郁宏偉, 鄭朝朝， 柳 珊， 劉 濤, 劉云濤， 鄒立宏

[1.瑞普(保定)生物藥業(yè)有限公司，河北保定071000； 2.河北省獸醫(yī)生物技術(shù)工程技術(shù)研究中心，河北保定071000]

規(guī)?；囵B(yǎng)豬瘟活疫苗生產(chǎn)工藝的試驗(yàn)

郁宏偉1,2, 鄭朝朝1,2， 柳 珊1,2， 劉 濤1,2, 劉云濤1,2， 鄒立宏1,2

[1.瑞普(保定)生物藥業(yè)有限公司，河北保定071000； 2.河北省獸醫(yī)生物技術(shù)工程技術(shù)研究中心，河北保定071000]

為建立一種快速、穩(wěn)定的規(guī)?；囵B(yǎng)豬瘟活疫苗的生產(chǎn)工藝，本試驗(yàn)將已感染豬瘟病毒的細(xì)胞直接接種到生物反應(yīng)器(工作體積為10 L)，收獲病毒液，制備成豬瘟活疫苗。研究結(jié)果顯示，接種帶毒細(xì)胞后培養(yǎng)3 d細(xì)胞數(shù)可增長(zhǎng)4～6倍，15 d可收獲毒液7次，病毒收獲量至少與600個(gè)10 L轉(zhuǎn)瓶單次收獲量相當(dāng)，產(chǎn)品各項(xiàng)檢測(cè)均合格。本試驗(yàn)所建立的生產(chǎn)工藝可大幅度縮短培養(yǎng)時(shí)間，提高生產(chǎn)效率，為規(guī)?；囵B(yǎng)工藝的推廣與使用提供了技術(shù)參數(shù)。

豬瘟 ； 規(guī)?；囵B(yǎng) ； 生物反應(yīng)器

豬瘟是由豬瘟病毒(CSFV)引起的豬的急性、熱性、高度接觸性傳染病，嚴(yán)重危害養(yǎng)豬業(yè)[1]。豬瘟被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織列為必須報(bào)告的動(dòng)物傳染病，中國(guó)也將其列為一類動(dòng)物疫病[2]。接種疫苗是預(yù)防和控制豬瘟的有效手段。近年來(lái)豬瘟常有免疫失敗的報(bào)道，究其原因疫苗的質(zhì)量與之有很大的關(guān)系[3]。豬瘟疫苗各生產(chǎn)廠家的水平參差不齊，經(jīng)常出現(xiàn)疫苗效價(jià)不穩(wěn)定，病毒滴度低等問題[4]。因此，本行業(yè)亟需提高疫苗產(chǎn)品質(zhì)量以滿足市場(chǎng)需要。應(yīng)用生物反應(yīng)器制備疫苗抗原已經(jīng)成為國(guó)內(nèi)各獸用生物制品生產(chǎn)企業(yè)關(guān)注和研究的焦點(diǎn)[5]。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、病毒及試驗(yàn)動(dòng)物 豬睪丸細(xì)胞(ST)，購(gòu)自廣東永順生物制藥股份有限公司；豬瘟病毒兔化弱毒株脾毒(CSFV)，由瑞普(保定)生物藥業(yè)有限公司種毒室提供；安全檢驗(yàn)用豬瘟抗體陰性豬，購(gòu)自河北唐縣某豬場(chǎng)；效力檢驗(yàn)用家兔，購(gòu)自河北定州某兔場(chǎng)。

1.2 主要試劑、設(shè)備 MEM培養(yǎng)基，購(gòu)自GIBCO公司；葡萄糖測(cè)定試劑盒，購(gòu)自上海榮盛生物藥業(yè)有限公司；豬瘟專用新生牛血清，購(gòu)自武漢三利生物工程有限公司；胰蛋白酶，購(gòu)自GIBCO公司；AP20C型激流灌注式多功能生物反應(yīng)系統(tǒng)，購(gòu)自杭州安普生物工程有限公司(工作容積10 L)。

1.3 帶毒細(xì)胞制備 以常規(guī)方法復(fù)蘇、傳代、增殖ST細(xì)胞，至長(zhǎng)成良好單層后棄去培養(yǎng)液，接種脾毒，接毒量為3 g/瓶，置于37 ℃溫室中繼續(xù)培養(yǎng)。接毒后第4天進(jìn)行第一次收獲換液，接毒后第8天將已接毒ST消化制備成帶毒細(xì)胞懸液，備用。

1.4 帶毒細(xì)胞罐體接種與培養(yǎng) 將帶毒細(xì)胞懸液接種至生物反應(yīng)器內(nèi)。設(shè)定設(shè)備參數(shù)：T1：37 ℃、T2：40 ℃、T3：36 ℃，pH值：7.4，DO值：50%～70%，振蕩速度20 r/min，空氣流量100 ml/min，啟動(dòng)培養(yǎng)程序，開始病毒培養(yǎng)。當(dāng)殘?zhí)菨舛鹊陀? g/L時(shí)，開始補(bǔ)液或者換液，維持殘?zhí)菨舛?，并分析?xì)胞生長(zhǎng)情況。

1.5 病毒培養(yǎng)、收獲 帶毒細(xì)胞培養(yǎng)至第3天進(jìn)行第一次收獲，2～7收每48 h進(jìn)行一次收獲，1～6收每次收獲完成后向系統(tǒng)內(nèi)補(bǔ)充9 L細(xì)胞維持液，補(bǔ)液后24 h補(bǔ)充200 g/L的葡萄糖，使殘?zhí)菨舛染S持在0.7 g/L。

1.6 半成品檢驗(yàn) 無(wú)菌檢驗(yàn)按現(xiàn)行《中國(guó)獸藥典》附錄進(jìn)行。半成品病毒含量測(cè)定用兔體定型熱反應(yīng)和間接免疫熒光兩種方法測(cè)定。

1.7 疫苗的制備與檢驗(yàn)

1.7.1 疫苗制備 將檢驗(yàn)合格的病毒液稀釋后混合于同一容器，加入等體積牛乳蔗糖凍干保護(hù)劑(5%蔗糖和12%脫脂乳)充分搖勻，定量分裝，迅速冷凍真空干燥即得成品。

1.7.2 疫苗安全性檢驗(yàn) 按瓶簽注明頭份，將疫苗用生理鹽水稀釋為每毫升含6頭份，肌肉注射CSFV抗體陰性健康豬5頭，每頭5 mL，觀察21 d。

1.7.3 疫苗效力檢驗(yàn) 將疫苗用生理鹽水稀釋成1/7500頭份/mL，耳靜脈注射家兔2只，1.0 mL/只，觀察96 h。

2 結(jié)果

2.1 半成品檢驗(yàn) 收獲1～7收各收次毒液，檢測(cè)效價(jià)，7個(gè)收次的病毒液效力均在5.0×106RID/mL以上(如表1)。

表1 各次收獲病毒液的效價(jià) (RID/mL)

7個(gè)收次的病毒液按照《中華人民共和國(guó)獸藥典》(2010年版)附錄進(jìn)行純凈性檢驗(yàn)，無(wú)細(xì)菌、真菌、支原體生長(zhǎng)和外源病毒污染；病毒液對(duì)豬安全無(wú)副作用。

2.2 疫苗成品的安全和效力檢驗(yàn) 接種疫苗后觀察21日，所有試驗(yàn)豬體溫、精神、食欲無(wú)明顯變化，無(wú)異常臨床反應(yīng)，疫苗安全檢驗(yàn)合格。

家兔接種疫苗后觀察4 d，2只家兔1只為定型熱(++)，另1只為輕熱(+)，疫苗效力檢驗(yàn)合格。

3 討論

應(yīng)用生物反應(yīng)器培養(yǎng)ST細(xì)胞生產(chǎn)豬瘟病毒能實(shí)現(xiàn)細(xì)胞高密度生長(zhǎng)，本研究建立了一種規(guī)模化培養(yǎng)豬瘟活疫苗生產(chǎn)工藝，通過(guò)將已感染豬瘟病毒的細(xì)胞直接接種至反應(yīng)器進(jìn)行培養(yǎng)，收獲病毒液，縮短了生產(chǎn)周期，充分利用了轉(zhuǎn)瓶中可帶毒傳代的優(yōu)勢(shì)，而且自動(dòng)化水平較高，生產(chǎn)過(guò)程穩(wěn)定可控，降低了產(chǎn)品批間差異，有利于穩(wěn)定產(chǎn)品質(zhì)量。

建立的豬瘟病毒生產(chǎn)工藝一個(gè)周期病毒收獲量至少與600個(gè)轉(zhuǎn)瓶的單次收獲量相當(dāng)，該工藝與原有的轉(zhuǎn)瓶生產(chǎn)工藝相比，培養(yǎng)時(shí)間縮短一半，大大提高了生產(chǎn)效率，對(duì)于穩(wěn)定產(chǎn)品質(zhì)量，降低生產(chǎn)成本有明顯優(yōu)勢(shì)。

采用兔體熱反應(yīng)和間接免疫熒光兩種方法對(duì)半成品毒液進(jìn)行了抗原含量檢測(cè)，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果可以看出兩者之間呈正相關(guān)關(guān)系，應(yīng)用間接免疫熒光方法檢測(cè)抗原含量有很大的可行性。

[1] 張雙, 郭慧, 徐浩，等.新型豬瘟疫苗的研究進(jìn)展[J].中國(guó)獸醫(yī)雜志, 2015, 51(1): 72-74.

[2] 康愷, 林鷙, 高?；郏? 豬瘟病毒促進(jìn)細(xì)胞自噬并利于病毒增殖[J], 畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào), 2014, 45(9): 1481-1487.

[3] 李安. 豬瘟病毒強(qiáng)毒株與疫苗C株鑒定方法的建立及疫苗病毒定量檢測(cè)的研究[D], 泰安：山東農(nóng)業(yè)大學(xué), 2010.

[4] 鄭朝朝. 脾毒有效期對(duì)豬睪丸細(xì)胞產(chǎn)豬瘟毒的影響.第四屆京津冀一體化畜牧獸醫(yī)科技創(chuàng)新研討會(huì)論文集[S], 石家莊：2014年6月.

[5] 鄭朝朝, 邱貞娜,柳珊.等, 激流灌注式生物反應(yīng)器培養(yǎng)豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗(R98株)工藝的研究[J].中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào), 2013.35(2):107-109.

2016-02-24

郁宏偉(1978-)，男，獸醫(yī)師，博士，主要從事動(dòng)物用生物制品研究與開發(fā)，E-mail: yuhongwei2005@126.com

鄭朝朝，E-mail: zhengzhao521@163.com

S852.612

B

0529-6005(2017)02-0095-02