王文耀，張鴻飛，唐淼，王立超，劉龍龍

（河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院 普通外科，河北 石家莊 050000）

肝癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一，約80%～90%是原發(fā)性肝細胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）[1]，有研究數(shù)據(jù)顯示，肝癌的發(fā)病率和病死率均在惡性腫瘤的排名中靠前，全球每年約有60多萬的新增肝癌患者，其中約有58萬人死于肝癌[2]。肝癌是一種起源于肝細胞的惡性腫瘤，肝癌的最主要病因目前被認為是病毒感染（例如乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒）、非病毒因素（酒精以及黃曲霉素）以及遺傳性肝病和肝硬化[3]。在我國，目前肝癌的主要致病因素為乙型肝炎病毒[4]。目前雖然肝癌的發(fā)病機制尚不完全闡明，但抑癌基因的異常失活以及癌基因的過度激活被認為是造成肝癌發(fā)生的主要因素[5]。

微小RNA（miRNA）是一類非編碼的小分子RNA，一般可以在轉(zhuǎn)錄水平以及轉(zhuǎn)錄后水平上對基因表達進行調(diào)控[6]。近年來，很多研究[7-8]表明miRNA在各種生物學(xué)功能和疾病的調(diào)節(jié)方面起到重要的作用，某些miRNA的表達異?？梢詫?dǎo)致腫瘤的發(fā)生發(fā)展。目前有很多研究報道指出，肝癌的發(fā)生發(fā)展以及預(yù)后復(fù)發(fā)均與一系列特定的miRNA表達異常密切相關(guān)。因此通過對miRNA的研究可以為更好的發(fā)現(xiàn)肝癌的發(fā)病機制、并且為肝癌的分子診斷治療提供理論依據(jù)、與此同時也可以作為判斷肝癌預(yù)后的新的標(biāo)準。miR-21作為典型的致癌性miRNA被廣泛研究。有研究[9]表明，miR-21在很多腫瘤中存在過度表達的情況，例如乳腺癌、宮頸癌、肺癌、結(jié)腸癌以及肝癌中均有miR-21過表達的報道。miR-21的過表達可以促進肝癌細胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力，此外，也有研究[10]指出PTEN（phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten）可以作為miR-21的一個靶基因，miR-21通過調(diào)節(jié)PTEN的表達來調(diào)節(jié)肝癌細胞的侵襲轉(zhuǎn)移。但是目前關(guān)于miR-21調(diào)節(jié)肝癌細胞增殖情況的報道較少。

本研究通過分析119對肝癌標(biāo)本來檢驗miR-21和PTEN在肝癌中的表達情況與它們之間的聯(lián)系，并且探討了miR-21在肝癌的發(fā)展中的作用。進一步通過HepG2細胞進行了一系列細胞實驗探討miR-21如何通過調(diào)節(jié)PTEN蛋白的表達調(diào)節(jié)肝癌細胞的增殖，以期待由此能找到肝癌新的診療手段。

1 材料與方法

1.1 材料

119例術(shù)前未接受過放化療的經(jīng)診斷確診為肝癌的肝癌患者，取其腫瘤組織及癌旁組織，組織取下后置于液氮中備用。人肝癌HepG2細胞株（實驗室凍存），DMEM培養(yǎng)基（hyclone，美國），胎牛血清（hyclone，美國），TRIzol（上海生工），氯仿（上海生工），異丙醇（上海生工），抗體:PTEN，cyclin D1，AKTpSer-473和GAPDH（美國Santa），SYBR Green（美國Promega）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 在25 mL 培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，并加入適量含10%胎牛血清的無抗生素的DMEM培養(yǎng)液于5%CO2，37 ℃的孵箱條件下培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細胞用于實驗。

1.2.2 MTT實驗 分別將miR-21模擬物及對照及miR-21抑制物及對照（上海吉凱生物）轉(zhuǎn)染處于對數(shù)生長期的HepG2細胞中，培養(yǎng)12 h后，分別于0、12、24、36、48 h使用MTT方法測量細胞增殖情況，在490 nm處記錄吸光值。細胞增殖的抑制率計算公式為:抑制率=1-（劑量組平均OD值/對照組平均OD值）×100%。miR-21模擬物:AGC TAA AAA TAG CTT ATC AGA CTG ATG TTG AG；miR-21反義序列:GAT CCT CAA CAT CAG TCT GAT AAG CTA TTT TT。

1.2.3 雙報告基因?qū)嶒?分別將miR-21模擬物及TK-PTEN與 PTEN WT及 PTEN DEL（PCR得到去除PTEN與miR-21結(jié)合的突變質(zhì)粒）共同轉(zhuǎn)染到處于對數(shù)生長期的HepG2細胞中，將報告基因的細胞裂解液充分混勻，吸盡去除細胞培養(yǎng)液后可以直接加入報告基因細胞裂解液；充分裂解后，4 ℃ 下 10 000～15 000 g 離心 3～5 min，取上清用于測定。

1.2.4 Western blot 吸取 20～50 μg蛋白樣品，加入相應(yīng)比例的SDS凝膠上樣緩沖液 (6×Loading Buffer)，煮沸變性5 min，冷卻后進行SDS-PAGE電泳，電泳濃縮膠電壓90 V，分離膠110 V，待溴酚藍電泳至凝膠的底部時停止電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后，一抗4 ℃過夜。二抗室溫1 h。

1.2.5 RT-PCR 取適量（50～100 mg）組織樣品粉碎組織，加1 mL TRIzol試劑在室溫下靜置1～5 min。加0.2 mL氯仿，振搖15 s，室溫靜置2～3 min。離心 15 min（12 000 g，2～8 ℃）。吸取上層水相，0.4～0.5 mL到新的Ep管中，加入0.5 mL異丙醇，上下顛倒混勻，室溫放置5～10 min。離心10 min（12 000 g，2～8 ℃）棄上清。加入75 %乙醇，振搖數(shù)次。離心5 min（7 500 g，2～8 ℃）。真空干燥后，用DEPC處理水30～40 μL溶解沉淀，55～60 ℃孵育 10～15 min。隨后反轉(zhuǎn)錄成cDNA，進行RT-PCR反應(yīng)。所用引物為PTEN正向:5'-AGC TGG AAA GGG ACG AAC TG-3'，反向:5'-ACA CAC AGG TAA CGG CTG AG-3'；miR-21正向:5'-ACA CTC CAG CTG GGC CAG TGT TGG-3'，cyclin D1正 向:5'-CCG AGG AGC TGC TGC AAA TGG AG-3'，反向:5'-GAA ATC GTG CGG GGT CAT TGC G-3'；U6正向:5'-CTC GCT TCG GCA GCA CA-3'，反向:5'-AAC GCT TCA CGA ATT TGC GT-3'；GAPDH正向:5'-CATCCCTTCTCCCCACACAC-3'，反向:5'-AGT CCC AGG GCT TTG ATT TG-3'。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

使用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。使用配對樣本檢驗分析癌與癌旁組織的miR-21相對表達量的差異程度，使用Mann-Whitney 檢驗分析miR-21相對表達量與肝癌患者臨床病理因素的相關(guān)性，使用Spearman's rank檢驗分析miR-21相對表達量與PTEN相對表達量的關(guān)聯(lián)性。其中P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 肝癌組織中miR-21與PTEN的表達情況

RT-PCR結(jié)果顯示，肝癌患者的腫瘤組織中miR-21普遍高于癌旁組織，PTEN則相反（均P＜0.05）（圖1）；相關(guān)性分析顯示，miR-21與PTEN的表達具有一定相關(guān)性（r2=0.6767，P＜0.05）；報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果顯示，在HepG2細胞中miR-21可以打靶PTEN并且抑制其表達（P＜0.05）（圖2）。

2.2 miR-21與肝癌患者臨床病理因素的關(guān)系

統(tǒng)計學(xué)分析顯示，miR-21的表達與肝癌患者AFP水平及TNM分期有關(guān)（均P＜0.05），而與患者年齡、性別、腫瘤大小無關(guān)（均P＞0.05）（表1）。

圖1 肝癌組織與癌旁組織中miR-21與PTEN的表達

圖2 miR-21對PTEN轉(zhuǎn)錄的抑制

表1 miR-21與肝癌患者臨床病理因素的關(guān)系分析

2.3 miR-21對響肝癌細胞增殖的影響

miR-21過表達后，肝癌細胞HepG2的增殖明顯增強，miR-21受到抑制后，肝癌細胞HepG2的增殖明顯抑制，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）（圖3）。

圖3 不同miR-21表達狀態(tài)HepG2細胞的增殖情況

2.4 miR-21對PTEN及其下游增殖相關(guān)通路蛋白的影響

miR-21過表達或抑制后，可以抑制或上調(diào)PTEN的表達，并影響其下游的Akt通路的磷酸化水平與cyclin D1的表達，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（圖4）。

圖4 miR-21對PTEN及其下游增殖相關(guān)通路蛋白表達的影響 A:miR-21過表達；B:miR-21抑制

3 討 論

肝癌作為一種常見的惡性腫瘤，全球每年的肝癌患者新增數(shù)量約占惡性腫瘤的4%，目前每年肝癌的新增病例超過62萬例，肝癌的發(fā)病居惡性腫瘤的第6位，肝癌的病死率居腫瘤相關(guān)死亡的第3位[11]。目前我國的肝癌發(fā)病率在世界居高不下，我國的發(fā)病人數(shù)約占全球的50%以上，是國內(nèi)僅次于肺癌的腫瘤相關(guān)死亡疾病[12]。肝癌的發(fā)生發(fā)展涉及多種細胞通路的異常調(diào)控，肝癌細胞與正常細胞相比會出現(xiàn)增殖、分化、凋亡與侵襲轉(zhuǎn)移等多種功能蛋白的異常表達[13]。

miRNA能夠調(diào)控轉(zhuǎn)錄后蛋白水平，并且通過調(diào)節(jié)各種信號分子（生長因子、轉(zhuǎn)錄因子等）來實現(xiàn)對細胞增殖、分化、新陳代謝、侵襲轉(zhuǎn)移等的調(diào)控[14]。目前的研究指出，miRNA與人類的多種重大疾病如病毒感染、腫瘤、心血管疾病等的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。大量證據(jù)表明正常組織中的miRNA表達圖譜與腫瘤組織中有明顯差異，很多腫瘤中有很多miRNA被被報道存在異常表達，這些miRNA在腫瘤中可能發(fā)揮著類似抑癌基因或原癌基因的作用[15]。miRNA即可以作為抑癌基因下調(diào)原癌基因的活性，也可以作為原癌基因下調(diào)抑癌基因的表達[16-17]，這些均說明miRNA可以作為一種潛在的腫瘤標(biāo)志物用于腫瘤的診斷或者預(yù)后評估。miRNA在肝癌的發(fā)生發(fā)展中起到重要作用，很多miRNA被證明可以直接參與肝癌細胞的增殖、凋亡、分化與侵襲轉(zhuǎn)移[18]。因此，對于miRNA的研究不但可以用于診斷肝癌、以及肝癌的個體化治療還可以作為判斷肝癌預(yù)后的重要工具。

miR-21在多種腫瘤中被認為起到促進腫瘤發(fā)生發(fā)展的作用，它可以通過調(diào)節(jié)多種靶基因的表達來參與腫瘤的調(diào)控[19]。研究表明，在膠質(zhì)瘤中miR-21可以通過調(diào)節(jié)TIMP3與RECK以及基質(zhì)金屬蛋白酶來調(diào)節(jié)膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展；在乳腺癌中miR-21也可以通過調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白來促進乳腺癌細胞的生長；在腸癌細胞系中的研究證實，miR-21可以通過調(diào)節(jié)PDCD4以及相關(guān)蛋白來促進細胞的侵襲能力；肝癌細胞中，miR-21也被證明是高表達的[19]，并且其可以通過調(diào)節(jié)PTEN的表達來促進肝癌細胞的侵襲轉(zhuǎn)移[20-21]，但是關(guān)于其如何調(diào)節(jié)肝癌細胞的增殖報道較少。研究[22]表明多種腫瘤中PTEN基因的缺失或者突變可能是腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要機制，有報道指出PTEN可以通過調(diào)節(jié)下游的PI3K/AKT通路來影響細胞的增殖與侵襲轉(zhuǎn)移。并且也有研究[23]表明約27%的肝癌中存在PTEN的雜合性缺失。

本研究通過分析119例肝癌患者的組織以及癌旁組織發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)腫瘤組織中miR-21的表達普遍高于癌旁組織，進一步分析發(fā)現(xiàn)miR-21的表達與肝癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。在對患者組織樣本進行分析時發(fā)現(xiàn)腫瘤組織中PTEN的表達明顯低于癌旁組織并且與miR-21具有一定相關(guān)性。由此推斷PTEN可能與miR-21具有一定相關(guān)性，通過報告基因?qū)嶒灒∽C了miR-21可以特異性的打靶并且抑制PTEN的表達。由于PTEN可以調(diào)節(jié)腫瘤的一系列生物學(xué)功能，尤其是對腫瘤細胞的增殖有很明確的調(diào)節(jié)作用，因此對miR-21是否可以通過調(diào)節(jié)PTEN的表達來影響HePG2細胞的增殖情況進行了分析，MTT試驗發(fā)現(xiàn)miR-21可以通過抑制PTEN的表達來促進HepG2細胞的增殖。接下來我們通過Western blot與RT-PCR實驗分析了miR-21對PTEN下游經(jīng)典的AKT通路的作用，發(fā)現(xiàn)miR-21通過抑制PTEN來抑制其下游Akt通路的磷酸化水平，也提高了cyclin D1的表達，進而促進了肝癌細胞的增殖水平。

參考文獻

[1]涂青松,何剪太,陳偉.抑制過氧化物酶1表達對肝癌細胞放射敏感性的影響[J].中國普通外科雜志,2016,25(2):245–251.doi:10.3978/j.issn.1005–6947.2016.02.015.Tu QS,He JT,Chen W.Enhancement of radiosensitivity of hepatocellular carcinoma cells by inhibition of peroxiredoxin 1 expression[J].Chinese Journal of General Surgery,2016,25(2):245–251.doi:10.3978/j.issn.1005–6947.2016.02.015.

[2]石世代,馮潛,裴軒增,等.干擾素誘導(dǎo)跨膜蛋白3在肝癌中的表達及功能研究[J].中國普通外科雜志,2016,25(2):238–244.doi:10.3978/j.issn.1005–6947.2016.02.014.Shi SD,Feng Q,Pei XZ,et al.Interferon-induced transmembrane protein3 expression and its function in hepatocellular carcinoma[J].Chinese Journal of General Surgery,2016,25(2):238–244.doi:10.3978/j.issn.1005–6947.2016.02.014.

[3]Lin CC,Cheng YT,Chen M WT,et al.The Effectiveness of Multiple Electrode Radiofrequency Ablation in Patients with Hepatocellular Carcinoma with Lesions More than 3 cm in Size and Barcelona Clinic Liver Cancer Stage A to B2[J].Liver Cancer,2016,5(1):8–20.doi:10.1159/000367755.

[4]He ZX,Xiang P,Gong JP,et al.Radiofrequency ablation versus resection for Barcelona clinic liver cancer very early/early stage hepatocellular carcinoma:a systematic review[J].Ther Clin Risk Manag,2016,12:295–303.doi:10.2147/TCRM.S96760.

[5]Kus T,Aktas G,Sevinc A,et al.Tyrosine kinase inhibitors improve parenchymal findings of liver cirrhosis in a patient exhibiting concomitant hepatocellular carcinoma and renal cell cancer[J].Mol Clin Oncol,2016,4(2):290–292.

[6]Shyu AB,Wilkinson MF,van Hoof A,et al.Messenger RNA regulation:to translate or th degrade[J].EMBO J,2008,27(3):471–478.

[7]Dimopoulos K,Gimsing P,Gr?nb?k K.Aberrant mircroRNA expression in multiple myeloma[J].Eur J Haematol,2013,91(2):95–105.doi:10.1111/ejh.12124.

[8]Bommer GT,Gerin I,Feng Y,et al.p53-mediated activation of miRNA34 candidate tumor-suppressor genes[J].Curr Biol,2007,17(15):1298–1307.

[9]NajafiZ,SharifiM,Javadi G.Degradation of miR-21 induces apoptosis and inhibits cell proliferation in human hepatocellular carcinoma[J].Cancer Gene Ther,2015,22(11):530–535.doi:10.1038/cgt.2015.51.

[10]Li ZB,Li ZZ,Li L,et al.MiR-21 and miR-183 can simultaneously target SOCS6 and modulate growth and invasion of hepatocellular carcinoma (HCC) cells[J].Eur Rev Med Pharmacol Sci,2015,19(17):3208–3217.

[11]Sun JJ,Chen GY,Xie ZT.MicroRNA-361–5p Inhibits Cancer Cell Growth by Targeting CXCR6 in Hepatocellular Carcinoma[J].Cell Physiol Biochem,2016,38(2):777–785.doi:10.1159/000443033.

[12]Wong CM,Wei L,Law CT,et al.Up-regulation of histone methyltransferase SETDB1 by multiple mechanisms in hepatocellular carcinoma promotes cancer metastasis[J].Hepatology,2016,63(2):474–487.doi:10.1002/hep.28304.

[13]Bagchi A,Mills AA.The quest for the lp36 tumor suppressor[J].Cancer Res,2008,68(8):2551–2556.doi:10.1158/0008–5472.CAN–07–2095.

[14]Hermeking H.The miR-34 family in cancer and apoptosis[J].CellDeath Digger,2010,17(2):193–199.doi:10.1038/cdd.2009.56.

[15]Li X,Zhang Y,Zhang Y,et al.Survival prediction of gastric cancer by a seven-microRNA signature[J].Gut,2010,59(5):579–585.doi:10.1136/gut.2008.175497.

[16]Tsujiura M,Ichikawa D,Komatsu S,et al.Circulating microRNAs in plasma of patients with gastric cancers[J].Br J Cancer,2010,102(7):1174–1179.doi:10.1038/sj.bjc.6605608.

[17]Huang Z,Huang D,Ni S,et al.Plasma microRNAs are promising novel biomarkers for early detection of colorectal cancer[J].Int J Cancer,2010,127(1):118–126.doi:10.1002/ijc.25007.

[18]He C,Dong X,Zhai B,et al.MiR-21 mediates sorafenib resistance of hepatocellular carcinoma cells by inhibiting autophagy via the PTEN/Akt pathway[J].Oncotarget,2015,6(30):28867–28881.doi:10.18632/oncotarget.4814.

[19]Wang WY,Zhang HF,Wang L,et al.miR-21 expression predicts prognosis in hepatocellular carcinoma[J].Clin Res Hepatol Gastroenterol,2014,38(6):715–719.doi:10.1016/j.clinre.2014.07.001.

[20]Zhu Q,Wang Z,Hu Y,et al.miR-21 promotes migration and invasion by the miR-21-PDCD4-AP-1 feedback loop in human hepatocellular carcinoma[J].Oncol Rep,2012,27(5):1660–1668.doi:10.3892/or.2012.1682.

[21]Wagenaar TR,Zabludoff S,Ahn SM,et al.Anti-miR-21 Suppresses Hepatocellular Carcinoma Growth via Broad Transcriptional Network Deregulation[J].Mol Cancer Res,2015,13(6):1009–1021.doi:10.1158/1541–7786.MCR–14–0703.

[22]Wan XW,Jiang M,Cao HF,et al.The alteration of PTEN tumor suppressor expression and its association with the histopathological features of human primary hepatocellular carcinoma[J].J Cancer Res Clin Oncol,2003,129(2):100–106.

[23]Rahman MA,Kyriazanos ID,Ono T,et al.Impact of PTEN expression on the outcome of hepatitis C virus-positive cirrhotic hepatocellular carcinoma patients:possible relationship with COX II and inducible nitric oxide synthasehe[J].Int J Cancer,2002,100(2):152–157.