國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局保健食品審評(píng)中心（100070）蔡鐵全

北京市保健品化妝品技術(shù)審評(píng)中心（100053）劉彬 周立新

北京市藥品檢驗(yàn)所（北京市保健食品化妝品檢驗(yàn)中心）（100035）趙晉燕 胡宇馳 金鑫

隨著生活水平的提高和人們對(duì)自己健康狀況的重視，對(duì)保健食品的研究也不斷深入。本文總結(jié)了近年來進(jìn)行保健食品毒理學(xué)試驗(yàn)和功能驗(yàn)證動(dòng)物學(xué)試驗(yàn)研究中出現(xiàn)的一些問題，希望從事保健食品研究與試驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)室能夠互相借鑒，避免工作中的一些失誤。

1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)中的問題

1.1 劑量設(shè)計(jì)不合理 保健食品作為特殊食品一般來說相對(duì)安全，有些實(shí)驗(yàn)室在進(jìn)行毒理學(xué)試驗(yàn)的時(shí)候未能充分考慮受試樣品的所有檢測(cè)試驗(yàn)的要求。例如，急性毒性試驗(yàn)僅僅是試驗(yàn)劑量達(dá)到5g/kgBW，但受試樣品并不是最大的溶解度、最大的給予體積。遺傳毒性試驗(yàn)因?yàn)樾枰_(dá)到試驗(yàn)要求的10g/kgBW給予受試樣品，這樣就導(dǎo)致急性毒性試驗(yàn)受試樣品的使用濃度和劑量均低于遺傳毒性試驗(yàn)劑量。一般來說，急性毒性試驗(yàn)必須采用最大溶解度和最大灌胃容積來進(jìn)行MTD試驗(yàn)，并應(yīng)該盡量做到一日內(nèi)給予劑量不小于10g/kgBW。

30天喂養(yǎng)試驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)，應(yīng)該想辦法使高劑量達(dá)到人用劑量的100倍或100倍以上；如果成品添加到飼料中也不能達(dá)到100倍以上時(shí)，應(yīng)該適當(dāng)減少輔料或者直接采用原料來進(jìn)行試驗(yàn)，從而盡量達(dá)到符合要求的安全倍數(shù)的要求。如果是液體受試樣品，必須采用適當(dāng)?shù)姆椒ㄌ岣邉┝浚ㄈ鐫饪s受試樣品），以保證30天喂養(yǎng)試驗(yàn)的給予倍數(shù)達(dá)到100倍以上。進(jìn)行喂養(yǎng)試驗(yàn)時(shí)，當(dāng)受試樣品的摻入量高于5%時(shí)，應(yīng)添加酪蛋白，并應(yīng)該說明酪蛋白添加量的計(jì)算過程。劑量設(shè)計(jì)中，如果需要去掉受試樣品中含有的某種成分時(shí)，去除后給予受試樣品的劑量和人體實(shí)際使用劑量之間的折算關(guān)系也應(yīng)有計(jì)算說明，應(yīng)合理設(shè)計(jì)。

1.2 測(cè)定指標(biāo)不合理 主要是指標(biāo)嚴(yán)重缺失。例如急性毒性試驗(yàn)中未測(cè)定給予受試樣品后動(dòng)物的體重變化；精子畸形試驗(yàn)中觀察“尾折疊”時(shí)，沒有詳細(xì)說明判定標(biāo)準(zhǔn)；30天喂養(yǎng)試驗(yàn)中未按要求測(cè)定體重、攝食量、食物利用率、臟器重量，測(cè)定的血液學(xué)、血清生化學(xué)指標(biāo)有缺項(xiàng)；受試樣品具有某些功效，但是在毒性試驗(yàn)中未觀察到相關(guān)的改變。（如具有促進(jìn)排便功效的樣品，在進(jìn)行急性毒性試驗(yàn)及30天喂養(yǎng)試驗(yàn)的時(shí)候未觀察動(dòng)物排便情況。）

1.3 對(duì)照品選擇不合理 Ames試驗(yàn)中陽性誘變劑的選擇不合理（如在進(jìn)行+S9試驗(yàn)時(shí)，TA102的陽性對(duì)照不應(yīng)選擇順鉑，而應(yīng)選擇1，8-二羥基蒽醌）；受試樣品配制使用溶媒和陰性對(duì)照組給予的受試物不一致（如受試樣品使用蒸餾水配制，卻以植物油作為陰性對(duì)照組）；當(dāng)受試樣品中含有酒基的時(shí)候，未設(shè)定酒基對(duì)照組；Ames試驗(yàn)兩次試驗(yàn)不能共用一個(gè)陽性對(duì)照組，每次試驗(yàn)均應(yīng)設(shè)定陽性對(duì)照組。

1.4 受試物的處理不合理 樣品處理時(shí)不能保證樣品的穩(wěn)定性：當(dāng)受試樣品中含有維生素E或者魚油時(shí)，試驗(yàn)采用摻入法給予動(dòng)物，不能合理解釋如何保證所含的維生素E不被氧化或魚油在摻入飼料后還能具有良好的穩(wěn)定性。

溶媒選擇不合理：如非水溶性的受試物選擇蒸餾水溶解，含有蜂膠、大豆油、卵磷脂成分的樣品采用蒸餾水溶解是不妥當(dāng)?shù)模徊煌囼?yàn)采用不同的溶媒進(jìn)行受試樣品的稀釋，例如：某一受試樣品，急性毒性試驗(yàn)、精子畸變?cè)囼?yàn)及微核試驗(yàn)用2%淀粉溶液做溶媒，而Ames試驗(yàn)、30天喂養(yǎng)試驗(yàn)用蒸餾水做溶媒。實(shí)際上，設(shè)計(jì)中應(yīng)注意同一受試樣品的毒理學(xué)、功能學(xué)試驗(yàn)的溶媒應(yīng)相同。

樣品預(yù)處理不合理：無菌試驗(yàn)的受試樣品未滅菌即行試驗(yàn)；滅菌操作方法未進(jìn)行詳細(xì)說明，如采用高壓滅菌時(shí)未注明滅菌的溫度、時(shí)間。采用過濾滅菌時(shí)未說明采用何種濾膜，孔徑。滅菌方法不合理（如受試樣品中含有不耐熱的活性物質(zhì)，卻采用高壓滅菌的方法除菌或者是采用非常規(guī)的的滅菌條件未能說明使用該條件的理由）；Ames試驗(yàn)中采用的受試樣品含有組氨酸或者是糖類、其他氨基酸類的成分，當(dāng)這類成分能夠影響結(jié)果的判斷時(shí)，在試驗(yàn)時(shí)未除去影響的成分或者是處理的過程、方法沒有詳細(xì)的描述；Ames試驗(yàn)的受試樣品中組氨酸的含量較低，不會(huì)誘發(fā)回復(fù)突變頻率增高，試驗(yàn)前去除組氨酸卻沒有說明去除的理由；30天喂養(yǎng)試驗(yàn)時(shí)候使用去除輔料的受試樣品，未說明去除輔料的方法或者是去除輔料樣品的來源；乙醇含量超15%時(shí)，未將乙醇含量降低到15%。

2 試驗(yàn)過程中的問題

2.1 試驗(yàn)結(jié)果的處理不合理 試驗(yàn)結(jié)果未選擇適當(dāng)?shù)慕y(tǒng)計(jì)方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：主要有各受試樣品組的參比組錯(cuò)誤（應(yīng)與陰性對(duì)照組/空白對(duì)照組進(jìn)行比較）；當(dāng)受試樣品組與陰性對(duì)照組（空白對(duì)照組）進(jìn)行比較，差異具有顯著性意義的時(shí)候未進(jìn)行標(biāo)注，也未進(jìn)行相關(guān)的分析說明；試驗(yàn)結(jié)果中的每一項(xiàng)具有顯著性差異的檢測(cè)指標(biāo)未逐一標(biāo)注并說明。例如：30天喂養(yǎng)試驗(yàn)中某次測(cè)定的食物利用率低于其他測(cè)定值，未進(jìn)行相應(yīng)的說明；血清生化學(xué)測(cè)定指標(biāo)、血液學(xué)測(cè)定指標(biāo)中的某項(xiàng)指標(biāo)低于或高于對(duì)照組，未說明原因。

2.2 未注意試驗(yàn)數(shù)據(jù)與背景數(shù)據(jù)比較 每個(gè)實(shí)驗(yàn)室均應(yīng)有自己的相關(guān)背景數(shù)據(jù)積累，如正常動(dòng)物微核的千分率，正常小鼠精子畸形的種類及發(fā)生率。試驗(yàn)得到的數(shù)據(jù)應(yīng)注意與背景數(shù)據(jù)的比較，科學(xué)分析試驗(yàn)結(jié)果與試驗(yàn)數(shù)據(jù)的毒理學(xué)意義。

例如Amse試驗(yàn)中：陰性對(duì)照自發(fā)回變率超出參考值未說明原因；陽性對(duì)照的自發(fā)回變率、精子畸形試驗(yàn)和微核試驗(yàn)的陽性對(duì)照組的精子畸形率、微核率低于文獻(xiàn)報(bào)道時(shí)，沒有相關(guān)分析；當(dāng)試驗(yàn)結(jié)果超出一般的范圍時(shí)，未結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室的背景數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

30天喂養(yǎng)試驗(yàn)中測(cè)定的血液學(xué)、血清生化學(xué)指標(biāo)受試樣品組與對(duì)照組的檢測(cè)指標(biāo)有差異時(shí)，未進(jìn)行分析，未提供本實(shí)驗(yàn)室的背景數(shù)據(jù)及測(cè)定的質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)。

組織病理學(xué)檢查中發(fā)現(xiàn)某種病理改變?cè)诙嘀粍?dòng)物身上發(fā)生，沒有分析說明該種病變發(fā)生的原因（如是否為動(dòng)物的自發(fā)病變，是否與受試樣品有關(guān)）；當(dāng)組織病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)動(dòng)物出現(xiàn)病變時(shí)，在病理檢查報(bào)告中沒有詳細(xì)說明病變的種類，病變發(fā)生的數(shù)量，發(fā)生病變的動(dòng)物的性別。

2.3 試驗(yàn)中原始記錄不詳細(xì) 試驗(yàn)的原始記錄應(yīng)當(dāng)用簽字筆手寫或填寫表格中有關(guān)內(nèi)容，必須做到真實(shí)、及時(shí)、準(zhǔn)確和完整，并規(guī)范化和表格化。原始記錄不能只包括數(shù)據(jù)收集，還要證明所有程序都是按照要求在正確的時(shí)間正確實(shí)施，做到規(guī)范記錄，不得漏記和隨意涂改，不得偽造、編造數(shù)據(jù)。如果數(shù)據(jù)缺失或沒有完整的試驗(yàn)記錄，試驗(yàn)的正確性將受到質(zhì)疑。例如使用的材料信息不全：生化試劑盒缺乏使用說明書，不記錄生化試劑的批號(hào)、來源等，不記錄陽性對(duì)照物的批號(hào)、來源等。特殊管理的試劑，沒有按照國(guó)家規(guī)定進(jìn)行管理，例如麻醉藥品、遺傳毒性試驗(yàn)使用的陽性對(duì)照品沒有出入庫記錄，沒有配制、使用與廢棄記錄等。有的試驗(yàn)，實(shí)際結(jié)果是由儀器記錄生成的數(shù)據(jù)，結(jié)果儀器中缺乏原始文件，只有手寫的數(shù)據(jù)記錄。

2.4 試驗(yàn)中使用材料不符合規(guī)范要求 例如實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的體重不符合試驗(yàn)要求、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的級(jí)別不符合要求。

3 試驗(yàn)報(bào)告中的問題

3.1 未注意全文的前后一致性 全文的內(nèi)容描述前后不一致或使用單位符號(hào)不統(tǒng)一。例如：毒理學(xué)報(bào)告中要求應(yīng)表示為mg/kgBW或ml/kgBW，但報(bào)告中的實(shí)際樣品濃度及給予劑量與設(shè)計(jì)樣品濃度及給予劑量不一致（原始資料中設(shè)計(jì)劑量為10g/kgBW，檢查報(bào)告中為8g/kgBW），或者檢查報(bào)告中前后描述不一致（方法部分描述的劑量為10g/kgBW，結(jié)論部分變?yōu)?g/kgBW），或者報(bào)告中與原始記錄不一致（原始記錄中記錄為mg/kgBW，但報(bào)告中為ml/kgBW）。

3.2 報(bào)告結(jié)果不規(guī)范 例如表格中數(shù)據(jù)的表示不符合要求：檢驗(yàn)報(bào)告表格中的數(shù)據(jù)一般以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。精子畸形試驗(yàn)、微核試驗(yàn)結(jié)果中，畸形率、微核率、PCE/RBC（PEC/NCE）不是以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示的，且精子畸形試驗(yàn)結(jié)果未列明畸形的類型；用詞用語不規(guī)范：報(bào)告中判定結(jié)論“無毒物”規(guī)范為“無毒級(jí)”。

3.3 報(bào)告結(jié)果的不完整 包括未提供相關(guān)材料信息：如未提供與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物相關(guān)的材料（動(dòng)物合格證號(hào)、生產(chǎn)許可證號(hào)、使用許可證號(hào)）。當(dāng)要求使用特定級(jí)別、性別、體重的動(dòng)物時(shí)，試驗(yàn)報(bào)告中未進(jìn)行說明。關(guān)鍵的試驗(yàn)方法應(yīng)進(jìn)行說明，以保證能夠重現(xiàn)試驗(yàn)。例如受試物的配制方法在報(bào)告中應(yīng)進(jìn)行簡(jiǎn)明扼要的敘述，但有的報(bào)告中配制的方法不明確，無稱量體積，無加入溶媒的量，最終濃度等配制方法的描述。

3.4 報(bào)告的真實(shí)性存在質(zhì)疑 如某受試樣品的受理日期為2008年3月18日，毒理學(xué)試驗(yàn)報(bào)告簽發(fā)日期為2006年3月11日，動(dòng)物功能試驗(yàn)報(bào)告簽發(fā)日期為2006年1月10日，功能試驗(yàn)報(bào)告及毒理學(xué)試驗(yàn)報(bào)告的簽發(fā)日期遠(yuǎn)遠(yuǎn)早于受試樣品的受理日期。

4 小結(jié)

綜上所述，在目前巨大的市場(chǎng)需求的前提下，各實(shí)驗(yàn)室應(yīng)該努力提高本單位的試驗(yàn)水平，同時(shí)認(rèn)真解讀所使用的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，本著嚴(yán)謹(jǐn)、科學(xué)的態(tài)度完成檢測(cè)試驗(yàn)，出具檢測(cè)報(bào)告。