天山雪蓮細(xì)胞液體懸浮培養(yǎng)基的優(yōu)化研究

孫國(guó)政，馬江,2，曹磊,2，陸攀科,2，羅俏俏,2，張忠明,2

1.甘肅隴域商貿(mào)有限公司，蘭州，730030；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，蘭州，73000

天山雪蓮系菊科多年生草本植物，由于出色的抗炎、抗腫瘤及抗疲勞活性，幾個(gè)世紀(jì)以來(lái)天山雪蓮一直是傳統(tǒng)的名貴中藥材[1-2]。分布于高山雪線附近，生存環(huán)境惡劣。在自然條件下，雪蓮種子萌發(fā)及幼苗成活率低于5%[3]。雪蓮組織培養(yǎng)主要采用其莖尖或葉片進(jìn)行繁育，然而雪蓮對(duì)生長(zhǎng)環(huán)境要求高，對(duì)運(yùn)輸和保存過(guò)程中的溫度和濕度控制不易把握，獲得莖尖和葉片等器官在時(shí)間和地域上都具有一定的局限性[4]。

植物細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)是指將植物細(xì)胞或較小的細(xì)胞團(tuán)懸浮在液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，在培養(yǎng)過(guò)程中能夠保持良好的分散狀態(tài)[5]。與固體培養(yǎng)相比，液體懸浮培養(yǎng)有良好的混合、流動(dòng)性能及更高的傳質(zhì)效率。目前這項(xiàng)技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于細(xì)胞的形態(tài)、生理、遺傳、凋亡等研究工作，特別是為基因工程在植物細(xì)胞水平上的操作提供了理想的材料和途徑。在雪蓮細(xì)胞液體懸浮培養(yǎng)中，培養(yǎng)條件對(duì)細(xì)胞的增殖具有關(guān)鍵作用[6]。

本試驗(yàn)優(yōu)化了雪蓮細(xì)胞液體懸浮培養(yǎng)基，以期為雪蓮細(xì)胞的大規(guī)模液體懸浮培養(yǎng)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

從天山雪蓮?fù)庵搀w誘導(dǎo)得到的愈傷組織，經(jīng)過(guò)反復(fù)篩選得到了現(xiàn)在的高產(chǎn)細(xì)胞系。

液體懸浮培養(yǎng)培養(yǎng)基：MS培養(yǎng)基，不加瓊脂，pH 5.8。

MS母液、6-BA溶液、NAA溶液、蔗糖、瓊脂、NaOH、95%乙醇、升汞、赤霉素GA3。

1.2 儀器與設(shè)備

HWS26型電熱恒溫水浴鍋，上海一恒科技有限公司；AL204電子天平，梅特勒–托利多儀器上海有限公司；GZX-GF101-Ⅱ電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司；NRY-200恒溫?fù)u床，上海南榮實(shí)驗(yàn)室設(shè)備有限公司；TGL-20M高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)，長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；SW-CJ-ZFD型雙人單面凈化工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞液體培養(yǎng)

采用接種量為2.5g/L，培養(yǎng)基裝量為250mL三角瓶裝有50mL培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)中搖床轉(zhuǎn)速為110～120轉(zhuǎn)/分鐘，培養(yǎng)溫度為25℃，光照時(shí)間16h/d。取液體培養(yǎng)13天的細(xì)胞培養(yǎng)液離心后，用蒸餾水沖洗三次，置于60℃烘箱中烘干24h，測(cè)定細(xì)胞干重和黃酮含量。

1.3.2 氮源對(duì)雪蓮細(xì)胞生長(zhǎng)及黃酮含量的影響

調(diào)節(jié) MS 培養(yǎng)基中的總氮（NH4NO3和 KNO3）濃度分別為 25、30、35、40、45、50、55 mmol/L，培養(yǎng)后測(cè)定雪蓮細(xì)胞干重和黃酮含量，考察氮源對(duì)雪蓮細(xì)胞生長(zhǎng)和黃酮合成的影響。

1.3.3 碳源對(duì)雪蓮細(xì)胞生長(zhǎng)及黃酮含量的影響

分別采用葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖和可溶性淀粉作為碳源，質(zhì)量濃度均為30 g/L，培養(yǎng)后測(cè)定雪蓮細(xì)胞干重和黃酮含量，考察不同種類碳源對(duì)雪蓮細(xì)胞生長(zhǎng)和黃酮合成的影響。

1.3.4 蔗糖濃度對(duì)雪蓮細(xì)胞生長(zhǎng)及黃酮含量的影響

采用蔗糖作碳源，使質(zhì)量濃度分別為 25、30、35、40、45、50、55 g/L，培養(yǎng)后測(cè)定雪蓮細(xì)胞干重和黃酮含量，考察蔗糖濃度對(duì)雪蓮細(xì)胞生長(zhǎng)和黃酮合成的影響。

1.3.5 培養(yǎng)基 pH值對(duì)雪蓮細(xì)胞生長(zhǎng)及黃酮含量的影響

調(diào)節(jié)培養(yǎng)基 pH值，使其分別為3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5，培養(yǎng)后測(cè)定雪蓮細(xì)胞干重和黃酮含量，考察不同培養(yǎng)基pH對(duì)雪蓮細(xì)胞生長(zhǎng)和黃酮合成的影響。

1.3.6 正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇總氮濃度、蔗糖濃度和pH 3個(gè)影響因素進(jìn)行正交試驗(yàn)，以進(jìn)一步優(yōu)化培養(yǎng)基的成分，提高雪蓮細(xì)胞中黃酮的含量。

1.3.7 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

準(zhǔn)確稱取0.1g蘆丁，置500 mL燒杯中，加入乙醇溶解，制得質(zhì)量濃度為0.2 g/L的蘆丁對(duì)照品溶液。準(zhǔn)確量取蘆丁對(duì)照品溶液0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL分別置于10 mL量瓶中，分別加乙醇溶液至3.0 mL，加5%亞硝酸鈉溶液0.3 mL，搖勻，放置6min，加10% A1(NO)3溶液0.3 mL，搖勻，放置6 min，最后加1 mol/L NaOH 溶液4 mL，再加去離子水稀釋至刻度線，搖勻，放置15 min，在 510 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸收度，以吸收度為縱坐標(biāo)，對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.8 黃酮含量的測(cè)定

將干燥的天山雪蓮培養(yǎng)物分別用粉碎機(jī)粉碎，過(guò)80目篩。各稱取0.50g干燥粉末，置于錐形瓶中，加入乙醇至60mL，稱重。超聲萃取90 min，取出，補(bǔ)足重量，過(guò)濾，收集濾液，乙醇補(bǔ)充損失體積，所得溶液即為供試品溶液，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。取供試品溶液各1 mL分別置于10 mL量瓶中，加乙醇溶液至3.0 mL，加5%亞硝酸鈉溶液 0.3 mL，搖勻，放置6 min，加10% Al(NO) 3溶液0.3 mL，搖勻，放置6 min，最后加1 mol/L NaOH 溶液4 mL，再加去離子水定容至10 mL，搖勻，放置15 min，在510nm 波長(zhǎng)處測(cè)定其吸收度，計(jì)算黃酮的含量[7]。

2 結(jié)果與分析

2.1 氮源對(duì)雪蓮細(xì)胞生長(zhǎng)及黃酮含量的影響

表1 氮源對(duì)雪蓮細(xì)胞生長(zhǎng)及黃酮含量的影響

氮是一種重要的大量元素，其與植物生長(zhǎng)和基因表達(dá)的信號(hào)傳導(dǎo)有關(guān)，硝態(tài)氮（NO3-）可提高氨基酸和蛋白質(zhì)量，改變激素量，同時(shí)調(diào)節(jié)碳代謝，從而影響總黃酮的生物合成[8]。由表1可以看出，隨著總氮濃度的升高，細(xì)胞干重先升高后降低，在35 mmol/L時(shí)，細(xì)胞干重達(dá)到最大，而后逐漸下降；細(xì)胞中的黃酮含量的變化趨勢(shì)與細(xì)胞干重的變化類似，在總氮濃度為35 mmol/L時(shí)，黃酮含量達(dá)到最大（65.5 mg/g），而后逐漸下降，當(dāng)總氮濃度升高到55mmol/L時(shí)，黃酮含量為58.8 mg/g。綜合考慮，應(yīng)該選擇總氮濃度在35～45mmol/L。

2.2 碳源對(duì)雪蓮細(xì)胞生長(zhǎng)及黃酮含量的影響

表2 碳源對(duì)雪蓮細(xì)胞生長(zhǎng)及黃酮含量的影響

碳源是植物組織培養(yǎng)不可缺少的物質(zhì)，其不僅能給外植體提供能量，而且也能維持一定的滲透壓[9]。由表2可以看出，不同碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)雪蓮細(xì)胞時(shí)細(xì)胞生長(zhǎng)和黃酮產(chǎn)生有一定差異，效果最好的是蔗糖，培養(yǎng)后的細(xì)胞干重為25.3g/L，此時(shí)對(duì)應(yīng)的黃酮含量最高，達(dá)到65.1mg/g；效果最差的是可溶性淀粉，培養(yǎng)后的細(xì)胞干重為11.3g/L，此時(shí)對(duì)應(yīng)的黃酮含量降為55.1mg/g；葡萄糖、果糖和乳糖的效果較為接近。綜合考慮，應(yīng)該選擇蔗糖作為碳源。

2.3 蔗糖濃度對(duì)雪蓮細(xì)胞生長(zhǎng)及黃酮含量的影響

表3 蔗糖濃度對(duì)雪蓮細(xì)胞生長(zhǎng)及黃酮含量的影響

碳源的種類及碳源的濃度大小不僅影響細(xì)胞的生長(zhǎng)速度，而且還影響細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)和總黃酮的生物合成[10]。由表3可以看出，不同蔗糖濃度的培養(yǎng)基中培養(yǎng)雪蓮細(xì)胞時(shí)細(xì)胞生長(zhǎng)和黃酮產(chǎn)生有一定差異；隨著蔗糖濃度的增大，細(xì)胞干重先升高后降低，在蔗糖濃度為35 g /L時(shí)，細(xì)胞干重達(dá)到最大（25.6 g/L），而后逐漸下降，當(dāng)蔗糖濃度增大到55 g /L時(shí)，細(xì)胞干重降到15.1 g/L；細(xì)胞中的黃酮含量的變化趨勢(shì)與細(xì)胞干重的變化類似，在蔗糖濃度為35g /L時(shí)，黃酮含量達(dá)到最大（65.6 mg/g），而后逐漸下降，當(dāng)蔗糖濃度升高到55 g /L時(shí)，黃酮含量降為55.9mg/g。綜合考慮，應(yīng)該選擇的蔗糖濃度為30～40 g /L。

2.4 培養(yǎng)基 pH值對(duì)雪蓮細(xì)胞生長(zhǎng)及黃酮含量的影響

表4 培養(yǎng)基 pH對(duì)雪蓮細(xì)胞生長(zhǎng)及黃酮含量的影響

培養(yǎng)基pH值會(huì)影響其礦質(zhì)元素的存在狀態(tài)，從而影響植物對(duì)元素的吸收和利用[11]。由表4可以看出，不同pH值的培養(yǎng)基中培養(yǎng)雪蓮細(xì)胞時(shí)細(xì)胞生長(zhǎng)和黃酮產(chǎn)生有一定差異；隨著pH值的升高，細(xì)胞干重先升高后降低，在pH值為5.5時(shí)，細(xì)胞干重達(dá)到最大（25.5 g/L），而后逐漸下降，當(dāng)pH值升高到7.5時(shí)，細(xì)胞干重降到10.7 g/L；細(xì)胞中的黃酮含量的變化趨勢(shì)與細(xì)胞干重的變化類似，在pH值為5.5時(shí)，黃酮含量達(dá)到最大（65.2 mg/g），而后逐漸下降，當(dāng)pH值為7.5時(shí)，黃酮含量降到49.1 mg/g。綜合考慮，應(yīng)該選擇的pH值范圍為5.0～6.0。

2.5 正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇總氮濃度、蔗糖濃度和pH 3個(gè)影響因素進(jìn)行正交試驗(yàn)，以進(jìn)一步優(yōu)化培養(yǎng)基成分。正交試驗(yàn)因素水平表見(jiàn)表5，正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表6。

表5 培養(yǎng)基優(yōu)化的正交設(shè)計(jì)因素水平表

表6 培養(yǎng)基優(yōu)化的正交設(shè)計(jì)及結(jié)果表

從極差分析可知，總氮濃度、蔗糖濃度和pH三因素對(duì)黃酮量的影響大小為A＞B ＞C，最佳培養(yǎng)基成分的組合為A2B1C1，即總氮濃度為40 g/L、蔗糖濃度為30 g/L、培養(yǎng)基pH為5.0為最佳條件。

2.6 驗(yàn)證試驗(yàn)

由于最佳組合不在正交表中，因此選取最佳組合A2B1C1進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，3次重復(fù)試驗(yàn)的結(jié)果見(jiàn)表7。

由表7可以看出，在此培養(yǎng)基中培養(yǎng)13天后，得到的細(xì)胞干重平均為25.9g/L，細(xì)胞黃酮含量平均為93.23mg/g，說(shuō)明了試驗(yàn)結(jié)果具有可靠性。

3 結(jié)語(yǔ)

通過(guò)單因素試驗(yàn)研究了不同培養(yǎng)條件對(duì)天山雪蓮細(xì)胞懸浮培養(yǎng)時(shí)干重和總黃酮含量的影響。結(jié)果表明，MS培養(yǎng)基中不同總氮濃度、蔗糖濃度、pH值下，天山雪蓮細(xì)胞懸浮培養(yǎng)時(shí)干重和總黃酮含量均有一定差異。正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，最優(yōu)的培養(yǎng)基為：MS培養(yǎng)基中總氮濃度為40 mmol /L、蔗糖濃度為30 g/L、培養(yǎng)基pH為5.0。在此條件下培養(yǎng)13天，雪蓮細(xì)胞干重平均為25.9 g/L，細(xì)胞黃酮含量平均為93.23mg/g。