分別精密吸取2 U·mL-1凝血酶溶液1 mL，按212項下方法，用生理鹽水作為溶劑制備供試品溶液，分別精密吸取供試品溶液25 μL，進行同板點樣（點入上述纖維平板的小孔中），37 ℃恒溫培養(yǎng)，17 h后測定沉淀圈的面積，計算加樣回收率。結果平均回收率為1038%，RSD 47%。表明本方法回收率良好。

27黃槐復方的提取路線的篩選

按照相同的生藥量分別精密稱取黃槐合提浸膏1 g，黃槐分提浸膏（黃芩浸膏078 g，槐米浸膏019 g）于2個具塞錐形瓶中，精密移取生理鹽水10 mL于2個錐形瓶中，稱定質(zhì)量，超聲5 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用相應的試劑補足失重，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，分別精密移取2種供試品溶液、生理鹽水、10 U·mL-1凝血酶各25 μL，進行同板點樣，同一板內(nèi)點樣2次，平行試驗2次。37 ℃恒溫培養(yǎng)17 h后測定沉淀圈的面積。結果黃槐合提浸膏的沉淀圈面積為3881 mm2，分提浸膏的沉淀圈面積為3453 mm2，表明黃槐合提浸膏的凝血作用強于分提浸膏的凝血作用，因此選用合提的方式。

28混合對照品的活性標準曲線的制備及其活性測定

分別精密移取質(zhì)量濃度為2016，4032，6048，8064，1008 g·L-1的混合對照品溶液及空白溶劑各25 μL，進行同板點樣（點入上述纖維平板的小孔中），共點6次，37 ℃恒溫培養(yǎng)17 h后測定沉淀圈的面積，以對照品濃度為橫坐標，沉淀圈面積為縱坐標，得線性方程為Y=0799X+8694，r=0995 5，結果表明，黃芩苷、蘆丁在總濃度為2016～10080 g·L-1與沉淀圈面積呈良好的線性關系，空白無干擾。表明后續(xù)的提取工藝可以以黃芩苷、蘆丁的提取轉移率指標進行研究。利用黃芩苷、蘆丁的含量來反映其凝血活性的大小，測得其活性為1921 U·g-1。

29黃芩苷、蘆丁的測定

291色譜條件Hypersil ODS2色譜柱（46 mm×250 mm，5 μm），流動相甲醇1%冰醋酸溶液（31∶69），檢測波長257 nm，進樣量10 μL，見圖1。

292對照品溶液的制備取黃芩苷對照品、蘆丁對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含0165 mg黃芩苷、0088 6 mg蘆丁的混合對照品溶液，即得。

293黃槐復方提取液供試品溶液的制備精密量取黃槐復方提取液1 mL至25 mL量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，即得。

294線性關系考察分別配制黃芩苷、蘆丁混合對照品溶液，其中蘆丁質(zhì)量濃度為0008 86，0044 3，0088 6，0177 2，0265 8，0310 1 g·L-1，黃芩苷質(zhì)量濃度為0016 5，0082 5，0165，033，0495，0577 5 g·L-1，按照291項下色譜條件進樣，測定峰面積。以峰面積為縱坐標（Y），黃芩苷、蘆丁進樣濃度為橫坐標（X），繪制標準曲線，得蘆丁的回歸方程為Y=18 211X-7928，r=0999 0，表明蘆丁在 0008 86～0310 1 g·L-1進樣濃度與峰面積呈良好的線性關系；黃芩苷的回歸方程為Y=12 548X+3468，r=0999 0，表明黃芩苷在0016 5～0577 5 g·L-1進樣濃度與峰面積呈良好的線性關系。

210浸膏得率的測定

精密量取黃槐復方提取液 100 mL，置已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中蒸干，于105 ℃干燥 3 h，置干燥器中冷卻30 min，迅速精密稱重，計算浸膏得率。浸膏得率=浸膏質(zhì)量/藥材總質(zhì)量×100%。

211單因素試驗

2111乙醇濃度考察鑒于文獻中黃槐酒的提取溶劑為酒[2]，因此，本文采用乙醇作為提取溶劑。稱取黃芩50 g，槐米125 g，平行8份，分別加入8倍10%，20%，30%，40%，50%，60%，70%，80%乙醇，分別提取3 次，每次提取1 h，合并提取液，濾過，測定其黃芩苷、蘆丁提取轉移率[6]以及浸膏得率，結果按黃芩苷提取轉移率蘆丁提取轉移率浸膏得率=5∶3∶2進行綜合評分計算[78]，結果見圖2。結果表明，隨著乙醇濃度增加，綜合評分隨之下降，30%乙醇時，綜合評分最高為9925。因此將乙醇濃度定為30%。

2112提取次數(shù)考察稱取黃芩50 g，槐米125 g，平行5份，分別加入8倍30%乙醇，分別提取1，2，3，4，5次，每次提取時間為1 h，合并提取液，濾過，測定其黃芩苷、蘆丁提取轉移率以及浸膏得率，按綜合評分計算，結果見圖2。結果表明，隨著提取次數(shù)的增加，綜合評分隨之先是上升后下降，當提取次數(shù)為3次時，分數(shù)最高為8831。結合工業(yè)生產(chǎn)的實際，同時由于提取次數(shù)為非連續(xù)變量，回歸處理較困難，因此將提取次數(shù)定為3次。

2113乙醇用量考察稱取黃芩50 g，槐米125 g，平行8份，分別加入6，8，10，12，16，20，24，30倍30%乙醇，提取3次，每次1 h，合并提取液，濾過，取濾液測定其黃芩苷、蘆丁提取轉移率以及浸膏得率，按綜合評分計算，結果見圖2。結果表明，隨著溶劑用量的增加，綜合評分分數(shù)先是隨之增加，后隨之下降。當溶劑用量達到8時，分數(shù)最高為9231。因此選擇8倍的溶劑用量。

2114提取時間考察稱取黃芩50 g，槐米125 g，平行5份，分別加入8倍30%乙醇，提取3次，每次提取時間分別為05，1，15，2，25 h，合并提取液，濾過，測定其黃芩苷、蘆丁提取轉移率以及浸膏得率，按綜合評分計算，結果見圖2。結果表明，隨著提取時間的延長，綜合分數(shù)隨之上升后又下降，當提取時間為15 h時，綜合評分分數(shù)最高為9883，因此選擇提取時間為15 h。

212星點設計效應面優(yōu)化提取工藝

2121因素與水平的確定根據(jù)單因素試驗結果，選取乙醇用量（6～10倍）、提取時間（05～25 h）、乙醇濃度（10%～50%），提取次數(shù)為3次。根據(jù)星點設計的原理，每因素設5水平，用代碼值-α，-1，0，1，α來表示（2因素設計的α=1732）。代碼值所表示的實際操作物理量表見表

2。將黃芩苷的提取轉移率、蘆丁的提取轉移率及浸膏得率數(shù)值進行綜合評分[911]，而本試驗要求黃芩苷和蘆丁的提取轉移率及浸膏得率越高越好，結果見表3。

2122模型擬合采用DesignExpertV806（1）軟件，以各綜合評分值對自變量進行多元線性回歸和二項式擬合。得多元線性方程：Y=64902 58+8908 56X2+0230 95X3 （r=0532 6， P<005），二項式方程：Y=221939 55-40926 90X1+17469 11X2-0170 48X3-0952 02X1X2+ 0016 187X1X3-0132 86X2X3+ 2661 15X12+1013 77X22 +0007 853 66X32（r=0780 9，P<0000 1），根據(jù)

統(tǒng)計軟件對各項系數(shù)進行的t檢驗結果，刪除P>05的項后，再進行二項式方程擬合，達到簡化模型目的。所得方程為Y=219721 14-40002 52X1 +8908 56X2+0230 95X3 +2544 47X12（r=0749 4，P<005）。從擬合方程的相關系數(shù)可見，多元線性回歸方程的相關系數(shù)較低，而多元二項式擬合方程相關系數(shù)較高，擬合效果較好。

2123效應面優(yōu)化及預測性評價根據(jù)優(yōu)化后的二項式方程，運用DesignExpertV806（1）軟件繪制評價指標隨因素變化的三維效應面圖和等高線圖，見圖3～5。

從效應面和等高線圖可知，最優(yōu)區(qū)域綜合評分值>85，當X1的取值在6～8倍，X2的取值在2～25 h，X3的取值在38%～50%時，綜合評分值落在最高效應值區(qū)間。進一步通過DesignEXpertV806（1）軟件預測分析，獲得一組綜合評分響應值最大的優(yōu)化條件：X1為6倍，X2為2 h，X3為40%，選擇最佳提取工藝為加6倍量40%乙醇，提取3次，每次2 h。

213驗證試驗

稱取黃芩50 g，槐米125 g，平行3組，按優(yōu)選的提取工藝進行驗證試驗，并將預測值與實測值進行偏差計算，結果見表4。可知，預測值與實測值間的偏差為628%，表明采用星點設計效應面法選擇的黃槐復方提取工藝重復性好，建立的數(shù)學模型具有較好的預測性，擬合結果合理、可靠。

214驗證工藝浸膏凝血活性測定

按照相同的生藥量分別精密稱取3批黃槐浸膏09 g，于3個具塞錐形瓶中，精密移取生理鹽水10 mL于3個錐形瓶中，稱定質(zhì)量，超聲5 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用相應的試劑補足失重，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，分別精密移取3種供試品溶液、生理鹽水、10 U·mL-1凝血酶各25 μL，進行同板點樣，37 ℃恒溫培養(yǎng)17 h后測定沉淀圈的面積。平行試驗3次。結果RSD為59%，表明星點設計效應面選出的工藝浸膏凝血活性較好，可以用于黃槐復方的提取，見表5。

3討論

目前中藥復方的提取工藝優(yōu)選的主要指標為指標性成分含量及其轉移率，但指標性成分含量不能直接反映中藥復方的藥效，纖維蛋白原平板法測定凝血活性的重復性好，準確性高，操作簡單，直觀，穩(wěn)定，測定結果能有效反映中藥復方的藥效。

黃槐復方來源于明朝武之望的經(jīng)典名著《濟陰綱目》，臨床主要用于瀉火止血，婦女崩漏所致大出血。在預實驗中，本研究將其與宮血寧膠囊等7 個上市品種的凝血功能進行了對比研究，研究結果表明黃槐浸膏的日用量的活性為8428 U，而已上市品種中最大的活性藥品為斷血流膠囊，其活性為7898 U，與本品活性8428 U相比，本方的活血功能較強，提示有較好的開發(fā)價值。由于本文研究對象為復方整體凝血活性，對于復方中具凝血活性的成分有待進一步研究。

在預實驗中，黃芩苷、蘆丁混合對照品顯示出較好的凝血活性，呈現(xiàn)出較好的量效關系，表明可以以蘆丁、黃芩苷的提取轉移率為指標進行后續(xù)提取精制工藝研究。

本實驗在單因素實驗基礎上，采用星點設計效應面法得出乙醇濃度、提取時間、溶劑用量3個因素對黃槐復方中黃酮類成分提取百分含量的效應趨勢，優(yōu)化了黃槐復方的提取工藝條件。從對本次實驗數(shù)據(jù)所繪制的曲面圖可以看出，提取時間對考察指標影響較大，而溶劑用量和乙醇濃度對考察指標的影響較小。對于此最優(yōu)工藝實測評分值約為88，不及單因素考察中最優(yōu)處方評分值高，可能存在著因素間的互相作用，另一方面，本文是在考慮了實際大生產(chǎn)過程中節(jié)約溶劑、時間、成本等因素，選擇了此工藝。

在進行供試品溶劑考察研究中發(fā)現(xiàn)，分別用水和生理鹽水溶解浸膏，得到的2種溶液性狀均未見不溶物，而空白試驗表明，2種溶劑均未有沉淀圈，其面積相差較大的原因，有待進一步研究，另外，需要考慮影響實驗結果的因素，包括避免高溫使酶失活等相關降低酶活性的因素，兼顧各種溶液混合順序、試液的配制操作、點樣濃度等。經(jīng)過預試驗確定本文中纖維蛋白原測定的各種參數(shù)，結果表明該方法穩(wěn)定，重復性較強，提示體外活性評價法可作為黃槐復方提取工藝參數(shù)優(yōu)選的指標。

經(jīng)查閱大量文獻，發(fā)現(xiàn)對黃槐復方止血功效的研究報道較少，本研究基于纖維蛋白原平板法，建立了測定中藥復方中間體的凝血活性的方法，彌補了中藥復方提取工藝優(yōu)選中篩選指標的不足，是一種易于推廣的實驗方法，能為以后篩選中藥生產(chǎn)工藝路線提供參考。

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[責任編輯孔晶晶]

[收稿日期]20160907

[基金項目]四川省千人計劃項目（2013332）

[通信作者]*劉濤，研究員級高級工程師，研究方向為中成藥質(zhì)量再評價研究，Email：liutao0578@sinacom

[作者簡介]李鵬程，碩士研究生， Email：sigualpc@sinacom