劉守海，秦玉濤，劉材材，季曉，張昊飛

(1．國家海洋局東海環(huán)境監(jiān)測中心 上海 201206;2．海洋赤潮災害立體監(jiān)測技術與應用國家海洋局重點實驗室 上海 201206)

DNA條形碼技術在仔稚魚鑒定中的實踐

劉守海1，2，秦玉濤1，2，劉材材1，2，季曉1，2，張昊飛1，2

(1．國家海洋局東海環(huán)境監(jiān)測中心 上海 201206;2．海洋赤潮災害立體監(jiān)測技術與應用國家海洋局重點實驗室 上海 201206)

對物種準確鑒定是進行生物多樣性研究的前提。為提高物種鑒定的準確性，文章采用DNA條形碼技術結合形態(tài)學對長江口仔稚魚樣品進行種類鑒定。結果表明，44個樣品中，通過線粒體COI基因的分析鑒定有17個種、1個屬;部分形態(tài)上難以鑒定的種類，如蝦虎魚科的矛尾蝦虎魚、斑尾刺蝦虎魚、睛尾蝌蚪蝦虎魚、褐吻蝦虎魚和斑點竿蝦虎魚，可通過DNA條形碼實現(xiàn)有效鑒定;形態(tài)較為相似的種類，通過DNA條形碼可鑒定到種，淡水鯉科的有青魚、鰱、鳊，鯔科的有龜鮻和前鱗龜鮻。利用DNA條形碼技術結合形態(tài)進行仔稚魚種類的鑒定，能提高仔稚魚鑒定的精確度。

DNA條形碼;生物多樣性;COI基因;海洋生物;物種鑒定

準確地鑒別仔魚種類是進行魚類浮游生物多樣性研究的前提，也是進行海洋生態(tài)系統(tǒng)科學研究的基礎。根據(jù)仔魚形態(tài)特征差異可以對其進行種類鑒別［1］，但魚類早期發(fā)育階段時間較短，其形態(tài)變化復雜，形態(tài)特征差異不明顯或比較相似，有資料可查仔、稚魚種類不超過300種［2］。因此，僅憑借魚類早期發(fā)育階段的外部形態(tài)特征很難對仔魚進行精確分類。

隨著DNA條形碼技術［3］的提出和快速發(fā)展，尤其是DNA條形碼數(shù)據(jù)庫的成功構建［4］，為這一技術在仔魚種類鑒定中應用奠定基礎［5－7］。迄今國內對DNA條形碼技術應用于仔魚鑒定的報道較少［8－9］。本文以2016年5月長江口及其鄰近海域的仔稚魚樣品為材料，采用形態(tài)學與DNA條形碼技術結合的形式進行種類鑒定，討論種類鑒定的精確度，同時探索DNA條形碼技術在海洋生物多樣性監(jiān)測中的應用可行性。

1 實驗材料與方法

1.1 樣品采集

于2016年5月9—29日在長江口及其鄰近海域設置采樣站點(圖1)。

圖1 采樣站位

按照《海洋調查規(guī)范》(GB/T12763.6—2007)使用大型浮游生物網(wǎng)(網(wǎng)長 280 cm、網(wǎng)口內徑80 cm、網(wǎng)口面積0.5 m2、網(wǎng)目0.505 mm)在站點進行水平拖網(wǎng)。采集到的標本現(xiàn)場進行初步處理，用無水乙醇保存，回實驗室后對樣品進行形態(tài)鑒定、拍照和分子鑒定。

1.2 實驗方法

取背部肌肉約100 mg，使用海洋動物組織基因組DNA提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司)提取總DNA。使用通用引物 F1:TCR ACY AAY CAY AAA GAY ATY GGC AC和R1:TAG ACT TCW GGG TGR CCR AAG AAT CA擴增仔魚的線粒體DNA的COI部分序列，PCR總反應體系為50 μL，其中包括:10×PCR buffer 5 μL、dNTP 4 μL(2.5 mmol/L)、上下游引物各2 μL(10 mmol/L)、Taq DNA聚合酶0.8 μL(5 U/μL)、模板DNA 1μL，加雙蒸水至總體積50 μL。樣品在AG-22331型PCR儀(Eppendorf)上進行擴增，94℃預變性5 min;94℃ 30 s、52℃ 45 s、72℃ 1 min，35個循環(huán);72℃延伸10 min;4℃保存。擴增產物使用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測后送至上海杰李生物技術有限公司膠回收雙向測序后拼接。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用DNAStar軟件包對測序和GenBank下載序列進行校對，用Clustal X對所有序列進行比對排序并去除兩端冗余列。利用MEGA6.0分析序列的核苷酸組成等，基于K2P雙參數(shù)模型計算種間及種內的遺傳距離。

2 實驗結果

2.1 測序結果

本研究共獲得43條COI基因序列。獲得的COI基因序列長度為680 bp。

2.2 遺傳距離

對COI基因的K2P遺傳距離分析結果表明，種內的遺傳距離在0～0.011，平均值為0.004。COI基因序列的屬內種間遺傳距離在0.075～0.080，平均值為0.077。

2.3 種類鑒定

在44個樣品中，分子實驗將樣品鑒定到17個種、1個屬;而形態(tài)鑒定結果鑒定到種的僅有6個，鑒定到屬的有2個，鑒定到科的有2個，還有2個仔魚未能進行種類鑒定。相對形態(tài)鑒定結果，分子實驗結果的精確度更高。

分子技術對蝦虎魚科、鯉科、鯔科等類群的鑒定結果更為精確。分子鑒定結果將所獲得的蝦虎魚科樣品全部鑒定到種:矛尾蝦虎魚(Chaeturichthys stigmatias)、斑尾刺蝦虎魚(Acanthogobius ommaturus)、睛尾蝌蚪蝦虎魚(Lophiogobius ocellicauda)、褐吻蝦虎魚(Rhinogobius brunneus)、斑點竿蝦虎魚(Luciogobius guttatus)(圖2)。形態(tài)相似不易鑒定的淡水鯉科仔魚3種:青魚(Mylopharyngodon piceus)、鰱(Hypophthalmichthys molitrix)、鳊(Parabramis peknensis)。鯔科中鑒定出2種:龜鮻(Chelon haematocheilus)和前鱗龜鮻(Chelon affinis)。

圖2 形態(tài)無法鑒定的蝦虎魚科仔魚種類

3 討論

3.1 長江口仔稚魚的種類組成

關于長江口仔稚魚的報道已有不少［10－14］。由于長江徑流帶來大量營養(yǎng)物質，長江口水域成為多種經濟魚類的產卵、索餌和育幼的重要場所，仔稚魚的種類多、類群復雜(包括淡水種類、咸淡水種類、近海種類)，具有明顯的河口特征。

從20世紀80年代開始，每10年對長江口及其鄰近水域的魚卵和仔稚魚進行調查，發(fā)現(xiàn)種類數(shù)有下降趨勢(表1)。本研究中魚卵和仔稚魚的調查結果為10科17種，較2007年調查結果科的數(shù)量有所減少、種類數(shù)相仿;使用條形碼技術更有助于種類鑒定，將之前的蝦虎魚科及鯉科仔稚魚鑒定到種，更獲得鯔科龜鮻屬的龜鮻和前鱗龜鮻。由此可見，條形碼技術能完善種類組成資料。

表1 不同時期春季長江口及其鄰近水域仔稚魚調查結果對比

3.2 DNA條形碼技術鑒定仔稚魚的精確度

由于仔魚階段的形態(tài)特征不甚明顯，形態(tài)學鑒定結果往往會使部分仔魚樣品鑒定到科或屬。因此，在形態(tài)特征不明顯或分類依據(jù)有疑問的時候，嚴謹?shù)淖龇ㄊ侵昏b定到科或屬。加之不同鑒定者水平不一，也會對鑒定結果有一定影響。基于COI的條形碼輔助仔魚鑒定能夠克服形態(tài)特征和人為干擾，將形態(tài)鑒定特征不明顯的樣品準確鑒定到種，可提高仔魚鑒定的精確度。條形碼輔助仔魚鑒定可以區(qū)分形態(tài)學較難鑒定的科類或相似種類。

溫帶河口的仔稚魚一般以河口定居物種(如蝦虎魚科)或季節(jié)性進入河口產卵者占優(yōu)勢［15］，長江徑流也會帶來一些淡水種類的仔稚魚。長江口水域環(huán)境復雜多變，分布的蝦虎魚科常見種類有10種左右;淡水魚類主要以鯉形目、鱸形目和鯰形目為主，其中又以鯉形目的鯉科魚類最多，常見種類有20多種［16］。本研究通過形態(tài)學結合DNA條形碼技術將調查所獲得的蝦虎魚科和淡水鯉科等仔魚樣品全部鑒定到種，共獲得蝦虎魚科的5個種即矛尾蝦虎魚、斑尾刺蝦虎魚、睛尾蝌蚪蝦虎魚、褐吻蝦虎魚、斑點竿蝦虎魚，淡水種類有鯉科的青魚、鰱和鳊。在以往蝦虎魚科和鯉科仔魚的研究中存在部分樣品鑒定到科級［11－14，17］，鑒定到種的則較少［11，18－19］，說明基于COI序列的DNA條形碼可對形態(tài)學較難鑒定的科類或相似種類進行有效的物種鑒定。

3.3 DNA條形碼技術在仔稚魚多樣性監(jiān)測中的應用展望

DNA條形碼技術輔助仔稚魚鑒定，其準確性取決于比對數(shù)據(jù)庫的準確與完備程度。很多國際組織已建立自己的DNA條形碼數(shù)據(jù)庫，如BOLD、ABBI、AllLeps、TBI、MBI等。其中BOLD數(shù)據(jù)庫收錄的魚類DNA條形碼信息基本來自于COI基因;截至2016年4月，BOLD數(shù)據(jù)庫收錄近18.69萬條輻鰭魚綱魚類的DNA條形碼序列信息，隸屬于46目1.75萬種。BOLD等數(shù)據(jù)庫條形碼信息的不斷豐富，為DNA條形碼技術在魚卵和仔、稚魚鑒定領域的應用提供可比對的魚類條形碼數(shù)據(jù)。

傳統(tǒng)的形態(tài)學鑒定仍然是目前海洋生物多樣性監(jiān)測的主要手段，但海洋環(huán)境監(jiān)測中魚卵和仔、稚魚樣品形態(tài)鑒定存在樣品形態(tài)特征不明顯、樣品鑒定水平參差不齊、形態(tài)鑒定工作量大且耗時的問題，尋找一個結果更精確、過程可標準化的方法對樣品進行快速準確的鑒定是迫切工作。利用形態(tài)結合DNA條形碼技術既可以有效提高仔稚魚種類鑒定的精確度，也有利于對海洋生物多樣性進行客觀科學的評價。

［2］卞曉東，張秀梅，高天翔，等．沙氏下鱵魚卵的形態(tài)學及遺傳學鑒別［J］．水產學報，2008，32(3):342－352．

［3］ARNOT D E，ROPER C，BAYOUMI R A L．Digital codes from hypervariable tandemly repeated DNA-sequences in the Plasmodium-Falciparum Circumsporozoite gene can genetically barcode isolates［J］．Molecular and Biochemical Parasitology，1993，61(1):15－24．

［4］HEBERT P D N，CYWINSKA A，BALL S L，et al．Biological identification through DNA barcodes［J］．Proceedings of the Royal Society B:Biological Sciences，2003，270:313－322．

［5］KO H L，WANG Y Z，CHIU T S，et al．Evaluating the accuracy of morphological identification of larval fishes by applying DNA barcoding［J］．PLOS ONE，2013，8(1):1－7．

［6］HUBERT N，DELRIEU-TROTTIN E，IRISSON J O，et al．Identifying coral reef fish larvae through DNA barcoding:A test case with the families Acanthuridae and Holocentridae［J］．Molecular Phylogenetics and Evolution，2010，55:1195－1203．

［7］HUBERT N，ESPIAU B，MEYER C，et al．Identifying the ichthyoplankton of a coral reef using DNA barcodes［J］．Molecular Ecology Resources，2015，15:57－67．

［8］何文平，程飛，黎雨軒，等．刀鱭和鳳鱭的分子鑒定及其在仔魚種類鑒定中的應用［J］．水生生物學報，2011，35(4):565－571．

［9］周美玉，陳曉，楊圣云．采用DNA條形碼技術對廈門海域魚卵、仔稚魚種類的鑒定［J］．海洋環(huán)境科學，2015，34(1):120－135．

［10］楊東萊，吳光宗，孫繼仁．長江口及其鄰近海區(qū)的浮性魚卵和仔稚魚的生態(tài)研究［J］．海洋與湖沼，1990，21(4):346－355．

［11］朱鑫華，劉棟，沙學紳．長江口春季魚類浮游生物群落結構與環(huán)境因子的關系［J］．海洋科學集刊，2002，44:169－178．

［12］蔣玫，沈新強，王云龍，等．長江口及其鄰近水域魚卵、仔魚的種類組成與分布特征［J］．海洋學報，2006，28(2):171－174．

［13］王金輝，孫亞偉，劉材材，等．長江口魚卵仔魚資源現(xiàn)狀的調查與分析［J］．海洋學研究，2007，25(4):40－50．

［14］劉淑德，線薇微．長江口及其鄰近水域魚類浮游生物群落的時空格局［J］．生物多樣性，2009，17(2):151－159．

［15］STRYDOM N A．Occurrence of larval and early juvenile fishes in the surf zone adjacent to two intermittently open estuaries:South Africa［J］．Environmental Biology of Fishes，2003，66:349－359．

［16］莊平，王幼槐，李圣法，等．長江口魚類［M］．上海:上?？茖W技術出版社，2007:201－222．

［17］閆欣，鐘俊生，王明星，等．杭州灣北部水域仔稚魚種類組成和多樣性研究［J］．上海海洋大學學報，2014，23(5):765－773．

［18］蔣日進，鐘俊生，張冬良，等．長江口沿岸碎波帶仔稚魚的種類組成及其多樣性特征［J］．動物學研究，2008，29(3): 297－304．

［19］陳淵戈，張宇，鐘俊生，等．長江口南支和杭州灣北岸碎波帶水域仔稚魚群聚的比較［J］．上海海洋大學學報，2011，20 (5):688－696．

Molecular Identification of Fish Larvae and Juveniles Based on DNA Barcoding

LIU Shouhai1，2，QIN Yutao1，2，LIU Caicai1，2，JI Xiao1，2，ZHANG Haofei1，2

(1．East China Sea Environmental Monitoring Center，SOA，Shanghai 201206，China;2．Key Lab of Integrated Monitoring and Applied Technology for Marine Harmful Algal Blooms，SOA，Shanghai 201206，China)

Accurate identification of species is a prerequisite for biodiversity research．To improve the identification accuracy of fish larvae and juveniles in the Yangtze Estuary，the method of morphology and DNA barcoding were used based on mitochondrial the COI gene．The results showed that among the 44 samples analyzed，17 of which could be identified to the species level using DNA barcoding，while only one to the genus level．Some species without available taxonomic keys for morphological identification，including Chaeturichthys stigmatias，Acanthogobius ommaturus，Lophiogobius ocellicauda，Rhinogobius brunneus，Luciogobius guttatus in Gobiidae，were difficult to identify by morphology but were successfully identified by using DNA barcoding．Some species with similar morphology were hard to be distinguished，such as Mylopharyngodon piceus，Hypophthalmichthys molitrix，Parabramis peknensis in Freshwater Cyprinidae，Chelon haematocheilus，Chelon affinis in Mugilidae．DNA barcoding based on the COI gene could provideeffective identification to the species level．Collectively，DNA barcoding，together with morphological identification，could largely increase the identification accuracy for fish larvae and juveniles．

DNA barcoding，Biodiversity，COI gene，Marine organism，Species identification

P7

A

1005－9857(2017)02－0092－04

2016-10-20;

2016-12-09

海洋公益性行業(yè)科研專項(201305027，201505004－6);海洋赤潮災害立體監(jiān)測技術與應用國家海洋局重點實驗室基金資助課題(MATHAB201402，MATHAB201408);東海分局青年海洋科技基金項目(201501，201608)．

劉守海，工程師，碩士，研究方向為海洋魚類浮游生物學，電子信箱:liush@eastsea.gov.cn

張昊飛，高級工程師，博士，研究方向為海洋環(huán)境科學，電子信箱:zhanghf@eastsea.gov.cn