林 強，李生強，張瑞越，周國華，鄒 杰，黎世齡，羅筱平

（宜春學(xué)院生命科學(xué)與資源環(huán)境學(xué)院，江西 宜春 336000）

利用SSR標(biāo)記對秈稻品種（系）聚類分析的比較研究

林 強，李生強，張瑞越，周國華，鄒 杰，黎世齡，羅筱平

（宜春學(xué)院生命科學(xué)與資源環(huán)境學(xué)院，江西 宜春 336000）

以24個秈稻品種（系）為材料，利用SSR標(biāo)記技術(shù)分別采用NTSYS軟件、DPS軟件和MAGE軟件在4種情況下進行聚類分析。結(jié)果表明，無論是利用NTSYS軟件通過相關(guān)系數(shù)，還是利用DPS軟件和MAGE軟件通過遺傳距離進行聚類分析，都基本能將恢復(fù)系、三系不育系、短光敏不育系3個類群分開，但由于所選標(biāo)記及其檢測到的等位基因數(shù)量不同，聚類的結(jié)果也隨之不同，特別是水稻恢復(fù)系和不育系兩大類群下的各亞類的分類結(jié)果不同。因此，認(rèn)為只有首先確定合理的引物數(shù)量及其檢測到的等位基因數(shù)，才能較為準(zhǔn)確地進行聚類分析，進而有效地劃分雜種優(yōu)勢群。

秈稻；SSR標(biāo)記；聚類分析；雜種優(yōu)勢群

水稻是世界上最主要的糧食作物之一，全球有50%以上的人以水稻為主食［1］。預(yù)計到2050年，全球水稻產(chǎn)量增長1倍才能滿足不斷增長的人口需求［2］。因此，水稻高產(chǎn)育種一直以來都是育種工作者的重要目標(biāo)之一。20世紀(jì)70年代水稻雄性不育遺傳資源的發(fā)現(xiàn)和雜種優(yōu)勢的利用，推動了水稻雜交育種的發(fā)展，使水稻產(chǎn)量有了突飛猛進的增長。然而，近幾十年，中國水稻產(chǎn)量一直沒有突破性進展。眾所周知，雜交親本的合理選配是雜種優(yōu)勢有效利用的關(guān)鍵，而適度的遺傳差異與雜種優(yōu)勢密切相關(guān)。因此，將雜交親本準(zhǔn)確的劃分為不同的類群，分析其遺傳多樣性，可以有效提高雜交水稻強優(yōu)勢組合選育效率。陸作楣等［3］建議以省為單位，將已經(jīng)推廣的雜交稻親本綜合利用分子標(biāo)記聚類、配合力分析和表型聚類等多種方法，構(gòu)建水稻雜種優(yōu)勢群，并明確主要的雜交模式。

通過DNA分子標(biāo)記研究品種間遺傳多樣性及聚類分析是目前應(yīng)用廣泛的手段之一。研究表明，SSR標(biāo)記具有操作簡單、穩(wěn)定性好、不受環(huán)境和生育期的影響等優(yōu)點，而且標(biāo)記多態(tài)信息量高，位點已定位在圖譜上，適合種質(zhì)的遺傳多樣性及聚類分析［4-7］。隨著我國玉米遺傳多樣性及雜種優(yōu)勢群理論的深入研究［8-9］，水稻雜交親本的聚類分析及雜種優(yōu)勢群理論的研究也逐漸受到人們重視。張濤等［10］利用SSR標(biāo)記研究了三系雜交水稻親本的遺傳多樣性；羅小金等［11］用36對SSR引物對秈稻材料進行檢測，得到281個等位基因，將58份水稻材料劃分為3個類群；姚棟萍等［12］利用19對SSR引物對90份常用水稻品種進行遺傳多樣性分析，并構(gòu)建指紋圖譜。李愛宏等［13］利用48對SSR標(biāo)記對20個秈稻品種進行聚類，并分析了雜種優(yōu)勢模式。王勝軍等［14］利用72對SSR標(biāo)記對47個雜交秈稻親本進行聚類分析，并結(jié)合生產(chǎn)實踐提出7種雜種優(yōu)勢組合配組模式。

利用分子標(biāo)記進行聚類分析時，不同研究者選取的標(biāo)記及檢測到的等位基因數(shù)量都不相同，但都未說明所選用標(biāo)記數(shù)量的合理性。本研究用94對擴增條帶穩(wěn)定的多態(tài)性引物，在24個水稻雜交親本中檢測到272個等位基因，根據(jù)PIC值選擇不同引物數(shù)及相應(yīng)的等位基因，采用不同的軟件進行聚類分析，并對結(jié)果進行比較分析，旨在為雜交水稻親本精確的聚類分析、遺傳多樣性分析以及雜種優(yōu)勢的高效利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

選用本課題組選配雜交組合的24個秈型水稻品種（系）。包括18個恢復(fù)系（93-11、 R148、R140、R0285、R3436、R3253、R1536、R441、R310、D254、R1037、R66、R121、明恢63、R539、R362、R6258和R1113），6個不育系（優(yōu)IA、五豐A、三A、益豐A、珍汕97A和D38S），其中D38S是宜春學(xué)院選育的短光敏核不育系［15-16］。

1.2 SSR分析方法

1.2.1 DNA提取 采取CTAB方法提取水稻基因組DNA［17］。

1.2.2 SSR引物選擇 本試驗室合成水稻SSR引物近1 000對，根據(jù)網(wǎng)上公布數(shù)據(jù)（http：// www.gramene.org），按照引物在93-11染色體上的位點，所選引物均勻的分布在水稻各染色體上，共選擇157對SSR引物。

1.2.3 PCR擴增及產(chǎn)物分離 PCR反應(yīng)采用20μL體系：模板DNA 2.0μL（25 ng/μL），Taq酶 0.1μL（5.0U/μL），引物2.0μL，dNTP 2.0μL（10 mmol/L），2.0μL 10×Buffer（不含Mg+）MgCl21.0μL（25 mmol/L），用ddH2O補足到20μL。PCR反應(yīng)程序為：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性40 s，55～60℃退火（根據(jù)引物選擇）30s，72℃延伸40 s，35個循環(huán)，72℃延伸10 min，擴增產(chǎn)物經(jīng)3%瓊脂糖凝膠分離。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

SSR擴增產(chǎn)物以0、1統(tǒng)計建立數(shù)據(jù)矩陣。相同的遷移位置，有帶者記為1，無帶者記為0。SSR位點的多態(tài)性信息量（PIC）按以下公式計算：

式中，Pij為 i標(biāo)記第 j個等位基因的頻率（Botstein 1980）。根據(jù)PIC值選擇不同數(shù)量引物及相應(yīng)檢測到的等位基因數(shù)量，分別利用常用聚類軟件NTSYS［18］、唐啟義等開發(fā)的DPS軟件［19］及MEGA軟件［20］進行聚類分析，遺傳距離計算采用Jicard方法，并對結(jié)果進行比較分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR標(biāo)記多態(tài)性分析

利用157對SSR引物，對24個雜交秈稻親本品種（品系）進行擴增分析。從中篩選出94對帶型清晰穩(wěn)定的引物分布于水稻12條染色體上。這94對引物共檢測出272個等位基因，平均每個位點檢測到的等位基因為2.89個，變化范圍1～7個。每條染色體上檢測出的等位基因范圍是8～44個，平均每條染色體檢測到等位基因為22.67。所檢測到的每個SSR引物位點的多態(tài)信息量（PIC）變化范圍在0.08～0.89，平均為0.68（表1，圖1）。

表1 SSR引物的多態(tài)信息

圖1 引物RM13630和RM24330在24個秈稻品種（系）擴增情況

2.2 聚類分析比較

2.2.1 利用NTSYS聚類分析 根據(jù)PIC值不同，分別選取不同引物及其檢測到的等位基因：（1）94對引物檢測到272個等位基因；（2）PIC大于0.6時，72對引物檢測到234個等位基因；（3）PIC大于0.7時，54對引物檢測到200個等位基因；（4）PIC值大于0.75時，37對引物檢測到151個等位基因。在這4種情況下利用NTSYS軟件分別進行聚類分析，都能將24個水稻品種（系）分為三大類：恢復(fù)系類、三系不育系及短光敏不育系D38S。相關(guān)系數(shù)分別為0.8229、0.8486、0.8019和0.7645。當(dāng)引物數(shù)量少于54對，檢測到等位基因少于200的情況下，聚類結(jié)果將恢復(fù)系R66聚類到三系不育系類群中，并在三系不育系類群下單獨聚為一亞類，而三系不育系材料三A聚到恢復(fù)系類群中；當(dāng)引物數(shù)量達到72對以上，檢測到的等位基因數(shù)量達到234以上時，可較為準(zhǔn)確地將恢復(fù)系和不育系分開，只不過隨著當(dāng)檢測到的等位基因數(shù)量的增加，相關(guān)系數(shù)又有減小趨勢。同時，在恢復(fù)系類群下，不同情況下各亞群聚類結(jié)果有所不同（圖2）。

圖2 NTSYS軟件聚類分析

2.2.2 利用DPS聚類分析 采用相同方法利用DPS軟件，在4種情況下分別對24個水稻品種（系）進行聚類分析。圖3表明，利用37對引物進行聚類時，結(jié)果與NTSYS軟件分析類似；而利用54對和72對引物進行聚類分析時，除了恢復(fù)系、三系不育系、短光敏不育系三大類群外，明顯將恢復(fù)系R66單獨聚為第4個類群；利用94對引物分析時，將24個水稻品種（系）聚為恢復(fù)系、三系不育系和短光敏不育系D38S 3類，這與利用NTSYS軟件，在引物數(shù)量達到72對以上時的結(jié)果相似。

圖3 DPS軟件聚類分析

2.2.3 利用MEGA聚類分析 根據(jù)李亞玲等［17］的分析方法，分別在4種情況下，先使用DPS軟件進行0、1數(shù)據(jù)系統(tǒng)聚類方法獲得遺傳距離矩陣，然后利用MEGA5.2，采用UPGMA進行聚類分析。當(dāng)利用37對引物進行聚類分析時，將24個秈稻品種（系）聚為恢復(fù)系、三系不育系和短光敏不育系，和前兩種軟件分析結(jié)果相同的是將三A聚在恢復(fù)系類群中，不同的是沒有將R66聚到三系不育系類群中。當(dāng)引物數(shù)量超過54對時，聚類分析的結(jié)果與引物數(shù)量達到72對以上，進行NTSYS軟件分析時的結(jié)果相似，同時也與引物數(shù)量達到94對時，進行DPS軟件聚類分析結(jié)果相似（圖4）。

3 結(jié)論與討論

利用SSR標(biāo)記對水稻品種進行遺傳多樣性及聚類分析時，不同的研究者選用的標(biāo)記數(shù)及其檢測到的等位基因大相徑庭。本研究中，利用NTSYS軟件通過相似系數(shù)進行聚類分析時，所用標(biāo)記及其檢測出的等位基因較少時，將個別不育系聚到恢復(fù)系群中，恢復(fù)系卻聚到不育系群中，隨著標(biāo)記和所檢測到的等位基因的增加，相關(guān)系數(shù)也會隨之達到相對最大值，同時將24個水稻品種（系）劃分為恢復(fù)系、三系不育系和短光敏不育系3類，而當(dāng)?shù)任换蜻_到272時，相關(guān)系數(shù)有減小趨勢。而利用DPS和MEGA軟件通過遺傳距離進行聚類分析，隨著標(biāo)記數(shù)量和等位基因的增加，恢復(fù)系和三系不育系類群的劃分越準(zhǔn)確。3種軟件都能將24個秈稻品種（系）準(zhǔn)確的聚為恢復(fù)系、三系不育系和短光敏不育系三大類群，只不過所需要引物數(shù)量及檢測到等位基因數(shù)不同，NTSYS分析需要72對以上的引物，檢測到的等位基因數(shù)達到234個以上，DPS軟件分析需要94對引物檢測到272個等位基因數(shù)，而MEGA軟件分析僅需要54對以上的引物，檢測到的等位基因數(shù)超過200個時即可。利用分子標(biāo)記對水稻進行聚類分析是進行水稻遺傳多樣性研究的有效手段之一，要提高聚類結(jié)果的準(zhǔn)確性，首先必須根據(jù)選用聚類方法分析確定最合理的標(biāo)記及其檢測到的等位基因數(shù)量。此外，分子標(biāo)記在水稻各染色體上的分布情況也會影響到分析結(jié)果。

圖4 MEGA軟件聚類分析

短光敏不育系D38S具有長光可育、短光不育的特性，可實現(xiàn)長日照條件下繁殖、短日照條件下制種，特別是在低緯度地區(qū)具有應(yīng)用前景，是一種新型的兩用不育系［16］。在本研究中，不論采用哪種軟件，在4種情況下都能將其單獨聚為一類，說明D38S與其他三系不育系材料間有較大遺傳差異。今后將結(jié)合生產(chǎn)上常用兩系不育系材料進行對比研究，深入探討其在生產(chǎn)上潛在的利用價值。

此外，從3種軟件易用性方面看，DPS軟件具有中文操作界面，且統(tǒng)計與結(jié)果分析兼?zhèn)?，在Excel中錄入的數(shù)據(jù)可以直接粘貼至DPS軟件進行分析，操作比較簡單，但DPS軟件不能對生成的聚類圖形進行優(yōu)化編輯。利用DPS軟件獲得遺傳距離矩陣，然后利用MEGA軟件進行聚類分析，可以優(yōu)化編輯聚類圖［21］，但缺點在于MEGA做聚類分析時，不能識別含有漢字字符的品種（系）名稱。而NTSYS軟件無法直接粘貼數(shù)據(jù)，需要經(jīng)過復(fù)雜的操作將數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成其可以識別的文件格式，然后才能進行聚類分析。

隨著雜交水稻的發(fā)展，育種家們不斷的培育恢復(fù)系與不育系，從中選育具有強雜種優(yōu)勢的組合，一方面雜交親本間遺傳差異逐漸縮小，另一方面工作量不斷增大，而選育效率卻逐步下降。從玉米雜種優(yōu)勢的成功利用可以清楚地看到，不斷提高玉米自交系的一般配合力和組合的特殊配合力是雜交玉米育種工作的主線，而玉米自交系聚類分析及雜種優(yōu)勢群的研究在其中發(fā)揮了重要作用［22］。水稻雜種優(yōu)勢利用了幾十年，但對雜交親本的聚類分析及雜種優(yōu)勢群研究相對比較滯后。僅認(rèn)識到水稻不育系和恢復(fù)系是兩大優(yōu)勢群是遠遠不夠的，篩選出特殊配合力較高的優(yōu)勢群，是強優(yōu)勢組合高效選育的基礎(chǔ)。本研究為水稻雜交親本精確的聚類分析及雜種優(yōu)勢群研究提供理論依據(jù)。

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（責(zé)任編輯 楊賢智）

Comparative study on cluster analysis of 24 indica rice varieties（lines）by SSR markers

LIN Qiang，LI Sheng-qiang，ZHANG Rui-yue，ZHOU GUO-hua，ZOU Jie，LI Shi-ling，LUO Xiao-ping
（College of Life Science and Environmental Resources，Yichun University，Yichun 336000，China）

Cluster analysis of 24 indica rice varieties（lines）by 4 different SSR primers using NTSYS，DPS and MAGE software were implemented in this study. The results showed that three groups including restorer lines，cytoplasmic male sterile lines and short photoperiod sensitive sterile lines were distinguished no matter using NTSYS software by the similarity factor，or using DPS and MAGE software clustering analysis based on genetic distance，the results of clustering analysis were different with the number of markers and alleles，especially the sub group under the male sterile lines and restorer lines，which were recognized as dominant group of rice. This study suggests that the number of alleles detected by molecular markers affects the accuracy of clustering results and the effective construction of rice heterosis groups.

indica；SSR markers；cluster analysis；heterotic groups

S511.01

A

1004-874X（2017）01-0001-07

2016-09-25

江西省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項目（151034）

林強（1993-），男，學(xué)士，E-mail：linqdeyx@163.com

李生強（1978-），男，博士，講師，E-mail：lisqyuer@163.com

林強，李生強，張瑞越，等. 利用SSR標(biāo)記對秈稻品種（系）聚類分析的比較研究［J］.廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，44（1）：1-7.