簡 艷綜述 鈄方芳審校

·綜述與講座·

基因修飾DC疫苗在肺癌中的研究進(jìn)展

簡 艷綜述 鈄方芳審校

基因修飾；樹突細(xì)胞；肺癌

肺癌是我國發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤[1]，大部分患者在確診時(shí)已處于中晚期，手術(shù)和放化療是肺癌的傳統(tǒng)治療模式。近年來，生物治療逐漸成為腫瘤的第四大治療模式，表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑為肺癌患者的生存帶來福音，以DC和CIK疫苗為基礎(chǔ)的主動(dòng)和過繼免疫治療也在臨床上取得了一定成績，但肺癌的5年生存率仍不足15%[2]。所以不斷探索肺癌的發(fā)病機(jī)制及尋找新的治療方式仍是攻克腫瘤的重要方向。以基因修飾的細(xì)胞免疫治療可從分子水平激活免疫應(yīng)答并重建機(jī)體免疫功能，對(duì)腫瘤干細(xì)胞或處于非增殖期的腫瘤細(xì)胞均有殺傷作用，是肺癌治療模式的重要補(bǔ)充手段[3]。DC作為目前唯一能激活未致敏初始型T細(xì)胞的APC，能特異性地識(shí)別遞呈腫瘤抗原，以特異性腫瘤基因轉(zhuǎn)染DC制作個(gè)體化疫苗，在基因水平上針對(duì)患者制定精準(zhǔn)化治療方案，以此免疫荷瘤宿主，激發(fā)高效的抗腫瘤免疫應(yīng)答，起到事半功倍的效果。本研究將具體描述基因修飾的DC疫苗在肺癌免疫治療中的發(fā)展。

1 DC的生物學(xué)特性

DC來源于骨髓CD34+造血干細(xì)胞，因突起的偽足像樹枝，故命名為樹突狀細(xì)胞，根據(jù)來源不同分為淋巴系DC和髓系DC兩大類，淋巴系DC的前體與NK細(xì)胞、T細(xì)胞相同，髓系DC前體細(xì)胞與單核細(xì)胞和粒細(xì)胞相同[4]。根據(jù)成熟度不同DC功能有差異，未成熟的DC內(nèi)含重要細(xì)胞器，包括內(nèi)體或稱MHCⅡ類小室和溶酶體等，高表達(dá)補(bǔ)體、Toll樣受體，為DC攝取抗原提供結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)；當(dāng)未成熟DC攝取抗原后或受到某些因子刺激則分化為成熟DC，高表達(dá)共刺激因子(CD80、CD86、CD40、CD40L等)和粘附因子(IL12p35、IL12p40、IL12p70、IFN-γ等)，獲得遞呈抗原(MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ)及活化T細(xì)胞的能力[5]。

2 DC與肺癌的發(fā)生發(fā)展

2002年，Dunn等[6]在總結(jié)前人研究的基礎(chǔ)上，經(jīng)過大量基礎(chǔ)和臨床試驗(yàn)驗(yàn)證提出“腫瘤免疫編輯”假設(shè)，認(rèn)為腫瘤形成在免疫應(yīng)答中分為3個(gè)階段：清除、平衡、逃逸，其中DC在免疫應(yīng)答中起到關(guān)鍵作用。在肺癌的發(fā)生發(fā)展中，當(dāng)宿主細(xì)胞發(fā)生癌變后，未成熟的DC經(jīng)趨化作用從外周血進(jìn)入腫瘤微環(huán)境，在腫瘤抗原刺激下形成成熟DC，上調(diào)抗原遞呈能力，高表達(dá)共刺激因子，攝取腫瘤抗原與MHC結(jié)合成MHC-抗原肽復(fù)合物作為第一活化信號(hào)激活初始T細(xì)胞使之活化分化成為T輔助細(xì)胞(Th)和細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞(CTL)，從而啟動(dòng)體液免疫應(yīng)答消滅表達(dá)HLA多肽的癌變細(xì)胞[7]；同時(shí)高表達(dá)IL-12、IL-6、TNF-a和IL-10，增強(qiáng)自然殺傷細(xì)胞的直接殺傷作用，作為第二活化信號(hào)增強(qiáng)機(jī)體對(duì)炎癥或腫瘤的免疫應(yīng)答[8]。DC分泌的趨化因子可專一性趨化初始型T細(xì)胞，促進(jìn)T細(xì)胞在腫瘤部位的聚集，增強(qiáng)T細(xì)胞激發(fā)相應(yīng)的免疫應(yīng)答[9]。然而，由于腫瘤細(xì)胞遺傳的不穩(wěn)定性及異質(zhì)性，可逃避DC識(shí)別和攝取，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞不斷增殖甚至轉(zhuǎn)移。有研究證實(shí)：腫瘤細(xì)胞一般低表達(dá)或不表達(dá)MHCⅠ、MHCⅡ類分子和細(xì)胞黏附分子，同時(shí)釋放VEGF，TGF-β阻礙DC分化成熟，不利于加工形成MHC-抗原肽復(fù)合物，從而喪失抗原呈遞功能，最終出現(xiàn)腫瘤增殖及轉(zhuǎn)移[10]。 也有研究表明[11-12]：與正常組織相比，肺癌、喉癌和鼻咽癌等多種惡性腫瘤癌巢內(nèi)DC數(shù)目不足；與正常供體DC相比，從腫瘤分離得到的DC明顯缺乏抗原提呈功能，進(jìn)一步支持了該假說。

3 肺癌相關(guān)抗原基因轉(zhuǎn)染DC疫苗的制備方式

3.1 DC疫苗來源

目前用于臨床免疫治療的DC多來源于肺癌患者的外周血，亦可從骨髓、臍血中提取，但骨髓提取的有創(chuàng)性及臍血來源困難限制了使用；同時(shí)外周血淋巴系DC含量少，體外培養(yǎng)困難，故疫苗制作多來源于外周血的髓系DC。外周血分離出單個(gè)核細(xì)胞后，在白介素-4(IL-4)、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的誘導(dǎo)下分化為成熟的DC。腫瘤抗原加載方式主要有抗原致敏和基因修飾兩種，抗原致敏主要是將腫瘤細(xì)胞的全部抗原信息或特異性抗原肽通過接觸融合共培養(yǎng)方式負(fù)載。這類疫苗制備方法簡便，容易實(shí)施，但非相關(guān)抗原量大且種類多，有誘發(fā)自身免疫性疾病危險(xiǎn)?；蛐揎検峭ㄟ^特異性基因轉(zhuǎn)染方式改變DC的遺傳表達(dá)，精準(zhǔn)個(gè)體化的提呈腫瘤抗原，避免了上述缺點(diǎn)。沈晨陽等[13]研究發(fā)現(xiàn)：單純的熱休克蛋白gp96-肽復(fù)合物/DC疫苗較腫瘤細(xì)胞粗提物/DC 疫苗誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞分泌產(chǎn)生更高的IFN-γ和更強(qiáng)烈的抗腫瘤免疫應(yīng)答，究其原因?yàn)槟[瘤細(xì)胞粗提物特異性不高或者丟失導(dǎo)致，進(jìn)一步證明特異性的腫瘤抗原修飾DC疫苗效果更佳。

3.2 基因轉(zhuǎn)染樹突細(xì)胞的方式

3.2.1 物理化學(xué)法 物理法常用為顯微注射法及電穿孔法，化學(xué)法常用如DNA-磷酸鈣共沉淀法、二乙基氨基乙基-葡聚糖法、聚陽離子-二甲基亞砜法等，上述兩種轉(zhuǎn)染技術(shù)易于操作，具有可重復(fù)性，對(duì)靶細(xì)胞的影響因素少，但轉(zhuǎn)染率相對(duì)不高。

3.2.2 非病毒基因轉(zhuǎn)移法 將目的基因以非病毒載體包裝攜帶，通過細(xì)胞膜內(nèi)吞或膜溶合的方式將基因組導(dǎo)入靶細(xì)胞。常用試劑如陽離子脂質(zhì)體和陽離子聚合物。它無免疫原性，且不攜帶致病基因，對(duì)負(fù)載的DNA大小不限制，可負(fù)荷RNA、核糖體及其他大分子物質(zhì)。Zou等[14]將負(fù)載在陽離子脂質(zhì)體上的p53用于肺癌的基因治療，發(fā)現(xiàn)不管在體內(nèi)還是體外實(shí)驗(yàn)中均可使腫塊縮小，但脂質(zhì)體的靶向性欠佳。

3.2.3 病毒載體轉(zhuǎn)染法 以病毒作為載體將目的基因轉(zhuǎn)染至靶細(xì)胞染色體從而獲得持續(xù)表達(dá)，常用如：逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒以及單純皰疹病毒等。病毒載體可承載比較大的外源基因，同時(shí)高表達(dá)多個(gè)目的基因，轉(zhuǎn)染率較非病毒載體和物理化學(xué)法高，目的基因可持續(xù)表達(dá)，是目前常用的轉(zhuǎn)染方式之一。Lin等[15]使用慢病毒作為MAGE-A3基因載體轉(zhuǎn)染DC，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染率高達(dá)(80±2.5)%，轉(zhuǎn)染后DC疫苗高表達(dá)CD80、CD86、HLA-DR，對(duì)表達(dá)MAGE-A3抗原的細(xì)胞株具有殺傷作用。

4 特異性基因修飾DC疫苗在肺癌中的應(yīng)用

4.1 基因修飾DC疫苗治療肺癌的優(yōu)勢(shì)

基因修飾DC疫苗相較于傳統(tǒng)的DC疫苗治療肺癌具有如下優(yōu)勢(shì)：①基因轉(zhuǎn)染后DC疫苗能表達(dá)全蛋白序列，包含所有抗原位點(diǎn)，相較于單純的外源性刺激能更有效地進(jìn)行抗原遞呈；②表達(dá)抗原時(shí)間更持久，增強(qiáng)抗原提呈能力，同時(shí)高表達(dá)共刺激因子和細(xì)胞因子的能力，對(duì)抗腫瘤細(xì)胞的抑制作用，具有更強(qiáng)的激發(fā)免疫應(yīng)答反應(yīng)能力；③病毒載體轉(zhuǎn)染后刺激DC細(xì)胞成熟并延長存活時(shí)間，增強(qiáng)免疫應(yīng)答；④基因修飾DC疫苗表達(dá)抗原精準(zhǔn)，不含有正常人體抗原，不易誘發(fā)自身免疫疾病?；蛐揎桪C疫苗的高效性和安全性奠定了其在臨床腫瘤治療中的地位。

4.2 基因修飾DC疫苗在肺癌中的臨床轉(zhuǎn)化研究

肺癌的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多因素多階段過程，其中外界理化因素是誘因，不同癌基因上調(diào)表達(dá)或抑癌基因突變、異常甲基化及缺失被認(rèn)為是不同病理類型肺癌發(fā)生的早期分子事件?；诨蛩降母淖?，我們通過改造DC疫苗特異性呈遞腫瘤抗原，達(dá)到殺傷腫瘤細(xì)胞的功效。有研究發(fā)現(xiàn)15%～20%的非小細(xì)胞肺癌患者存在RAS原癌基因突變，其中90%為K-RAS基因突變[16]。Zhao等[17]通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)：K-ras 基因修飾的DC 疫苗相較于單純DC疫苗組能更快更高效地縮小荷瘤小鼠腫塊。針對(duì)約有50%以上的非小細(xì)胞肺癌出現(xiàn)抑癌P53基因突變[18]，有人評(píng)估了腺病毒轉(zhuǎn)染特異性基因P53的DC疫苗在肺癌中的療效和安全性，Ⅰ/Ⅱ期臨床試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)納入的40%～50%患者有良好的抗腫瘤免疫應(yīng)答，且無不良反應(yīng)；Ⅲ期臨床試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)回輸P53/DC疫苗有效率和進(jìn)展率分別為78.6%和33.3%，進(jìn)一步證實(shí)了特異性表達(dá)腫瘤抗原的DC疫苗的有效性和安全性[19]。細(xì)胞因子可使免疫細(xì)胞趨向癌巢中心，促進(jìn)DC識(shí)別抗原并高表達(dá)共刺激分子，在抗腫瘤免疫應(yīng)答中具有重要作用，Morandi等[20]研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞因子修飾的DC疫苗能夠持續(xù)表達(dá)并增強(qiáng)抗腫瘤免疫應(yīng)答。陳吉泉等[21]研究發(fā)現(xiàn)IL-12基因修飾的DC疫苗可增強(qiáng)NK活性，更加高效地激發(fā)CTL抗腫瘤免疫應(yīng)答。癌胚抗原(CEA)作為肺癌早期篩查的一個(gè)指標(biāo)，側(cè)面反映腫瘤的活動(dòng)程度，吳軍等[22]利用癌胚抗原重組痘苗病毒(rV-CEA)轉(zhuǎn)染樹突狀細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染了rV-CEA的DC疫苗表面高表達(dá)MHC-CEA抗原肽復(fù)合物、共刺激分子和細(xì)胞間粘附分子，高效地誘導(dǎo)免疫應(yīng)答對(duì)抗分泌性CEA的腫瘤細(xì)胞。Ishikawa等[23]臨床Ⅰ期研究發(fā)現(xiàn)半乳糖?；拾贝夹揎椀腄C疫苗針對(duì)進(jìn)展期肺癌有一定的治療作用，且無不良應(yīng)出現(xiàn)。CK19在肺癌中高表達(dá)，通過慢病毒將CK19轉(zhuǎn)染至DC疫苗相較單純DC疫苗，能夠更高效地縮小荷瘤小鼠肺癌腫塊[24]。

4.3 基因修飾DC疫苗治療肺癌的不足

特異性基因修飾DC疫苗治療肺癌具有廣泛的前景，但仍存在不足之處。首先，基因工程制作的高耗時(shí)耗費(fèi)在經(jīng)濟(jì)上存在一定的發(fā)展限制，仍需探索更高效簡便安全的基因轉(zhuǎn)染技術(shù)。其次，病毒轉(zhuǎn)染DC后可能出現(xiàn)基因重組或互補(bǔ)致表達(dá)異常，具有潛在的致病危險(xiǎn)。Zhang等制作了一種新型的溶瘤腺病毒疫苗：使用端粒反轉(zhuǎn)錄酶促進(jìn)溶瘤腺病毒進(jìn)行抗癌作用，單純皰疹病毒腺苷激酶作為自殺基因控制溶瘤腺病毒的存亡，在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中證實(shí)了該新型疫苗的有效性和安全性[25]，可能克服DC疫苗病毒轉(zhuǎn)染后的不良反應(yīng)。

總之，基因表達(dá)異常是細(xì)胞癌變的原因之一，從分子水平上尋找新的治療途徑是目前肺癌治療的研究熱點(diǎn)，特異性基因修飾DC疫苗具有精準(zhǔn)的靶向性和強(qiáng)大的抗原遞呈能力，達(dá)到個(gè)體化免疫殺傷治療，具有可靠的理論基礎(chǔ)和成功的臨床前期試驗(yàn)基礎(chǔ)，是目前理想的、有希望的治療途徑之一。但由于基因工程的耗費(fèi)、技術(shù)的限制及可能存在的細(xì)胞免疫治療不良反應(yīng)限制了其發(fā)展，廣泛應(yīng)用于臨床仍需更嚴(yán)謹(jǐn)?shù)囊呙缭O(shè)計(jì)和樣本量更大的臨床前期探索。

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江西省科技廳重大創(chuàng)新項(xiàng)目(編號(hào)：20143ACG70020)

330000 南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院(簡 艷)；330029 江西省腫瘤醫(yī)院(鈄方芳)

鈄方芳

10.3969/j.issn.1001-5930.2017.10.052

R734.2

B

1001-5930(2017)10-1735-03

2017-02-14

2017-03-23)

(編輯甘艷)