馬鈴薯干腐病拮抗菌Pseudomonas sp.YL11發(fā)酵液理化性質(zhì)測(cè)定及發(fā)酵條件優(yōu)化

張紊瑋，王艷玲，贠建民

1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院 甘肅 蘭州 730070；2.蘭州理工大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院 甘肅 蘭州 730050

馬鈴薯干腐病是一種由鐮刀菌引起的田間和儲(chǔ)藏期都普遍發(fā)生的病害，主要引起塊莖腐爛，致使馬鈴薯品質(zhì)降低，嚴(yán)重影響了其食用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值 [1]。我國(guó)是馬鈴薯生產(chǎn)大國(guó)，隨著“馬鈴薯主糧化戰(zhàn)略”的提出，馬鈴薯種植面積在逐年擴(kuò)大，干腐病的發(fā)生也越來(lái)越嚴(yán)重，常年發(fā)病率高達(dá)30%，由此造成馬鈴薯產(chǎn)量損失40%-50%[2]。甘肅是我國(guó)馬鈴薯主產(chǎn)區(qū)之一，硫色鐮刀菌、腐皮鐮刀菌和接骨木鐮刀菌是造成馬鈴薯干腐病的優(yōu)勢(shì)病原菌[3,4]。目前，對(duì)馬鈴薯干腐病以化學(xué)防治為主，化學(xué)農(nóng)藥雖然短期有效，但長(zhǎng)期反復(fù)施用，會(huì)造成藥劑殘留、產(chǎn)生耐藥性菌株以及環(huán)境污染等問(wèn)題而逐漸受到限制[5,6]。因此，使用高效、合理、環(huán)保的方法控制病害的發(fā)生顯得尤為重要，生物防治便成了國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)[7-9]。

生物防治在農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中是一種很有前景的防治方法，這種從自然界中分離、篩選有益微生物并用于病原菌的拮抗、病害控制的防治方法，具有高效、無(wú)毒、無(wú)殘留等特點(diǎn)[10]。拮抗菌株用于生物防治時(shí)，首先要考慮該菌株易于實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，同時(shí)要求菌劑具有穩(wěn)定性好、活性高、環(huán)保等特點(diǎn)[11-13]。為此，本試驗(yàn)以前期分離獲得的一株對(duì)馬鈴薯干腐病病原菌——硫色鐮刀菌有拮抗作用的Pseudomonas sp.YL11為研究對(duì)象，進(jìn)行發(fā)酵液抑菌成分理化性質(zhì)的探索，并以LB培養(yǎng)基作為YL11菌株發(fā)酵條件優(yōu)化的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，通過(guò)添加輔助碳源、氮源及無(wú)機(jī)鹽，對(duì)溫度、pH值、轉(zhuǎn)速、接種量、裝液量及培養(yǎng)時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化，旨在為該菌株的田間應(yīng)用和活性產(chǎn)物的開(kāi)發(fā)提供必要的前期基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株

菌株P(guān)seudomonas sp.YL11為甘肅定西地區(qū)馬鈴薯根際土壤中分離獲得；供試病原真菌硫色鐮刀菌（Fusarium sulphureum）由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)采后生物學(xué)與技術(shù)實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.2 培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200g、葡萄糖20g、瓊脂20g、蒸餾水1000mL，pH自然，121℃高壓滅菌20min。

LB培養(yǎng)基：蛋白胨10g、酵母提取物5g、氯化鈉10g、瓊脂15g、蒸餾水1000mL，pH7.0，121℃高壓滅菌20min。

LB液體培養(yǎng)基：LB固體培養(yǎng)基中不加瓊脂。

1.3 方法

1.3.1 預(yù)處理

1.3.1.1 指示菌的活化

將在PDA培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)7d的F. sulphureum用無(wú)菌水沖洗孢子，制備孢子懸浮液，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，調(diào)整孢子濃度為1.5×105CFU/mL，分裝至1mL，無(wú)菌離心管中于4℃保存，一周內(nèi)使用[14]。

1.3.1.2 供示菌的活化

將-20℃保藏Pseudomonas sp.YL11菌株在LB固體培養(yǎng)基上劃線，30℃培養(yǎng)48h，挑單菌落接種到LB液體培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)24h，反復(fù)傳代接種培養(yǎng)3～4次。

1.3.1.3 無(wú)菌發(fā)酵液的制備

Pseudomonas sp.YL11發(fā)酵液10000r/min離心15min后，收集上清液即為發(fā)酵上清液。將上清液用0.22μm無(wú)菌濾膜過(guò)濾，收集濾液即為無(wú)菌發(fā)酵液。

1.3.2 菌株P(guān)seudomonas sp. YL11代謝產(chǎn)物理化性質(zhì)測(cè)定

1.3.2.1 熱穩(wěn)定性測(cè)定

將發(fā)酵液分別置于30℃，50℃，60℃，70℃，80℃，90℃，100℃下處理30min，未經(jīng)處理的發(fā)酵液作對(duì)照，以F.sulphureum為指示菌，牛津杯法測(cè)抑菌活性。

1.3.2.2 pH穩(wěn)定性測(cè)定

將發(fā)酵液用0.5M HCl和0.5M NaOH處理依次調(diào)節(jié)pH至3，4，5，6，7，8，9，10，靜置2h后將pH調(diào)回自然pH（原始發(fā)酵液pH值為7），未經(jīng)處理的發(fā)酵液作對(duì)照，以F. sulphureum為指示菌，牛津杯法測(cè)抑菌活性。

1.3.2.3 紫外光照穩(wěn)定性測(cè)定

將發(fā)酵液分裝于1.5mL離心管中置于20W紫外燈下距離20cm處敞口照射1h，2h，4h，6h，8h，10h，12h后，未經(jīng)處理的發(fā)酵液作對(duì)照，以F. sulphureum為指示菌，牛津杯法測(cè)抑菌活性。

1.3.3 培養(yǎng)基組分的優(yōu)化

在LB培養(yǎng)基中，以酵母提取物為基本碳源物質(zhì)，分別添加1%的其他碳源物質(zhì)（葡萄糖、蔗糖、淀粉、乳糖、麥芽糖）；以蛋白胨為基本氮源物質(zhì)，分別添加1%其他氮源物質(zhì)（尿素、硫酸銨、硝酸銨、磷酸二氫銨、磷酸氫二銨）；以氯化鈉為基本無(wú)機(jī)鹽，分別添加0.5%其他無(wú)機(jī)鹽（氯化鉀、硫酸鎂、氯化鎂、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉），以不額外添加碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽的LB液體培養(yǎng)基作對(duì)照，30℃，120r/min振蕩培養(yǎng)4d后，測(cè)定發(fā)酵上清液對(duì)F. sulphureum的抑菌活性，每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.3.4 發(fā)酵條件的優(yōu)化

在上述最佳培養(yǎng)基基礎(chǔ)上，在裝液量為30mL/100mL、轉(zhuǎn)速120r/min和30℃條件下分別改變培養(yǎng)基的發(fā)酵時(shí)間（12h、24h、36h、48h、60h、72h、96h、100h、120h）、發(fā)酵溫度（25℃、28℃、30℃、37℃、40℃）和初始pH值（pH5、pH5.5、pH6、pH6.5、pH7、pH7.5、pH8），以發(fā)酵液對(duì)F. sulphureum的抑菌活性為指標(biāo)，確定最佳發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度和pH值。在篩選出最佳pH值、發(fā)酵溫度和發(fā)酵時(shí)間的條件下改變接種量（1%、3%、5%、7%、9%）、裝液量（10 mL、20 mL、30 mL、40 mL、50mL/100mL）、轉(zhuǎn)速（100、120、150、180r/min），以發(fā)酵液對(duì)F. sulphureum的抑菌活性為指標(biāo)，確定最佳接種量、裝液量和轉(zhuǎn)速。同時(shí)用分光光度法測(cè)定波長(zhǎng)600nm處的吸光度值，每個(gè)處理重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵液理化性質(zhì)

2.1.1 熱穩(wěn)定性

YL11發(fā)酵液代謝產(chǎn)物具有較好的熱穩(wěn)定性，經(jīng)過(guò)30℃-50℃各處理30min后活性基本保持穩(wěn)定，60℃-80℃各處理30min活性略有降低，抑菌活性為對(duì)照的90.1%-87.3%。90℃-100℃各處理30min活性下降的比較明顯，抑菌活性為對(duì)照的63.9%-59.1%。

2.1.2 pH穩(wěn)定性

在pH值低于4時(shí)，發(fā)酵液抑菌活性完全喪失，表明發(fā)酵液代謝產(chǎn)物對(duì)酸敏感；pH4-5范圍和pH9-10范圍內(nèi)活性均有降低，抑菌活性為對(duì)照的45.1%-88.7%。pH6-8的范圍內(nèi)活性保持穩(wěn)定，說(shuō)明YL11適合于中性或弱堿性環(huán)境，分離純化的最佳pH為6-8之間。

2.1.3 紫外光照穩(wěn)定性

在紫外光下連續(xù)照射12h后，YL11發(fā)酵液活性基本保持不變，抑菌活性仍然能達(dá)到對(duì)照的83.7%，表明YL11發(fā)酵液具有良好的紫外光照穩(wěn)定性。

2.2 發(fā)酵培養(yǎng)基組分的優(yōu)化

由圖1可見(jiàn)，葡萄糖作為輔助碳源時(shí)發(fā)酵液的抑菌活性最高，抑菌圈直徑達(dá)到26.7mm，利用麥芽糖和蔗糖的發(fā)酵液抑菌活性相當(dāng)不存在顯著性差異p＞0.05，抑菌圈分別為25.2mm和24.9mm，其次是淀粉。表明YL11利用單糖的能力要強(qiáng)于二糖和多糖，所以選擇葡萄糖為最佳碳源。

由圖2可見(jiàn)，當(dāng)磷酸二氫銨作為輔助氮源時(shí)，發(fā)酵液抑菌活性最大，抑菌圈直徑為28.0mm，表明對(duì)磷酸二氫銨的利用效率最高。尿素最低，抑菌圈直徑為22.9mm，甚至低于LB基本培養(yǎng)基對(duì)照（25.4mm），可能尿素不利于YL11對(duì)氮源的利用或者產(chǎn)生了其他化學(xué)物質(zhì)抑制了其抑菌活性產(chǎn)物的活性。

由圖3可見(jiàn)，當(dāng)硫酸鎂作為輔助無(wú)機(jī)鹽時(shí)，抑菌活性最高，抑菌圈直徑達(dá)到29.7mm，所以選擇硫酸鎂為發(fā)酵液的無(wú)機(jī)鹽。因此，以LB培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，確定YL11的最佳配方組成為：葡萄糖1%，酵母提取物0.5%，蛋白胨1%，磷酸二氫銨1%，氯化鈉1%，硫酸鎂0.5%。抑菌圈大小為29.7mm，采用傳統(tǒng)LB培養(yǎng)基，抑菌圈大小為25.4mm，由此可見(jiàn)，培養(yǎng)基優(yōu)化后能明顯提高發(fā)酵液的抑菌活性。

圖2 不同氮源對(duì)YL11抑菌活性的影響Fig.2 Effect of nitrogen source on the antagonistic activity of YL11

圖3 不同無(wú)機(jī)鹽對(duì)YL11抑菌活性的影響Fig.3 Effect of inorganic salt on the antagonistic activity of YL11

2.3 發(fā)酵條件的優(yōu)化

由圖4可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，抑菌活性逐步增大，發(fā)酵時(shí)間為100h時(shí)，抑菌活性最高，抑菌圈直徑為30.7mm，而后隨著時(shí)間延長(zhǎng)抑菌活性逐漸下降。發(fā)酵時(shí)間短，抑菌活性物質(zhì)產(chǎn)量低，抑菌性能低；發(fā)酵時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，抑菌活性也逐漸下降，可能原因是隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，YL11菌體的大量繁殖及營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)的逐步消耗，菌體開(kāi)始衰老、自溶，所以確定發(fā)酵時(shí)間為100h。

圖4 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)YL11生長(zhǎng)及抑菌活性的影響Fig.4 Effect of fermentation time on the growth and antagonistic activity of YL11

由圖5可知，YL11菌株在25℃-40℃時(shí)均可產(chǎn)生抑菌活性物質(zhì)。在28℃時(shí)，抑菌活性最大，抑菌圈直徑為30.7mm，37℃及40℃時(shí)，抑菌活性均有降低，這可能是溫度升高不利于YL11菌體生長(zhǎng)所致。所以確定發(fā)酵溫度為28℃。

由圖6可知，發(fā)酵液初始pH在5和8時(shí)對(duì)活性物質(zhì)的影響較小，當(dāng)初始發(fā)酵液pH為7時(shí)抑菌活性最大，抑菌圈直徑為30.7mm，在弱酸及弱堿條件下抑菌活性均有輕微下降。所以確定發(fā)酵pH為7。

圖5 溫度對(duì)YL11生長(zhǎng)及抑菌活性的影響Fig.5 Effect of temperature on the growth and antagonistic activity of YL11

圖6 不同初始pH值對(duì)YL11生長(zhǎng)及抑菌活性的影響Fig.6 Effect of initial pH on the growth and antagonistic activity of YL11

由圖7可知，YL11發(fā)酵液的接種量在1%-9%范圍內(nèi)均能達(dá)到較高的抑菌效果，當(dāng)接種量為3%時(shí)抑菌圈直徑最大，達(dá)到30.7mm，接種量大于3%時(shí)，菌株生物量及抑菌活性開(kāi)始逐漸降低，確定接種量為3%。

由圖8可知，在100mL的錐形瓶中裝液量為30mL，發(fā)酵液抑菌活性最強(qiáng)，隨著裝液量的增加，發(fā)酵液抑菌活性逐漸降低，說(shuō)明搖瓶?jī)?nèi)空氣含量對(duì)YL11產(chǎn)活性代謝產(chǎn)物影響較大，但過(guò)低的裝液量會(huì)導(dǎo)致?tīng)I(yíng)養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)不足菌體生物量下降進(jìn)而影響抑菌活性。所以確定裝液量為30ml。

圖7 接種量對(duì)YL11生長(zhǎng)及抑菌活性的影響Fig.7 Effect of inoculation amount on the growth and antagonistic activity of YL11

圖8 裝液量對(duì)YL11生長(zhǎng)及抑菌活性的影響Fig.8 Effect of liquid volume on the growth and antagonistic activity of YL11

由圖9可知，YL11菌株的生物量隨轉(zhuǎn)速的增加先增加后減少，在轉(zhuǎn)速120r/min時(shí)生物量和抑菌活性均達(dá)到峰值，轉(zhuǎn)速進(jìn)一步增大菌體生物量略有下降，抑菌活性略有升高，表明高轉(zhuǎn)速對(duì)菌體結(jié)構(gòu)產(chǎn)生破壞從而導(dǎo)致活性物質(zhì)釋放。120r/min-180r/min均不存在顯著性差異p＞0.05，綜合考慮，選擇120r/min為最佳搖床轉(zhuǎn)速。

圖9 搖床轉(zhuǎn)速對(duì)YL11生長(zhǎng)及抑菌活性的影響Fig.9 Effect of rotational speed on the growth and antagonistic activity of YL11

3 結(jié)論與討論

本研究以前期分離獲得的一株對(duì)馬鈴薯干腐病病原菌——F. sulphureum有拮抗作用的Pseudomonas sp.YL11為研究對(duì)象，對(duì)發(fā)酵液理化性質(zhì)進(jìn)行測(cè)定，并以LB培養(yǎng)基作為YL11菌株發(fā)酵條件優(yōu)化的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，通過(guò)添加輔助碳源、氮源及無(wú)機(jī)鹽，對(duì)溫度、pH值、轉(zhuǎn)速、接種量、裝液量及培養(yǎng)時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化。

結(jié)果表明：YL11抑菌活性成分具有較好的熱穩(wěn)定性，經(jīng)過(guò)30℃-50℃各處理30min后活性基本保持穩(wěn)定，60℃-80℃各處理30min活性略有降低，抑菌活性為對(duì)照的90.1%-87.3%；pH6-8的范圍內(nèi)活性保持穩(wěn)定，適合于中性或弱堿性環(huán)境；紫外燈照12h后抑菌活性基本不變，仍然能達(dá)到對(duì)照的83.7%，具有良好的紫外光照穩(wěn)定性。

最佳培養(yǎng)基配方為：葡萄糖1%，酵母提取物0.5%，蛋白胨1%，NH4H2PO4 1%，NaCl 1%，MgSO4 0.5%，發(fā)酵溫度28℃，初始pH7，接種量3%，裝液量30 mL /100mL，搖床轉(zhuǎn)速120r/min，發(fā)酵時(shí)間100h，在此條件下發(fā)酵上清液對(duì)F. sulphureum的抑菌活性最強(qiáng)，抑菌圈直徑達(dá)到30.7mm，與優(yōu)化前25.4mm相比，顯著提高了抑菌效果，為今后工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)和參考。本研究?jī)H探討了拮抗菌株發(fā)酵培養(yǎng)的條件及其影響因素，我們今后將對(duì)抑菌機(jī)制及活性物質(zhì)的分離提取進(jìn)行系統(tǒng)的研究，為馬鈴薯干腐病的生物防治打下基礎(chǔ)。

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