孫永健 王 華 郭 森 黃登禹 張 博 榮志靖

（1 天津天獅學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，天津301700；2 天津市食品研究所有限公司，天津301609）

蛹蟲草[Cordyceps militaris（L.）Link]又名北冬蟲夏草，是蛹蟲草真菌寄生在鱗翅目昆蟲蛹上形成的子座與蛹的復(fù)合體，在我國(guó)主要分布于遼寧、內(nèi)蒙古、吉林等地[1～3]。蛹蟲草富含蟲草素、蟲草酸、蟲草多糖等多種生物活性成分，具有抗炎、抗腫瘤、抗衰老等功效，藥理作用廣泛，藥用價(jià)值較高[4～6]。目前，利用昆蟲蛹或幼蟲培育蛹蟲草的方法主要有兩種，一種是通過喂食、噴灑、或與蛹蟲草菌絲體共培養(yǎng)的自然感染法，該方法操作簡(jiǎn)便，但成功率低且耗時(shí)較長(zhǎng)；另外一種是通過注射、穿刺等方法，人為提高蛹蟲草菌感染蛹體效率的人工感染法，相較于自然感染法來說，人為干預(yù)可以較大地提高感染的成功率且在一定程度上縮短栽培時(shí)間，但由于蛹體或蟲體有開放性損傷，容易導(dǎo)致壞蛹率較高，僵化率較低[7～12]。研究采用高溫高壓的方法對(duì)柞蠶蛹[An?theraea pernyi Pupa]進(jìn)行了徹底滅菌，并利用其進(jìn)行蛹蟲草的培育，所獲得的產(chǎn)品，較傳統(tǒng)方法具有生長(zhǎng)速度快、產(chǎn)量高、品質(zhì)優(yōu)等特點(diǎn)。新方法的應(yīng)用，可以為蛹蟲草的人工培育開辟一條新途徑。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器新潔爾滅、升汞為北京華威銳科化工有限公司生產(chǎn)；蟲草素標(biāo)準(zhǔn)品為Sigma 公司生產(chǎn)；甲醇為色譜純，購自上海泰瑞爾化學(xué)有限公司；磷酸二氫鉀、硫酸鎂等化學(xué)試劑均為分析純，購自武漢易泰科技有限公司；新鮮滯育柞蠶蛹為市場(chǎng)采購，蛹蟲草菌種為天津市工業(yè)微生物研究所提供。

GZX-150BS 型光照培養(yǎng)箱、KYC-100B 型恒溫培養(yǎng)振蕩器，上海圣科儀器設(shè)備有限公司生產(chǎn)；MJ-78A 型高壓蒸汽滅菌鍋，上海巴玖實(shí)業(yè)有限公司生產(chǎn)；RZ-2D2G 型雙人桌面（水平）凈化工作臺(tái)，廣州瑞智凈化設(shè)備有限公司生產(chǎn)；Essentia LC-15C 型高效液相色譜儀，島津（中國(guó)）公司生產(chǎn)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 栽培種的培養(yǎng) 稱取300 g馬鈴薯，去皮切成小塊，加適量蒸餾水煮沸30 min，用四層紗布過濾取濾液。向?yàn)V液中加入1.5 g 硫酸鎂、3 g 磷酸二氫鉀、10 mg 維生素B1、20 g 葡萄糖，用蒸餾水定容至1000 mL。將液體培養(yǎng)基分裝于8 個(gè)200 mL 錐形瓶中，每瓶加入20 粒0.6 cm 的玻璃珠，于121℃下滅菌20 min。滅菌完畢的培養(yǎng)基放入培養(yǎng)室，于22℃下預(yù)培養(yǎng)3 d，確認(rèn)培養(yǎng)基沒有被雜菌污染，便可進(jìn)行栽培種的接種。

在超凈工作臺(tái)中，挑取黃豆粒大小的蛹蟲草菌原種，接種于液體培養(yǎng)基。將接種好的錐形瓶，放置于搖床上進(jìn)行避光振蕩培養(yǎng)，設(shè)定溫度為22℃，轉(zhuǎn)速為120 r/min，3 d 后選出菌液澄清、菌球長(zhǎng)勢(shì)一致的栽培種繼續(xù)培養(yǎng)，2 d后栽培種培養(yǎng)完成。

1.2.2 柞蠶蛹的預(yù)處理及接種方式的單因素試驗(yàn) 用流動(dòng)的水將柞蠶蛹清洗干凈，晾干表面的水，按表1的處理方式對(duì)柞蠶蛹進(jìn)行預(yù)處理，采用注射法將培養(yǎng)好的栽培種菌液接種于蛹體，接種量為0.2 mL，注射部位為由尾部向上數(shù)第二節(jié)腹環(huán)處。通過考察栽培種對(duì)蛹體的感染率、柞蠶蛹完全僵化所需天數(shù)、子實(shí)體的萌發(fā)率、復(fù)合體的平均干重，確定較優(yōu)的預(yù)處理方式。

利用高溫高壓方式對(duì)清洗好的柞蠶蛹進(jìn)行徹底滅菌，按表1的不同方式進(jìn)行接種，其中注射法與上述接種方法相同，浸泡法為將柞蠶蛹完全浸沒于栽培種菌液5 s；共培養(yǎng)法可免去接種的步驟，就是將柞蠶蛹預(yù)先置于液體培養(yǎng)基中，然后進(jìn)行栽培種的接種與培養(yǎng)，隨著菌種的生長(zhǎng)，菌絲體不斷侵入蛹體，當(dāng)栽培種培養(yǎng)完成后，接種也隨之完成。同樣考察上述幾個(gè)指標(biāo)，以確定較優(yōu)的接種方式。

表1 蛹蟲草菌感染柞蠶蛹的方法

1.2.3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 利用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)滅菌溫度、接種時(shí)的浸泡時(shí)間、液體培養(yǎng)基中柞蠶蛹浸提液的含量這3個(gè)因素進(jìn)行3水平的設(shè)計(jì)。L9（34）的9組正交試驗(yàn)中因素與水平的設(shè)計(jì)見表2。以復(fù)合體中蟲草素的含量為指標(biāo)，優(yōu)化培育方法。

表2 正交試驗(yàn)因素水平表

1.2.4 栽培管理 將接種好的柞蠶蛹置于培養(yǎng)瓶中，在恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，于17℃培養(yǎng)3～7 d，后進(jìn)入提溫增菌階段，將溫度調(diào)整為24℃，繼續(xù)培養(yǎng)，使蠶蛹完全僵化。然后將培養(yǎng)瓶轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)室，進(jìn)行晝夜溫差刺激培養(yǎng)，日間給予600 lx 的光照12 h，溫度設(shè)定為22℃，夜間避光12 h，溫度設(shè)定為16℃，空氣相對(duì)濕度保持在60%～70%，培養(yǎng)10 d 后原基開始形成。隨后進(jìn)入發(fā)草階段，晝夜給予600 lx的光照，溫度固定在22℃，為保證新鮮空氣的流通，將瓶口擰松，空氣相對(duì)濕度保持在80%～90%，以利于子實(shí)體的成長(zhǎng)。當(dāng)子實(shí)體尖端稍有膨大時(shí)，即可進(jìn)行采收。

圖1 蟲草素標(biāo)品的高效液相色譜圖

1.2.5 成品的采收與加工 將培養(yǎng)好的柞蠶蛹蟲草復(fù)合體從培養(yǎng)瓶中取出，放入烘箱于60℃干燥2 h，取出進(jìn)行整理，理順子實(shí)體后，于40℃繼續(xù)干燥4 h。烘干完成后，將柞蠶蛹蟲草復(fù)合體置于避光、陰涼、通風(fēng)處徹底風(fēng)干，避光保存。

1.2.6 蟲草素的提取 將柞蠶蛹蟲草復(fù)合體粉碎，過80 目篩，精確稱取2 g 樣品粉末，用50%的乙醇作為溶劑，以1∶50 的料液比，在80℃下，超聲波處理20 min（功率48 W），80℃水浴浸提10 min，重復(fù)4次，總計(jì)提取2 h。抽濾，收集濾液并以15%的甲醇定容至250 mL容量瓶。

1.2.7 蟲草素含量測(cè)定 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:精確稱取10 mg 蟲草素標(biāo)準(zhǔn)品（按實(shí)際含量折算），以15%的甲醇定容至25 mL 容量瓶，得到質(zhì)量濃度為0.4 mg/mL的蟲草素標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液[13～16]。利用儲(chǔ)備液分別配制質(zhì)量濃度為4 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL、40 μg/mL、60 μg/mL、100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，分別將其過0.22 μm 微孔濾膜后進(jìn)行高效液相色譜測(cè)定，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品出峰時(shí)間（圖1）確定蟲草素的保留時(shí)間為19.743 min，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，測(cè)得的峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖2），標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=34975x+46048（R2=0.9993）。

色譜條件:色譜柱為C18 柱，4.6 mm×250 mm，5 μm；流動(dòng)相為甲醇∶水=15∶85；流速，0.8 mL/min；柱溫，25℃；檢測(cè)波長(zhǎng)，260 nm；進(jìn)樣量，10 μL。

產(chǎn)品中蟲草素的測(cè)定:對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行5 次重復(fù)提取，分別在以上條件下進(jìn)行蟲草素含量測(cè)定，蟲草素含量=（提取液中蟲草素濃度×提取液總體積）/產(chǎn)品粉末質(zhì)量。

圖2 蟲草素標(biāo)準(zhǔn)曲線

2 結(jié)果與分析

2.1 柞蠶蛹的預(yù)處理對(duì)蛹蟲草培育的影響經(jīng)統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)（表3），在4 種預(yù)處理方法中，升汞（A2）的滅菌效果最佳，接種的100 個(gè)柞蠶蛹中，僅有1 個(gè)被雜菌感染，其余均僵化變硬，僵化率最高，達(dá)到了99%；不經(jīng)預(yù)處理（A4）的柞蠶蛹，出現(xiàn)壞蛹較多，僵化率最低，僅為86%；但從蛹體僵化所需的時(shí)間、子實(shí)體是否萌發(fā)、復(fù)合體生長(zhǎng)情況來看，利用高溫高壓（A1）進(jìn)行預(yù)處理的效果最佳，接種后，雖然僵化率略低于A2處理，但蛹體完全僵化所需時(shí)間最短，僅為6 d，僵化的所有柞蠶蛹均萌發(fā)產(chǎn)生子實(shí)體，發(fā)草率高達(dá)100%，并且子實(shí)體長(zhǎng)勢(shì)健壯、顏色金黃，蛹體呈棕色，沒有明顯的發(fā)黑現(xiàn)象（圖3），復(fù)合體平均干重在4種處理中最高，為3.54 g。

表3 滅菌、消毒方式對(duì)蛹蟲草培育的影響

圖3 4種不同預(yù)處理方法培育出的柞蠶蛹蟲草復(fù)合體

表4 接種方式對(duì)蛹蟲草培育的影響

圖4 利用3種不同方法進(jìn)行接種，培養(yǎng)6 d后菌絲體的生長(zhǎng)情況

由此可見，升汞滅菌法（A2）雖然可以起到較好的防止雜菌感染柞蠶蛹的效果，但由于重金屬汞對(duì)蛹體毒害較大及殘留難以清除干凈，子實(shí)體的萌發(fā)及生長(zhǎng)均受到較大影響，不如其他3種預(yù)處理方式；新潔爾滅消毒法（A3）雖然在一定程度上可以防止雜菌的感染，但同樣會(huì)對(duì)子實(shí)體的萌發(fā)產(chǎn)生影響；而對(duì)不經(jīng)消毒、滅菌處理（A3）的柞蠶蛹接種后，開放性創(chuàng)口形成，蛹體較易被雜菌感染，引起了壞血蛹的出現(xiàn)，因此確定高溫高壓滅菌法為較優(yōu)的預(yù)處理方式。

2.2 接種方式對(duì)蛹蟲草培育的影響經(jīng)統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)（表4），浸泡法（B1）、共培養(yǎng)法（B2），可以較好的避免因注射等復(fù)雜操作對(duì)蛹體造成的雜菌感染，所接種的柞蠶蛹均僵化變硬，僵化率達(dá)100%；采用共培養(yǎng)法（B2）進(jìn)行接種時(shí)，柞蠶蛹在蛹蟲草菌栽培種的培養(yǎng)過程中就與其接觸，栽培種在擴(kuò)大生長(zhǎng)時(shí)就不斷地侵入蛹體，因此蛹體完全僵化時(shí)間明顯短于其它2 種接種方式，僅為3 d，但由于菌絲體在蛹體中生長(zhǎng)時(shí)間過長(zhǎng)，菌齡老化（圖4）等原因的影響，子實(shí)體萌發(fā)效果最差，發(fā)草率僅為89%；浸泡法（B1）不但操作簡(jiǎn)便，不易引起雜菌感染，而且對(duì)子實(shí)體的萌發(fā)、生長(zhǎng)無不利影響，因此確定為較優(yōu)的接種方式。

2.3 培育方法的優(yōu)化以復(fù)合體中蟲草素的含量（圖5）為指標(biāo)，對(duì)利用無菌柞蠶蛹培育蛹蟲草的相關(guān)參數(shù)進(jìn)行正交試驗(yàn)優(yōu)化。結(jié)果表明（表5），在該方法中，影響柞蠶蛹蟲草復(fù)合體中蟲草素含量的主次因素，排序?yàn)闇缇鷾囟龋窘嵋汉浚窘輹r(shí)間。考察這幾個(gè)因素在3 個(gè)水平上的變化，確定較優(yōu)方案為A2C2B1，即在栽培種的液體培養(yǎng)基中，按50%的比例添加柞蠶蛹浸提液，在115℃的溫度下對(duì)柞蠶蛹進(jìn)行高溫高壓滅菌，以將蛹體浸泡于栽培用菌液中10 s的方式來接種。

表5 正交試驗(yàn)直觀分析表

圖5 柞蠶蛹蟲草復(fù)合體中蟲草素的高效液相色譜圖

在對(duì)正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析時(shí)，選取空列D作為誤差項(xiàng)，在α=0.05的條件下進(jìn)行F檢驗(yàn)，方差分析結(jié)果表明（表6），滅菌溫度和浸提液含量對(duì)柞蠶蛹蟲草復(fù)合體中蟲草素的含量具有顯著性影響，他們的改變?cè)谝欢ǔ潭壬峡梢杂绊懹枷x草的品質(zhì)?？梢?，滅菌溫度為115℃時(shí)，既可以起到較好的滅菌效果，又不會(huì)因?yàn)闇囟冗^高導(dǎo)致蛹體中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)被過多破壞，而影響蛹蟲草的生長(zhǎng)；同時(shí)，以50%的比例向栽培種培養(yǎng)基中添加柞蠶蛹浸提液，可以起到使蛹蟲草菌適應(yīng)柞蠶蛹營(yíng)養(yǎng)成分的過度作用，為蛹蟲草菌侵入蛹體后的快速、穩(wěn)定生長(zhǎng)發(fā)揮促進(jìn)作用。

表6 正交試驗(yàn)方差分析表

3 小 結(jié)

利用無菌柞蠶蛹進(jìn)行蛹蟲草的培育，必然會(huì)減輕甚至完全消除雜菌的影響，增強(qiáng)蛹蟲草菌對(duì)柞蠶蛹的感染能力。結(jié)合操作簡(jiǎn)便的浸泡法進(jìn)行接種，盡量簡(jiǎn)化中間步驟，可有效避免壞蛹的出現(xiàn)，使柞蠶蛹的僵化率達(dá)到100%。當(dāng)以高溫高壓法作為滅菌方式時(shí)，在殺滅雜菌的同時(shí)，柞蠶蛹也被殺死，其機(jī)體當(dāng)中能夠抵抗外來菌群侵染的免疫力也隨之消失，這可能就是利用該方法進(jìn)行蛹蟲草培育時(shí)，蛹體完全僵化所需時(shí)間大大縮短的原因。同時(shí)，由于高溫的作用，可能會(huì)使柞蠶蛹中富含的蛋白質(zhì)降解為蛹蟲草菌更易于利用的氨基酸，從而使子實(shí)體的萌發(fā)率可提高至100%且長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)健。研究確定的較優(yōu)方法，既縮短了蛹蟲草的培育周期，又提高了產(chǎn)品的品質(zhì)，可為蛹蟲草工業(yè)化快速生產(chǎn)，提供一種新的技術(shù)支持。