高效液相色譜法測(cè)定葉酸片中葉酸含量

中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院（510080）黃潔文 雷會(huì)雯

葉酸功能主治貧血，療效較好[1]。葉酸片中的葉酸含量，決定藥物治療效果[2]。有研究表明，采用高效液相色譜法，可有效測(cè)定葉酸片中的葉酸含量，效果好，準(zhǔn)確度高[3]。本文采用甲醇-水-冰醋酸系統(tǒng)作為流動(dòng)相，通過試驗(yàn)的方法，在利用高效液相色譜法的基礎(chǔ)上，對(duì)葉酸片中的葉酸含量進(jìn)行了分析，試驗(yàn)報(bào)告如下。

1 測(cè)定儀器與試劑

1.1 測(cè)定儀器 測(cè)定采用高效液相色譜儀作為主要儀器。另外配合以下儀器完成試驗(yàn)：①UV檢測(cè)器。②超聲波清洗器。③電子天平。④蒸餾器。

1.2 測(cè)定試劑 測(cè)定包括如下試劑：①葉酸片。②葉酸對(duì)照品。③甲醇。④氨水。⑤冰乙酸。

2 測(cè)定方法與結(jié)果

2.1 測(cè)定準(zhǔn)備

2.1.1 溶液的配制 共配制兩種溶液，一種為供試品溶液，即葉酸片溶液，另一種為對(duì)照品溶液，即由所準(zhǔn)備的葉酸對(duì)照品配制的溶液。供試品溶液配制：①取葉酸片，共30片。②稱量，并研磨。③取研磨后的供試品2.5mg置于容量瓶中。④加入氨水（0.5%/15ml）。⑤超聲15min。⑥稀釋，搖勻并過濾。⑦過濾直至達(dá)到溶液要求標(biāo)準(zhǔn)。對(duì)照品溶液配制：①取葉酸對(duì)照品25.1mg置于容量瓶中。②采用氨水（5%）溶解。③稀釋，搖勻并過濾。④過濾直至達(dá)到溶液要求標(biāo)準(zhǔn)。

2.1.2 色譜條件 流動(dòng)相：甲醇-水-冰乙酸。色譜柱：Diamonsil C18柱。柱溫：室內(nèi)溫度。流速：1.0ml/min。進(jìn)樣量：20μl。

2.2 測(cè)定方法 以試驗(yàn)為主要測(cè)定方法，高效液相色譜法為主要測(cè)定依據(jù)，展開試驗(yàn)，具體測(cè)定葉酸含量。包括色譜行為與系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)、線性關(guān)系試驗(yàn)、精密度試驗(yàn)、重復(fù)性試驗(yàn)、穩(wěn)定性試驗(yàn)、回收率試驗(yàn)與樣品含量測(cè)定試驗(yàn)。色譜行為與系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)方法：①室內(nèi)試驗(yàn)。②流速：1.0ml/min。進(jìn)樣量：20μl。③記錄色譜圖。線性關(guān)系試驗(yàn)方法：①取葉酸對(duì)照品溶液0.5ml～4.5ml，（每次增加量為1ml）。②將所取對(duì)照品溶液置于容量瓶中。③以水稀釋，并搖勻。④進(jìn)樣量：20μl。⑤觀察峰面積。⑥做線性回歸。精密度試驗(yàn)方法：①取葉酸對(duì)照品溶液0.5ml～4.5ml，（每次增加量為1ml）。②重復(fù)進(jìn)樣。③進(jìn)樣量：20μl。④觀察峰面積。重復(fù)性試驗(yàn)方法：①取葉酸樣品。②以2:2為標(biāo)準(zhǔn)，制備溶液。③進(jìn)樣量：20μl。④觀察峰面積。穩(wěn)定性試驗(yàn)方法：①以溶液放置時(shí)間為變量，測(cè)定溶液的穩(wěn)定性。②取葉酸樣品溶液。③控制室溫平衡。④放置0h、1h、4h、6h、8h、24h。⑤進(jìn)樣量：20μl。⑤觀察峰面積?；厥章试囼?yàn)方法：①取葉酸樣品。②將樣品分為9份。③以2:2為標(biāo)準(zhǔn)，制備溶液。④進(jìn)樣量：20μl。⑤觀察峰面積。⑥計(jì)算回收率。葉酸含量測(cè)定試驗(yàn)方法：①取葉酸樣品30片。②研磨。③以2:2為標(biāo)準(zhǔn)，制備溶液。④進(jìn)樣量：20μl。⑤觀察色譜圖。⑥取葉酸對(duì)照品，重復(fù)上述試驗(yàn)步驟。⑦觀察峰面積。

2.3 測(cè)定結(jié)果 ①色譜行為與系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果 葉酸保留時(shí)間10min，與相鄰峰分離度在1.5以上，拖尾因子1.03。②線性關(guān)系試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果 葉酸在20.8～180.72μg/ml范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。③精密度試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果 RSD=0.43%，測(cè)定結(jié)果表明測(cè)定儀器具有較好的精密度。④重復(fù)性試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果 RSD=1.7%，測(cè)定結(jié)果表明重復(fù)性較好。⑤穩(wěn)定性試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果 RSD=0.59%，測(cè)定結(jié)果表明溶液穩(wěn)定性較好。⑥回收率實(shí)驗(yàn)測(cè)定結(jié)果 RSD=1.5%，測(cè)定結(jié)果表明測(cè)定準(zhǔn)確度較高。⑦葉酸含量試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果 葉酸片標(biāo)示百分含量為100.5%。

3 結(jié)論

采用高效液相色譜法，測(cè)定葉酸片的葉酸含量，需同時(shí)制備葉酸樣品與對(duì)照品兩種溶液，針對(duì)兩種溶液同時(shí)展開試驗(yàn)，結(jié)果準(zhǔn)確度更高[4]。試驗(yàn)過程中，控制色譜條件中的進(jìn)樣量較重要，另外，在某些試驗(yàn)中，需控制好室內(nèi)溫度，避免增加變量，影響測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確度[5]。本文研究發(fā)現(xiàn)，根據(jù)試驗(yàn)條件的不同，葉酸的穩(wěn)定性也呈現(xiàn)出了差異：①稀堿條件：葉酸穩(wěn)定性強(qiáng)，易溶。②水溶液條件下：葉酸穩(wěn)定性差。

綜上所述，高效液相色譜法測(cè)定葉酸片中葉酸含量可靠性強(qiáng)、準(zhǔn)確度高，可將其用于葉酸片葉酸含量的測(cè)定中，提高測(cè)量結(jié)果準(zhǔn)確度，可以以此作為葉酸片葉酸含量的檢測(cè)方法，評(píng)價(jià)葉酸片臨床應(yīng)用效果，進(jìn)一步提高我國藥物研制領(lǐng)域發(fā)展水平，并為貧血等的治療，提供質(zhì)量更高的藥物作為依靠。