孫超，董坤，馬英麗

(黑龍江中醫(yī)藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040)

木犀草苷對HUVECs抗氧化損傷保護作用研究

孫超，董坤，馬英麗*

(黑龍江中醫(yī)藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040)

目的:采用過氧化氫(H2O2)體外誘導人臍靜脈內皮細胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)損傷，構建HUVECs氧化損傷模型，觀察蓬子菜中木犀草苷對損傷HUVECs的保護及損傷修復作用，并初步探討其作用機制。方法:采用體外培養(yǎng)HUVECs，取對數期的細胞調整細胞密度為5×103/mL，置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細胞增殖到80%左右時，將細胞隨機分為5組:空白組、模型組(僅加入濃度為200 μmol/L的H2O2培養(yǎng)2 h)，給藥保護組(質量濃度分別為6.25、12.5、25 mg/L的木犀草苷培養(yǎng)24 h，之后加入濃度為200 μmol/L的H2O2培養(yǎng)2 h)，每組設6個復孔。采用CCK8法檢測細胞增殖抑制率，熒光分光光度法測定超氧化物歧化酶(SOD)，谷胱甘肽(GSH-Px)的活性以及丙二醛(MDA)的含量;采用紫外分光光度法測定乳酸脫氫酶(LDH)的釋放。Hoechst33328熒光染色觀察木犀草苷對過氧化氫誘導的臍靜脈內皮細胞損傷的影響。結果:與正常組比較，模型組培養(yǎng)液中LDH含量明顯增加;SOD，GSH-Px活性降低，MDA含量明顯升高(P均＜0.01)。與模型組比較，給藥各劑量組(6.25、12.5、25 mg/L)都能顯著提高H2O2損傷的細胞的存活率，明顯抑制HUVECs的LDH的釋放，顯著減少HUVECs的MDA的含量，提高SOD的活性。結論:蓬子菜木犀草苷對氧化損傷的HUVECs具有保護及修復作用。

蓬子菜;木犀草苷;氧化損傷

血管疾病的臨床學研究發(fā)現(xiàn)，血管內皮細胞作為細胞與血液的屏障不僅具分泌的功能，還參與血管生理學功能的調節(jié)。血管內皮細胞的損傷是引起多種血管疾病(如心腦血管疾病，靜脈血栓等)的重要原因之一［1］。氧化應激產生的活性氧被認為是導致血管內皮細胞損傷的主要因素，因此抗氧化損傷方面的研究對治療心，腦血管疾病具有重要的意義［2-3］。在木犀草苷的研究過程中發(fā)現(xiàn)，木犀草苷有直接清除活性氧自由基的作用，能提高體內抗氧化酶的活性，降低過氧化物質生成［4］，臨床上應用木犀草苷治療下肢靜脈血栓取得了良好的療效［5］。本實驗通過體外建立過氧化氫損傷模型，探討木犀草苷對HUVECs的保護、損傷及修復的作用機理。

1 材料與儀器

1.1 材料

木犀草苷(本實驗室自提分離得到);人臍靜脈內皮細胞(哈爾濱醫(yī)科大學實驗室提供);RPMI 1640培養(yǎng)基(Life Technologies Corporation);胰酶細胞消化液(碧云天生物技術研究所);CCK-8細胞增殖-毒性檢測試劑盒(日本同仁化學研究所);PBS(北京中杉金橋生物技術有限公司);丙二醛MDA試劑盒、超氧化物歧化酶SOD試劑盒、乳酸脫氫酶LDH試劑盒、谷胱甘肽-過氧化物酶GSH-Px(南京建成生物工程研究所)。

1.2 儀器

超凈工作臺BSC-1300IIB2(蘇州安泰空氣技術有限公司);CO2恒溫培養(yǎng)箱(Heal Force，HF90);倒置顯微鏡(日本奧林巴斯公司，CKX41);電熱恒溫水浴鍋(HHS，上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠);多功能酶標儀(美國伯騰儀器有限公司，Synergy 2);套筒式微量冷凍離心機(天美科學儀器有限公司，MX-307);微孔濾膜(0.22 μm，AMRESCO公司)。

2 實驗方法

2.1 CCK8酶標法檢測不同濃度木犀草苷對HUVECs生長的影響

實驗分為正常對照組，不同濃度木犀草苷處理組(3.25、6.25、12.5、25、50、100 mg/L)。取對數期HUVECs，用胰酶消化后并吹打均勻以3×104每孔接種于96孔板中，于37°C、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜;用含10%牛血的1640培養(yǎng)液稀釋木犀草苷原液配成濃度3.25、6.25、12.5、25、50、100 mg/L工作液;將不同濃度的木犀草苷工作液加入96孔板中，繼續(xù)培養(yǎng)24 h;棄掉上清液，每孔加入20 μl CCK-8放回培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)30 min，酶標儀450 nm處檢測。

2.2 HUVECs氧化損傷模型的建立

人臍靜脈內皮細胞以3×103/ml接種于96孔板，實驗分為空白對照組、過氧化氫損傷組(100、200、400、800 μmol/L)。每組設6個副孔。空白對照組每孔加入200μl無血清的1640培養(yǎng)液;過氧化氫各損傷組加入200μl無血清培養(yǎng)液配制的終濃度為100、200、400、800 μmol/L的H202;分別培養(yǎng)1 h、2 h、6 h、12 h、24 h后，吸棄舊培養(yǎng)基，每孔加入20 μl CCK-8(mg/mL)，置于孵箱中孵育30 min，于酶標儀450 nm處讀取吸光度值，計算過氧化氫對細胞的抑制率。通過對細胞抑制率的計算從而確定過氧化氫損傷模型的最適條件。

抑制率(%)=1-［各組吸光度值(A)/空白組吸光度值(A)］×100%

2.3 木犀草苷預處理對過氧化氫誘導臍靜脈內皮細胞活力值的影響

取對數生長期的細胞，調整細胞密度為每孔3× 103個接種于96孔板，放置培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。實驗分組為空白組，模型組和給藥組(6.25、12.5、25 mg/L)在給藥24 h之后，加入濃度為200 μmol/L的 H2O2培養(yǎng)1 h。去除培養(yǎng)板中上清液，每孔分別加入20 μl CCK-8試劑，放置培養(yǎng)箱培養(yǎng)30 min，使用酶標儀在450 nm處檢測其OD值。

2.4 測定HUVECs中的SOD活性GSH-Px的活性

取對數生長期的細胞，調整密度為每孔3×103個接入96孔板中，貼壁培養(yǎng)24 h。實驗設空白組，模型組，給藥組(6.25、12.5、25 mg/L)每組設6個副孔，給藥24 h后，按H2O2損傷濃度為200 μmol/L損傷2 h，按照SOD和MDA試劑盒說明書，利用酶標儀分別檢測SOD的活力和MDA的分泌水平。

2.5 測定臍靜脈內皮細胞(HUVECs)中MDA和上清液中LDH的釋放量

同“2.4”項處理相同后，按試劑盒說明書的要求操作，最后利用酶標儀分別對細胞內的GSH-Px和上清液中的LDH進行測定。

2.6 Hoechst33328染色觀察細胞形態(tài)學變化

實驗開始之前，提前將蓋玻片放在70%乙醇中提前浸泡一段時間，無菌超凈臺上吹干后用PBS反復清洗3次。將處理過的蓋玻片放入6孔板內，每孔可平行放入3個蓋玻片，接入密度為5×105個/mL的內皮細胞，酒精消毒后放置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。吸出培養(yǎng)液加入含有木犀草苷(6.25、12.5、25 mg/L)的1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。待細胞增殖至80%左右時，采用含有過氧化氫的1640培養(yǎng)基刺激細胞發(fā)生凋亡。用移液槍吸盡培養(yǎng)液，每塊蓋玻片上滴入一滴固定液固定15 min。吸除固定液，用 PBS反復清洗3遍，每次2 min(洗滌時用手動搖晃數次)。加入0.5 mL Hoeehst33258染色液染色，避光染色10 min(染色時也應手動搖晃數次)染色后吸除染色液，用PBS清洗3次，每次2 min。在載玻片上滴一滴封片液熒光淬滅，將含有染好顏色細胞的蓋玻片蓋在載玻片上。(盡量避免氣泡生成)調整熒光顯微鏡，采用CCD數碼相機照相，采用圖像分析處理軟件NIS-Element:BR3.0處理。

3 結果

3.1 不同濃度木犀草苷對HUVECs生長的影響

結果見表1，與正常組比較，3.125、6.25、12.5、25、50、100、200、400 mg/L作用細胞24 h，其中6.25、12.5、25 mg/L作用后的細胞活力值明顯上升，3.25 mg/mL作用細胞后未見明顯提高，50、100、200 mg/L作用細胞后呈現(xiàn)抑制細胞增殖的趨勢，當給藥濃度為400 mg/L時，與空白組比，細胞活力值明顯降低，表明高濃度木犀草苷抑制細胞的生長。結合實驗操作及臨床應用藥物適用范圍，后續(xù)試驗選用藥物濃度為6.25、12.5、25 mg/L。

表1 不同濃度Luteoloside對HUVECs活力值的影響(±s)

表1 不同濃度Luteoloside對HUVECs活力值的影響(±s)

C(μg/mL) Time(h) OD Proliferation(%) 0 24 1.126±0.003 100 3.125 24 1.114±0.015 101.33 6.25 24 1.159±0.001 102.93 12.5 24 1.163±0.055 103.29 25 24 1.180±0.052 104.80 50 24 1.118±0.052 99.29 100 24 1.061±0.058 94.23 200 24 1.052±0.036 93.43 400 24 0.858±0.036 76.20

3.2 HUVECs氧化損傷模型的建立

CK-8檢測結果顯示，隨著過氧化氫濃度的升高，臍靜脈內皮細胞(HUVECs)抑制率逐漸升高(表2)。當過氧化氫濃度為200 μmol/L，作用時間2 h時，細胞抑制率為51.29%，過氧化氫濃度為400 μmol/L時，細胞抑制率為 72.13%。當過氧化氫濃度達到 800μmol/L時，細胞抑制率可達到92.77%。隨著作用時間的延長，細胞抑制率明顯增高，當作用時間為12 h時，過氧化氫損傷濃度為200 μmol/L時，細胞抑制率為 94.58%、濃度為 400 μmol/L時，抑制率為96.59%、濃度為800 μmol/L時，抑制率為98.17%，即細胞趨于全部死亡。因此過氧化氫濃度為200 μmol/L，作用2 h時，抑制率為50%作用為理想造模條件。

表2 Influence of H2O2on HUVECs(n=6，±s)

表2 Influence of H2O2on HUVECs(n=6，±s)

濃度(μmol/L)1 h 2 h 6 h 12 h 24 h 100 25.15 37.73 45.54 52.83 66.02 200 40.15 51.29 78.99 94.58 95.52 400 60.15 72.13 95.65 96.59 98.29 800 85.70 92.77 95.71 98.17 99.52

3.3 木犀草苷預處理對過氧化氫誘導臍靜脈內皮細胞活力值的影響

結果見表3，CCK-8檢測結果顯示:Luteoloside預處理組細胞活力值均高于過氧化氫模型組(P＜0.05)，其中Luteoloside(6.25、12.5、25 μg/mL)三個濃度組對過氧化氫誘導的HUVECs增殖作用顯著(P＜0.01)，并隨著給藥濃度的增大，對過氧化氫誘導的細胞活力值下降具有明顯的上調作用。木犀草苷高劑量組(50、100 μg/mL)細胞活力值也高于模型組，但其差異微弱，不具有統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。在預處理12～72 h不同條件下，給藥組對過氧化氫誘導的細胞活力值下降都具有上調趨勢，其作用顯著(P＜0.01)，但不同時間的條件沒有顯著性差異(P＞0.05)，因此在后續(xù)的實驗研究中選擇藥物作用時間為24 h。

表3 不同濃度的Luteoloside對氧化損傷的HUVECs增值的作用(±s)

表3 不同濃度的Luteoloside對氧化損傷的HUVECs增值的作用(±s)

注:與H2O2組比較，*P＜0.05，＊＊P＜0.01;與Control比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。

組別 OD Inhibitory rate(%) Control 2.188±0.063 0 H2O2組 1.370±0.024△△46.21 Luteoloside(3.125 ug/mL)+H2O 1.499±0.008＊＊39.20 Luteoloside(6.25 ug/mL)+H2O21.581±0.009＊＊34.33 Luteoloside(12.5 ug/mL)+H2O21.599±0.038＊＊33.31 Luteoloside(25 ug/mL)+H2O21.679±0.039＊＊28.79 Luteoloside(50 ug/mL)+H2O21.496±0.012＊＊39.14 Luteoloside(100 ug/mL)+H2O21.452±0.021*41.63

3.4 木犀草苷對HUVECs中的SOD活性及GSH-Px活性的影響

結果見圖1～2。木犀草苷各藥物濃度組和空白組的SOD、GSH-Px活性明顯高于過氧化氫損傷組(P＜0.01);隨著藥物濃度的增加，SOD活性有逐漸升高的趨勢，藥物組之間兩兩比較，木犀草苷低濃度組與中濃度組比較，中濃度組與高濃度組比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，低濃度組與高濃度組比較差異顯著(P＜0.01)。

圖1 Luteoloside對氧化損傷HUVEC細胞培養(yǎng)液中SOD活性的影響(±s)

圖2 Luteoloside對氧化損傷HUVEC細胞培養(yǎng)液中GSH-Px活性的影響(±s)

3.5 木犀草苷對受損HUVECs中MDA和LDH含量的影響

結果見圖3～4。與空白組比較，模型組細胞上清液中MDA含量明顯高于空白對照組(P＜0.01)。與模型組比較，藥物組中MDA的含量明顯低于模型組(P＜0.01)，Luteoloside能明顯降低細胞培養(yǎng)液中MDA的含量(P＜0.01)，并隨著給藥濃度的增高，抑制脂質過氧化產物(MDA)合成的能力逐漸增強。給藥物組各個濃度組間比較，其差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。

圖3 Luteoloside對氧化損傷HUVEC細胞培養(yǎng)液中MDA含量的影響(±s)

圖4 Luteoloside對氧化損傷HUVEC細胞上清液中LDH含量的影響(±s)

3.6 各組熒光顯微鏡結果

結果如圖5所示:在熒光顯微鏡下觀察，空白組細胞形態(tài)正常，結構完整，細胞與細胞之間排列緊湊，分布均勻，染色均勻且程度較淺，在視野中呈現(xiàn)淺藍色染核形態(tài)。與空白組比較，模型組細胞體積明顯縮小，細胞核會呈碎塊狀致密濃染，顏色有些發(fā)白部分細胞呈亮藍色濃染并有熒光小體產生。與模型組相比，木犀草苷保護組熒光小體較少，細胞結構比較正常，排列比較緊湊，細胞核染色呈淺藍色染核形態(tài)，凋亡細胞伴隨的細胞質染色即熒光小體隨著給藥濃度的增高，熒光小體逐漸減少，濃染細胞數量呈遞減趨勢，表明木犀草苷具有抑制過氧化氫誘導的臍靜脈內皮細胞凋亡的作用。

圖5 各組熒光顯微鏡結果

4 討論

蓬子菜資源豐富，民間藥用廣泛且藥用史長，其主要的化學成分為黃酮類、蒽醌類、環(huán)烯醚萜類、具有保護心腦血管、抗炎、抗血栓、止血、消腫、抗腫瘤、抗氧化等多種生物活性［6-10］。木犀草苷(luteoloside)即木犀草素-7-O-葡萄糖苷(luteolin-7-O-glucoside)，為黃酮類化合物，是一種廣譜、有效的抗氧化劑，其結構中含有多個酚羥基，可與氧自由基反應生成共振穩(wěn)定的半醌式自由基結構，阻斷自由基鏈式反應，并通過單電子轉移方式清除體內的自由基，提高抗氧化酶的活性，還原氧化物質，發(fā)揮其抗氧化的作用。本次試驗對超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性、丙二醛(MDA)及乳酸脫氫酶(LDH)的含量進行測定。實驗結果表明，與空白組比較，過氧化氫損傷模型組中SOD及GSH-Px活性顯著降低(P＜0.01)，而 MDA及上清液中的 LDH顯著增加(P＜0.01);與模型組比較，木犀草苷預處理各組SOD及GSH-Px活性明顯增高，而MDA和LDH含量顯著降低(P＜0.01)。表明木犀草苷具有提高HUVEC細胞抗氧化能力，減輕由自由基攻擊細胞膜引起的脂質過氧化損傷，減輕過氧化氫損傷HUVEC細胞程度。綜上所述木犀草苷可能具有升高氧化損傷的HUVECs中SOD、GSH-Px活性及降低MDA和LDH含量，對由過氧化氫造成的HUVECs氧化損傷具有保護作用。

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R28

A

1002-2406(2017)02-0005-04

國家自然科學基金項目(No.201281274034);教學部博士點博導類基金資助項目(No.20112327110006)

孫超(1989-)，男，碩士研究生，主要研究方向:中藥及復方藥效物質基礎。

馬英麗*(1954-)，女，教授，博士研究生導師，主要研究方向:中藥及復方藥效物質基礎和質量標準化研究。

2016-05-20

修回日期:2016-06-01