MC1R基因在不同毛色太行山羊皮膚組織中的表達

景炅婕，賈秀生，梁 琛，喬利英，潘洋洋，劉建華*

（1．山西農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，山西太谷 030801；2．山西省原平農(nóng)業(yè)學校，山西原平，034100）

MC1R基因在不同毛色太行山羊皮膚組織中的表達

景炅婕1，賈秀生2，梁 琛1，喬利英1，潘洋洋1，劉建華1*

（1．山西農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，山西太谷 030801；2．山西省原平農(nóng)業(yè)學校，山西原平，034100）

本研究旨在研究太行山羊MC1R基因在不同毛色皮膚組織中的表達規(guī)律。運用RT-PCR方法從純黑色太行山羊皮膚組織中擴增了MC1R基因的編碼區(qū)序列，運用生物信息學方法分析了其編碼蛋白的結(jié)構(gòu)特點，利用實時熒光定量PCR技術(shù)，對4種不同毛色（純黑、純白、黃褐、黑斑白）各4只太行山羊，共計16個個體的皮膚組織進行mRNA表達研究。結(jié)果表明：MC1R基因CDS區(qū)長954 bp，編碼317個氨基酸，其編碼蛋白是G蛋白偶聯(lián)受體家族的成員；同源性比對和進化樹結(jié)果顯示，與綿羊、家牛和水牛同源性較高；熒光定量結(jié)果顯示，MC1 RmRNA在純黑色個體皮膚組織中表達量最高，黃褐色次之。本研究結(jié)果為進一步研究該基因在毛色形成中的作用以及對純黑色太行山羊的純繁選育奠定基礎(chǔ)。

太行山羊；MC1R基因；序列特征；mRNA表達

太行山羊是山西省優(yōu)良品種，其蹄質(zhì)堅實，四肢強健。特別是純黑色個體的胴體脂肪分布均勻，蛋白質(zhì)含量高達20%，脂肪低于3%，膽固醇含量僅為60 mg/kg，富含15種氨基酸，特別是人體必需氨基酸尤為豐富。但是多年來大規(guī)模無序地引種和雜交，使其毛色混雜，性能退化。為改善這一現(xiàn)狀并保護這一珍貴的地方品種資源，培育肉用型純黑色太行山羊新品系具有重要的現(xiàn)實意義和應(yīng)用價值。

作為一種直觀表型性狀，毛色往往是品種選育的重點之一。真黑素和褐黑素在黑色素細胞中合成量及轉(zhuǎn)化的不同會導致哺乳動物皮膚和毛發(fā)顏色的不同[1-2]，其產(chǎn)生及轉(zhuǎn)化的過程是由少數(shù)幾個候選基因決定的，MC1R（Melanocortin1 Receptor）基因就是其中之一 。MC1R基因又叫促黑素細胞激素受體（Melanocyte Stimulating Hormone ReceptorMC1RMSHR）基因，由毛色擴展位點（ExtensionMC1RE）編碼，編碼蛋白是最小的G蛋白偶聯(lián)受體（G Protein-Coupled ReceptorMC1RGPCR）家族成員[3]。很長一段時間，大多數(shù)GPCR基因被認為無內(nèi)含子，作為GPCR的一員，MC1R基因最初也被認為只有一個外顯子[4]，編碼區(qū)長954 bp，編碼317個氨基酸，被稱為是最經(jīng)典的一種轉(zhuǎn)錄本形式，即MC1R-001（ID: ENST00000555147）。但是，近些年研究發(fā)現(xiàn)，約有一半的GPCR基因至少含有1個內(nèi)含子，并可以進行選擇性剪接[5]。有研究報道，人MC1R基因包含4個外顯子，且報道了該基因的另一種拼接形式MC1R-002（ID: ENST00000555427），其CDS區(qū)長1 152 bp，與經(jīng)典的轉(zhuǎn)錄本相比，在C-末端第316位的Ser之后還有一個66個氨基酸殘基的延伸[6]。2006年，MC1R基因的另一種剪接體也被報道[7]，和MC1R-002一樣，均編碼382個氨基酸，不同的是，位于5′端的外顯子剪接到了一個不同的受體位點，將其命名為MC1R350。但是，非經(jīng)典的MC1R剪接體形式的功能仍不明確。

目前，國內(nèi)外學者在人[8]、鼠[9]、雞[10]、波爾山羊[11]等許多物種的研究中都發(fā)現(xiàn)，MC1R基因的多態(tài)性與人的毛發(fā)及動物不同毛色相關(guān)，在牛上還發(fā)現(xiàn)，除與毛色性狀相關(guān)外，MC1R基因還與荷斯坦奶牛產(chǎn)奶量[12]以及牛乳中乳蛋白含量[13]相關(guān)。鑒于MC1R基因在毛色形成過程中的重要作用，其常被用來作為毛色研究的重要候選基因。

本文以太行山羊MC1R基因為研究對象，擴增了其純黑色個體MC1R基因的編碼區(qū)序列，并對其編碼蛋白的結(jié)構(gòu)進行了生物信息學分析，同時探討了其mRNA在不同毛色太行山羊皮膚組織中的差異表達，為深入研究MC1R基因?qū)γ纬傻淖饔脵C理提供理論依據(jù)，并通過毛色的選擇為純黑色太行山羊的純繁選育奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1．1 實驗動物和材料 選取山西省沁水縣同一個養(yǎng)殖場同一圈舍生活環(huán)境和飼養(yǎng)條件均一致的純黑、純白、黃褐和黑斑白毛色太行山羊各4只，用取皮器從每個個體臀部取約1 cm2皮膚組織，迅速放入已處理的凍存管并立即置于液氮中，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1．2 實驗設(shè)計和方法

1．2．1 主要試劑 大連TaKaRa 公司：PrimeScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser和 SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒。北京CWBIO公司：DNA marker 2000和2×Taq PCR MasterMix（含染料）。

1．2．2 RNA提取及反轉(zhuǎn)錄 Trizol法提取太行山羊不同毛色皮膚組織總RNA，并測定其濃度和純度。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒步驟進行反轉(zhuǎn)錄。4℃保存反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。

1．2．3 引物設(shè)計與合成 用Primer 3 plus在線軟件，依據(jù)NCBI上已公布的家牛MC1R序列（登錄號：NM_174108．2）和綿羊MC1R序列（登錄號：NM_001282528．1）設(shè)計5對引物，用來擴增純黑色太行山羊MC1R基因的編碼區(qū)序列。根據(jù)擴增出的編碼區(qū)序列設(shè)計熒光定量引物。選用RPL13和18SrRNA為內(nèi)參基因。表1為引物序列、退火溫度及PCR產(chǎn)物長度。

1．2．4 普通PCR擴增測序 反應(yīng)體系：1 μL cDNA模板、8 μL 2×MasterMix、上下游引物各1．2 μL，補ddH2O至15 μL。PCR擴增條件：94℃ 2 min；94℃ 30 s，退火30 s，72℃ 30 s，35個循環(huán)；最后72℃延伸5 min。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物，得到清晰且長度準確的目的條帶割下并裝入1．5 mL滅菌EP管內(nèi)備用測序，測序由北京華大基因公司完成。最后，用Contig Express軟件對測序獲得結(jié)果進行比對拼接。

1．2．5 生物信息學分析方法 在線軟件ProtParam（http://web．expasy．org/protparam/）分析太行山羊 MC1R蛋白理化性質(zhì)；DNAMAN軟件對太行山羊和其他8個物種MC1R氨基酸序列進行同源性比對；在線分析軟件SignalP（http://www．cbs．dtu．dk/ services/SignalP/）預(yù)測該蛋白是否具有信號肽；在線分析軟件SCRATCH（http://scratch．proteomics．ics．uci．edu）預(yù)測該蛋白的二硫鍵組成；在線分析軟件TMHMM Server v．2．0（http://www．cbs．dtu．dk/ services/TMHMM/）預(yù)測其跨膜區(qū)結(jié)構(gòu)；用MEGA6．05軟件對包括太行黑山羊在內(nèi)的9個物種MC1R氨基酸序列進行遺傳距離進化樹的構(gòu)建；在線軟件Motif Scan（http://myhits．isb-sib．ch/cgi-bin/motif_ scan）預(yù)測該蛋白質(zhì)潛在功能基序；在線分析軟件NetNGlyc1．0（http://www．cbs．dtu．dk/services/ NetNGlyc/）、NetOGlyc4．0（http://www．cbs．dtu．dk/services/NetOGlyc/）和NetPhos 2．0（http:// www．cbs．dtu．dk/services/Net-Phos/）分別預(yù)測其N-糖基化位點、O-糖基化位點和磷酸化位點；在線分析軟件CSS-palm 2．0（http://www．csspalm．biocuckoo．org/）預(yù)測其棕櫚?；稽c。

1．2．6 qRT-PCR反應(yīng) 參照SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒：熒光定量qRT-PCR反應(yīng)體系：2 μL cDNA模板、10 μL SYBR?Premix Ex TapTMⅡ、0．4 μL ROX Reference DyeⅡ、上下游引物各0．8 μL、補6 μL ddH2O至20 μL。PCR擴增條件：95℃預(yù)變性30 s；95℃預(yù)變性5 s，60℃退火及延伸34 s，44個循環(huán)。

1．3 數(shù)據(jù)計算和統(tǒng)計方法 qRT-PCR反應(yīng)選用RPL13和18SrRNA為內(nèi)參基因，每個樣品取3個重復，采用2-ΔΔCT法獲得目的基因mRNA的相對表達量。運用SPSS19．0軟件的一般線性模型過程對mRNA表達量進行單變量方差分析。配合如下模型分析不同毛色山羊皮膚MC1R的mRNA表達量：

式中，yij為mRNA表達量，Ci為第i種毛色（i=1，2，3，4；MC1R2…MC1R4），eij為殘差。數(shù)據(jù)表示為X±SX，各因素不同水平間的差異采用Duncan′s法進行多重比較。

2 結(jié) 果

2．1 太行黑山羊MC1R核苷酸及氨基酸序列進化樹分析

2．1．1 太行黑山羊MC1R基因cDNA序列分析 對測序后的序列進行拼接，獲得太行黑山羊MC1R基因954 bp的開放閱讀框，編碼317個氨基酸（圖1）。將得到的太行黑山羊MC1R基因序列，與綿羊（登錄號：NM_001282528．1）、水牛（登錄號：GU121238．1）和家牛（登錄號：NM_174108．2）的CDS序列進行BLAST比對，序列相似性分別為98%、96%和96%，判定該序列為純黑色太行山羊MC1R基因的編碼區(qū)序列。測序結(jié)果已提交至NCBI，獲得序列登錄號：KT247426。

圖1 太行山羊MC1R基因cDNA序列及其編碼氨基酸序列

2．1．2 太行黑山羊MC1R氨基酸序列相似性及聚類分析 對太行黑山羊MC1R氨基酸序列與其他8個物種進行相似性比對（圖2）并進行進化樹分析，結(jié)果均表明，太行黑山羊與綿羊親緣關(guān)系最近（圖3）。

2．2 太行黑山羊 MC1R蛋白生物信息學分析

2．2．1MC1R的基本理化性質(zhì) 對太行黑山羊 MC1R蛋白進行理化性質(zhì)分析，發(fā)現(xiàn)太行黑山羊MC1R的理論等電點pI為8．88，分子式為C1606H2580N412O409S22，總原子數(shù)為5 029個，相對分子量為34 909．9 ku。該蛋白的總平均親水性為0．888，脂溶指數(shù)為135．33，不穩(wěn)定指數(shù)為37．67，說明該蛋白是一種堿性穩(wěn)定的脂溶性疏水蛋白。

2．2．2 MC1R蛋白的結(jié)構(gòu)特點 經(jīng)在線分析軟件SignalP預(yù)測， MC1R蛋白無信號肽。在線分析軟件Motif Scan預(yù)測 MC1R蛋白的潛在功能基序包括：1個GPCR家族信號（130～146位）、1個GPCR家族標志位點（55～298位）和1個GPCR化學感受因子（49～313位）。同時，跨膜域分析軟件TMHMM Server v．2．0預(yù)測該蛋白具有7個跨膜結(jié)構(gòu)域（圖2方框區(qū)域），分別是由膜外到膜內(nèi)的位于第44～63、118～140、187～209、282～300位氨基酸和由膜內(nèi)到膜外的位于第76～98、161～183、245～267位氨基酸。由此，具有7次跨膜的 MC1R蛋白是GPCR家族的一員。

在線軟件Motif Scan預(yù)測的 MC1R蛋白的翻譯后修飾位點包括：2個N-糖基化位點（29～32位：NRTG、184～187位：NHTV）和3個酪蛋白激酶Ⅱ-磷酸化位點（39～42位：SIPD、52～55位：SLVE和308～311位：TLQE）。與在線軟件NetOGlyc4．0、NetNGlyc1．0和NetPhos 2．0預(yù)測的糖基化和磷酸化位點結(jié)果相結(jié)合發(fā)現(xiàn)， MC1R蛋白的氨基酸序列在第17位的蘇氨酸上存在潛在的O-糖基化作用、第29、184位的天冬酰氨存在潛在的N-糖基化作用（圖4A）且糖基化位點均位于膜外且具有5個潛在的磷酸化位點（Ser39MC1R52MC1R154、Tyr143和 Thr308）（圖4B），且第39、52、308位的氨基酸是酪蛋白激酶Ⅱ作用的磷酸化位點。

預(yù)測的MC1R棕櫚?；稽c的結(jié)果顯示，在第16、78、79、133、273、275位的半胱氨酸殘基是潛在的棕櫚?；稽c。預(yù)測該蛋白有5個二硫鍵，分別由16位和35位、253位和275位、267和273位、125位和133位以及191位和215位的半胱氨酸殘基組成。

2．3 不同毛色太行山羊MC1RmRNA的表達 對MC1RmRNA相對表達量的方差分析表明，在太行山羊不同毛色皮膚組織間存在差異但差異不顯著（P＞0．05），其中，純黑色個體皮膚組織中表達量最高，黃褐色次之，純白色和黑斑白的表達量較低，表達趨勢見圖5。

圖2 太行黑山羊與其他物種氨基酸序列比較

圖3 9個物種MC1R蛋白氨基酸序列構(gòu)建的NJ系統(tǒng)發(fā)生樹

圖4 預(yù)測的MC1R蛋白N-糖基化位點 (A) 和磷酸化位點 (B)

圖5 MC1RmRNA在太行山羊4種毛色皮膚組織中的表達量

3 討 論

3．1 MC1R核苷酸和氨基酸序列結(jié)構(gòu)預(yù)測與功能的關(guān)系 MC1R是GPCR家族中黑色素皮質(zhì)受體（Melanocortin ReceptorsMC1RMCRs）亞家族的一員。本研究測序獲得太行黑山羊MC1R基因CDS區(qū)長954 bp，編碼317個氨基酸，具有7個完整的跨膜片段，1個細胞外N-末端（存在一個潛在的N-糖基化位點Asn29），3個細胞外和細胞內(nèi)環(huán)路和1個位于胞質(zhì)的C-末端，這些氨基酸序列特征均與其作為GPCR家族成員相符[14]。且經(jīng)同源性比對發(fā)現(xiàn)，太行黑山羊MC1R基因CDS區(qū)序列與羊駝、綿羊、家牛、豬和水牛相似性高于84%，表明不同物種間MC1R基因序列在進化上具有相對保守性。

本研究預(yù)測到太行黑山羊 MC1R蛋白具有7個跨膜結(jié)構(gòu)域，是一個典型的跨膜蛋白，且亞細胞定位結(jié)果顯示，該蛋白60．9%的氨基酸序列位于細胞膜上，這與“ MC1R存在于黑色素細胞膜表面，作為一種細胞膜受體來發(fā)揮作用，進而調(diào)控真黑素合成”的功能相一致。但是，并未預(yù)測到信號肽結(jié)構(gòu)，這似乎與 MC1R蛋白作為一種跨膜蛋白合成后需靶向到膜上來發(fā)揮作用不相符。但有研究報道，許多GPCR都以二聚體或寡聚體的形式存在[15]。而這種二聚化作用與其合成后轉(zhuǎn)運到細胞膜表面的過程相關(guān)[16]。 MC1R在生物合成的早期會在粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中經(jīng)歷一個基本的二聚化作用[17]，其只有形成正確的二聚化受體，才能從粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上脫離，進而上膜表達，在膜上發(fā)揮作用[18]。同時，這種二聚化作用也會參與二硫鍵的形成[19]。二硫鍵的形成是蛋白質(zhì)折疊過程中關(guān)鍵的限速步驟，而蛋白質(zhì)的折疊對于其進入分泌途徑又相當重要[20]，因此，二硫鍵的形成對于 MC1R的分泌和表達也十分重要。本研究預(yù)測到該蛋白除在細胞膜上占據(jù)最多外，其次還有21．7%的氨基酸序列位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，與其在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上合成并進行二聚化作用相一致，同時，也預(yù)測到了5個二硫鍵，這些結(jié)構(gòu)的存在對于 MC1R的合成、分泌、轉(zhuǎn)運及表達都有重要意義。

被組裝在粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)之后，新合成的 MC1R會進行一系列的翻譯后修飾，其中最主要的是磷酸化修飾和棕櫚?；揎梉21]。蛋白質(zhì)的翻譯后修飾在生命體中具有重要作用。其中糖基化對于維持蛋白質(zhì)構(gòu)象的穩(wěn)定性具有重要作用[22]。特定氨基酸殘基的磷酸化對于 MC1R的轉(zhuǎn)運和在細胞表面的表達十分關(guān)鍵[23]。棕櫚?；揎検峭ㄟ^不穩(wěn)定的硫酯鍵共價連接到特定半胱氨酸上，用來調(diào)控蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)運及定位的修飾方式，過程是可逆的，通過這種可逆的棕櫚酰化-去棕櫚?；倪^程實現(xiàn)蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)運[24]。本研究中預(yù)測到太行黑山羊 MC1R蛋白具有5個潛在磷酸化位點，其中第39、52、308位的位點可能是酪蛋白激酶Ⅱ作用的磷酸化位點，這與MC1R蛋白通過激活酪氨酸激酶促進酪氨酸酶的合成，進而生成真黑素的機制是相符的。這些翻譯后的修飾位點對于維持 MC1R蛋白結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性、分泌和轉(zhuǎn)運以及功能的發(fā)揮都具有重要的作用。

3．2MC1RmRNA在不同毛色皮膚組織中的表達 對于人和動物，MC1R基因的研究都主要集中在其多態(tài)性與毛色表型的相關(guān)上。關(guān)于MC1RmRNA在不同毛色皮膚組織中表達量的研究較少，但是MC1RmRNA在不同毛色皮膚組織中表達量的差異對于研究其在毛色形成中的作用也十分重要。

有研究報道，哺乳動物MC1R基因主要在毛囊和皮膚黑色素細胞中表達[25]。MC1R基因的高表達有利于黑色素細胞中真黑素的形成，細胞中真黑素的含量較高就會使動物表現(xiàn)黑或褐的毛色類型[26]。本研究中，MC1RmRNA在不同毛色太行山羊皮膚組織中表達量有差異，但是差異不顯著，可能是由于樣本含量較小和統(tǒng)計分析誤差所致。其中，純黑色太行山羊皮膚組織中表達量最高，黃褐色次之，在純白色和黑斑白皮膚組織中表達量較低，與其高表達會使動物產(chǎn)生深色毛發(fā)類型相一致。這與任玉紅[25]在羊駝皮膚MC1RmRNA的研究中發(fā)現(xiàn)棕色羊駝表達量高于白色羊駝相符。

黑色皮膚對紫外線的吸收最強，有可能使細胞和皮膚受到傷害[27]。有研究表明，蛋白質(zhì)疏水氨基酸占比的增加，有利于提高蛋白的耐熱性[28]，可以抵抗皮膚產(chǎn)熱增多對細胞的傷害。本研究中預(yù)測到太行黑山羊 MC1R蛋白由于疏水性氨基酸亮氨酸、丙氨酸和纈氨酸含量較高，與上述結(jié)論相符。

4 結(jié) 論

太行黑山羊MC1R基因CDS區(qū)長度為954 bp，編碼317個氨基酸。作為GPCR家族的一員， MC1R蛋白在黑色素細胞內(nèi)通過激活細胞膜上的腺苷酸環(huán)化酶系統(tǒng)，參與黑色素的合成。MC1RmRNA在太行山羊不同毛色皮膚組織中的表達具有差異性，其中純黑色個體表達量最高，黃褐色次之，純白色較低，與其在黑色素細胞內(nèi)生成真黑素相符。這為進一步分析MC1R基因編碼蛋白結(jié)構(gòu)及其在黑色素細胞內(nèi)的合成與表達奠定理論基礎(chǔ)，為太行黑山羊的選育提純提供分子依據(jù)。

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The Expression ofMC1RGene in the Skin Tissues of Tai-hang Goat with Dif f erent Coat Colors

JⅠNG Jiong-jie1, JⅠA Xiu-sheng2, LⅠANG Chen1, QⅠAO Li-ying1, PAN Yang-yang1, LⅠU Jian-hua1*
(1.College of Animal Science and Technology, Shanxi Agricultural University, Shanxi Taigu 030801, China; 2.Yuanping Agricultural Academy of Shanxi Province, Shanxi Yuanping 034100, China)

This study aims to research the mRNA expression rules of Tai-hang goatMC1Rgene in skin tissues with dif f erent colors. The coding sequence (CDS) ofMC1Rgene was amplif i ed from skin tissues of Tai-hang goat with pure black color using reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR). Structural characteristics of coded protein were analyzed by bioinformatics methods. Sixteen Tai-hang goats with four kinds of coat colors (black, white, brown and white with black-spots, respectively) were chosen to study the mRNA expression in skin tissues using quantitative realtime PCR. Results showed that the length of complete CDS was 954 bp encoding a protein with 317 amino acids, and the encoded protein is a member of G protein-coupled receptor family. Results of homology alignment and evolutionary tree showed its high homologies with sheep, cattle and buf f alo.MC1RmRNA showed the highest expression in pure black skin tissues, followed by that in brown skin tissues. These results laid a foundation for further study on the role ofMC1Rgene in the formation of coat colors, and the pure breeding of black Tai-hang goat.

Tai-hang goat;MC1R; Sequence characteristics; mRNA expression

S827.2

A

10.19556/j.0258-7033.2017-03-033

2016-09-06；

2016-10-17

山西省科技攻關(guān)項目（20120312010-2）；科技部863子課題（2011AA100307-05）；山西省研究生優(yōu)秀創(chuàng)新項目（2015SY27）

景炅婕（1991-），女，山西沁水人，博士研究生，主要從事山羊的分子遺傳育種研究，E-mail：ycjingjiongjie@163．com

* 通訊作者：劉建華，E-mail: ljhbeth@163．com