云芝多糖含量測定及其體外抗氧化活性比較

柴新義 陸媛媛 于士軍

（滁州學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，安徽滁州239000）

云芝（Coriolus versicolor）對提高人體的免疫能力具有很大的功效，能夠有效的調(diào)節(jié)內(nèi)分泌，對腫脹、呼吸、肝臟等器官能進行有效的調(diào)節(jié)和保護[2]。研究發(fā)現(xiàn)云芝多糖含量較高，且具有非常重要的生理學(xué)作用。因此，對云芝多糖的研究備受關(guān)注[3，4]。

目前，對云芝多糖的提取工藝研究較多[5-8]，而對野生和人工栽培云芝多糖的含量及其抗氧化活性進行分析比較的較少，為了解野生和人工栽培云芝的多糖含量及其抗氧化活性的差異，筆者采用熱水浸提法提取云芝多糖，以云芝多糖對超氧陰離子自由基（02-·）和羥自由基（·OH）的清除率為衡量指標，比較了野生和人工栽培云芝在抗氧化活性方面的差異?，F(xiàn)將試驗結(jié)果總結(jié)如下。

1 材料與方法

1.1 供試材料①云芝子實體：野生云芝子實體采集自安徽瑯琊山自然保護區(qū)；人工栽培云芝購買自吉林樺甸。②主要試劑：Tris-HCl、NaOH、95%乙醇、無水乙醇、氯仿、乙醚、苯酚、硫酸亞鐵、濃硫酸、正丁醇、乙二胺四乙酸、鄰苯三酚、鋁片、HCL、水楊酸、H2O2、三氯乙酸、葡萄糖、NaHCO3。③主要儀器設(shè)備：分光光度計、恒溫水浴鍋、電子天平、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器、電熱鼓風(fēng)干燥箱、離心機、粉碎機、自動雙重純水蒸餾器、冷凍柜、冷凍離心機、真空冷凍干燥機、移液器等。

1.2 試驗方法

1.2.1 野生和人工栽培云芝多糖含量的測定

1.2.1.1 云芝多糖的提取 精確稱取野生和人工栽培云芝粉末10 g，以1∶25的料液比把野生和人工栽培云芝粉末分別溶于0.5 mol/L的NaOH溶液中。然后，在沸水水浴中提取1 h，反復(fù)三次。將這3次的提取液進行合并，并放在恒溫水浴鍋（80℃）里進行濃縮2 h。然后，向濃縮液中緩慢地加入硫酸，測定pH7.0。然后，將提取液裝入透析袋中透析24 h，再加入三氯乙酸，搖勻，4℃冰箱沉淀。第2天進行離心，取上清液，將上清液再進行透析濃縮，然后往濃縮液中加入3倍體積的95%乙醇，4℃冰箱進行醇沉。第2天用無水乙醇和乙醚進行離心洗滌。離心管的管口用濾紙緊緊包住，用橡皮筋將其扎緊，再用針或者是筆尖在慮紙上扎上小洞，真空干燥，制得云芝多糖，備用。

1.2.1.2 葡萄糖標準曲線的制備 準確稱取葡萄糖20 mg于500 mL容量瓶中，加水至刻度，分別吸取0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 mL及1.8 mL，各以蒸餾水補至2.0 mL，然后加入5%苯酚1.0 mL，濃硫酸5.0 mL，搖勻，確保反應(yīng)完全。沸水浴反應(yīng)10 min，冷卻至室溫，于490 nm處測定其吸光度值。以2.0 mL蒸餾水按同樣顯色操作為空白，以葡萄糖質(zhì)量濃度X為橫坐標，吸光度Y為縱坐標繪制標準曲線，得回歸方程為y=1.6336x+0.0213（R2=0.99884）。

1.2.1.3 云芝多糖含量的測定 取三個燒杯，分別標號A、B、C，準確稱取野生云芝粉末4 g分別放入燒杯中。另取三個燒杯，分別標號a、b、c，精確稱取人工栽培云芝粉末4 g分別放入燒杯中，在六個燒杯中分別加入200 mL的蒸餾水，置于100℃水浴中3 h，不停攪拌，以使云芝粉末浸提充分、完全。離心之后得到濾渣，將濾渣用此方法反復(fù)浸提3次，直至所提取得到的液體都接近為無色時表示已經(jīng)提取完全。然后，合并提取濾液，并分別定容200 mL。取適量上述提取液放入干凈的試管中，用蒸餾水稀釋至2.0 mL，但是要確定稀釋后得到的溶液測得的吸光度需要在之前算的葡萄糖標準曲線范圍以內(nèi)。加入5%的苯酚溶液1 mL，搖勻，使其充分反應(yīng)，隨后加入5.0 mL濃硫酸，搖勻，確保反應(yīng)完全。沸水浴反應(yīng)10 min，冷卻至室溫，于490 nm處測定其吸光度值，根據(jù)葡萄糖標準曲線計算云芝多糖的含量。

1.2.2 云芝多糖抗氧化活性的測定

1.2.2.1 超氧陰離子自由基（O2-·）清除率的測定首先，用50 mmol/L、pH 8.0的Tris-HCl緩沖液將提取的野生和人工栽培的云芝多糖配制成1 mg/mL的多糖溶液。然后，分別稀釋成0.1 mmol/L、0.08 mmol/L、0.06 mmol/L、0.04 mmol/L、0.02 mmol/L等幾個不同濃度的多糖溶液。取上述6種不同濃度的多糖溶液1.5 mL置于干凈的試管中，依次分別緩慢加入0.5 mL NBT，搖勻，置于25℃水浴中10 min。在560 nm處，測其吸光值。用緩沖液作為空白對照組。野生和人工栽培云芝多糖對超氧陰離子自由基（O2-·）的清除率公式如下：

E（O2-·）=（1-Al/A0）×100%

式中：E（02-·）—云芝多糖對02-·的清除率（%）

A1—某質(zhì)量濃度多糖的吸光值

A0—空白吸光值

1.2.2.2 羥自由基（·OH）清除率的測定 首先，分別配制5 mg/mL野生和人工栽培云芝的多糖溶液。然后，分別稀釋成1 mmol/L、2 mmol/L、3 mmol/L和4 mmol/L不同濃度梯度的多糖稀釋液。參照朱曉宦等[9]的測定方法：在試管中依次加入6 mmol/L FeSO4溶液2 mL、不同濃度多糖溶液2 mL，6 mmol/L H2O2溶液2 mL，搖勻，靜置10 min，再加入6 mmol/L水楊酸溶液2 mL，搖勻，靜置30 min后于510 nm處測得不同云芝多糖濃度下的光密度Ai；用雙蒸水代替水楊酸時測得某濃度云芝多糖的本底光密度Aj；用雙蒸水代替抗氧化劑時測得空白對照光密度A0。清除率按下式計算：

清除率E（·OH）=[1-（Ai-Aj）/Ao]×100%

1.2.3 數(shù)據(jù)處理 運用SPSS16.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進行方差分析，檢驗不同處理間的差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 云芝多糖含量的測定與分析測定結(jié)果，人工栽培的云芝多糖含量（[6.3±0.23）%]要高于野生云芝多糖的含量（[5.1±0.12）%]。通過比較統(tǒng)計分析，兩者多糖含量存在極顯著差異（P＜0.01），這可能與野生云芝和人工栽培云芝子實體在其營養(yǎng)來源、溫度、濕度、光照等方面存在不同有關(guān)，這些外界因素的差異可能使得不同物質(zhì)成分在云芝子實體中積累的量存在明顯差別。

2.2 兩種云芝多糖抗氧化活性的測定結(jié)果比較

2.2.1 超氧陰離子自由基（O2-·）清除率的測定 在多糖分子的結(jié)構(gòu)上都具有半縮醛羥基，這些半縮醛羥基具有還原性，當(dāng)它接觸到O2-·之后，它就會發(fā)生氧化還原反應(yīng)[10]。野生和人工栽培云芝多糖對O-·2的清除率見圖1。由圖1可知，隨著多糖質(zhì)量濃度的增加，野生云芝和人工栽培云芝多糖對超氧陰離子自由基的清除率均表現(xiàn)出上升的趨勢，在同一多糖質(zhì)量濃度下，野生云芝多糖對超氧陰離子自由基的清除率均要高于人工栽培云芝多糖對超氧陰離子自由基的清除率，且兩者之間存在顯著差異（P＜0.05）。

圖1 云芝多糖清除超氧陰離子自由基（O2-·）活性

2.2.2 羥自由基（·OH）清除率 羥自由基（·OH）很容易跟水楊酸進行反應(yīng)，生成一些有色的物質(zhì)，如果在這個反應(yīng)的過程中加入一些具有很強清除作用的物質(zhì)，這些物質(zhì)就會與水楊酸發(fā)生一些競爭，取代水楊酸和羥自由基（·OH）發(fā)生反應(yīng)，也就減少了這個過程中有色物質(zhì)的生成。因此，通過測定吸光值便可檢測一種物質(zhì)對羥自由基（·OH）清除能力的強弱[11]。野生和人工栽培云芝多糖對羥自由基的清除率結(jié)果見圖2。由圖2可知，多糖質(zhì)量濃度在1～5 mg/mL范圍內(nèi)，兩種云芝多糖對羥自由基（·OH）的清除率均表現(xiàn)出隨著多糖質(zhì)量濃度的增加而增大。在同一多糖質(zhì)量濃度下，野生云芝多糖對羥自由基（·OH）的清除率均要高于人工栽培云芝多糖對羥自由基（·OH）的清除率，且兩者之間存在顯著差異（P＜0.05）。這與以往（孫小文）研究結(jié)果較為一致[11]。

圖2 云芝多糖清除羥自由基（·OH）活性

3 小 結(jié)

試驗以野生云芝和人工栽培云芝子實體為原料，進行了多糖含量及其體外抗氧化活性的測定。選用了操作簡單，易提取的熱水浸提法對云芝多糖進行了提取，采用苯酚-硫酸法對云芝多糖含量進行了測定，以云芝多糖對超氧陰離子自由基（02-·）和羥自由基（·OH）清除率為測定指標，比較野生和人工栽培云芝在抗氧化活性方面的差異。結(jié)果表明：試驗所測定人工栽培云芝的多糖含量高于野生云芝的多糖含量，野生云芝多糖對超氧陰離子自由基（02-·）和羥自由基（·OH）的清除能力均要高于人工栽培云芝的清除能力。