劉佳/遼寧省大連市畜牧總站

ELISpot檢測(cè)技術(shù)操作要求及質(zhì)量控制

劉佳/遼寧省大連市畜牧總站

酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)檢測(cè)技術(shù)( enzyme-link immunospot assay，ELISpot) 是近年來發(fā)展起來的檢測(cè)細(xì)胞因子免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)，是在酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)(ELISA)基礎(chǔ)上與細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)充分結(jié)合而建立起來的一種可以在體外檢測(cè)單細(xì)胞水平培養(yǎng)的特異性抗體分泌細(xì)胞的新型檢測(cè)技術(shù)，此技術(shù)可以快捷、簡(jiǎn)便的對(duì)細(xì)胞因子分泌量進(jìn)行定量，目前已經(jīng)成為國(guó)際公認(rèn)的抗原特異性T細(xì)胞免疫學(xué)研究的主流技術(shù)。由此可以預(yù)見，該檢測(cè)方法在動(dòng)物免疫研究領(lǐng)域?qū)?huì)得到廣泛應(yīng)用，發(fā)揮其重要作用。但是，此項(xiàng)技術(shù)尚未形成標(biāo)準(zhǔn)化，對(duì)細(xì)胞含量、細(xì)胞濃度、孵育、顯色時(shí)間等優(yōu)化條件還沒有形成完整體系。因此，在檢測(cè)工作實(shí)踐中，總結(jié)實(shí)驗(yàn)操作步驟注意事項(xiàng)，提高檢測(cè)水平，對(duì)提高ELISpot技術(shù)檢測(cè)的準(zhǔn)確性以及對(duì)各個(gè)因素進(jìn)行優(yōu)化，建立穩(wěn)定的檢測(cè)體系具有重要意義。

一、細(xì)胞質(zhì)量控制

1.采血。選取45～50日齡，沒有疫苗接種經(jīng)歷的仔豬，從前腔靜脈采集外周靜脈血，保證無菌操作，抗凝劑抗凝。采血后輕搖，使血液與抗凝劑充分混勻，避免出現(xiàn)血凝塊，影響分離效果。震蕩過于劇烈或保存不當(dāng)，會(huì)出現(xiàn)溶血現(xiàn)象。

2.淋巴細(xì)胞分離。6 h內(nèi)進(jìn)行外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)的分離，時(shí)間過長(zhǎng)會(huì)影響活細(xì)胞數(shù)，淋巴細(xì)胞的活細(xì)胞比例直接影響酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)的形成。將稀釋好的細(xì)胞懸液沿管壁緩慢加至淋巴細(xì)胞分離液液面上，2 000轉(zhuǎn)/分鐘離心10 min，轉(zhuǎn)速不宜過高，否則會(huì)使細(xì)胞壁破裂。離心后，離心管中由上至下細(xì)胞分為四層，即血漿或者組織勻漿液層、環(huán)狀乳白色淋巴細(xì)胞富集層、透明分離液層、紅細(xì)胞層。吸出中間環(huán)狀乳白色PBMC富集層，吸取方法可以將組織勻漿層用吸管去掉，將乳白色淋巴細(xì)胞吸出，也可以直接將吸管插入淋巴細(xì)胞富集層吸出。吸液要慢、穩(wěn)，避免吸出紅細(xì)胞。洗滌后，如果有紅細(xì)胞存在，可以使用紅細(xì)胞裂解液，將紅細(xì)胞去除。

3.計(jì)數(shù)。用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，注意加細(xì)胞懸液時(shí)要干凈利落，加量適中，過多容易使蓋玻片漂移或淹過蓋玻片，過少容易出現(xiàn)氣泡。細(xì)胞懸液混合不均勻直接影響計(jì)數(shù)的準(zhǔn)確性。鏡下計(jì)數(shù)時(shí)，若方格中細(xì)胞分布明顯不均，需重新將細(xì)胞懸液進(jìn)行混合，再進(jìn)行計(jì)數(shù)。

4.細(xì)胞凍存與復(fù)蘇。

細(xì)胞凍存：可以選擇對(duì)細(xì)胞無毒性、溶解度大、容易穿透的保護(hù)劑，比如二甲亞砜、甘油等。若不添加保護(hù)劑直接凍存，會(huì)導(dǎo)致胞內(nèi)和外環(huán)境中的水形成冰晶，細(xì)胞內(nèi)發(fā)生機(jī)械損傷引起細(xì)胞死亡。降溫的順序應(yīng)從室溫→4℃（20 min〕→冰箱冷凍室（30 min）→低溫冰箱（-30℃/1 h）→氣態(tài)氮（30 min）→液氮，使用液氮時(shí)避免低溫凍傷。

細(xì)胞復(fù)蘇：取細(xì)胞時(shí)要戴防低溫手套、護(hù)目鏡，取出細(xì)胞將其放入37℃水浴快速搖晃，使細(xì)胞完全復(fù)蘇，此步驟動(dòng)作要迅速，使細(xì)胞避免經(jīng)過容易受損的0℃，復(fù)蘇后要對(duì)細(xì)胞重新進(jìn)行計(jì)數(shù)，活細(xì)胞數(shù)過低會(huì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果造成影響。

二、刺激物質(zhì)量控制

1.特異性刺激物。特異性刺激物通常包括病毒、疫苗毒、T細(xì)胞表位多肽等，可以根據(jù)檢測(cè)目的不同來選擇。在提取疫苗毒可通過反復(fù)凍融、超聲波、加化學(xué)物質(zhì)等方法來提取。

2.非特異性刺激物。ELISpot檢測(cè)中最常用的是將植物血球血凝素（PHA）或有絲分裂原ConA作為非特異性刺激物，刺激物濃度的選擇尤為重要，濃度過高時(shí)，斑點(diǎn)連片不清晰，背景顏色略深；濃度過低時(shí)，斑點(diǎn)數(shù)量較少，均達(dá)不到對(duì)照的效果。通常情況下，PHA的斑點(diǎn)數(shù)100左右為佳。

三、操作質(zhì)量控制

1.加樣。使用移液器時(shí)，保證垂直、懸空加樣，速度要慢，避免液體濺出，排液時(shí)速度要快，注意管壁不要?dú)埩粢后w或者由于排液過慢導(dǎo)致回吸而產(chǎn)生氣泡，使用排槍時(shí)，注意液面要齊。加液時(shí)不能用力觸碰板低，操作不當(dāng)會(huì)損壞PVDF膜，影響結(jié)果判定。

2.孵育。CO2的濃度、濕度、抗體濃度、作用時(shí)間都會(huì)造成背景和敏感性差異。ELISpot檢查技術(shù)常用的孵育溫度是 37℃，溫度不宜過高，孵育過程中，反應(yīng)溫度要均勻，使所有的反應(yīng)樣品盡可能達(dá)到平衡，不要將反應(yīng)板疊加放到CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，受熱不均會(huì)導(dǎo)致部分細(xì)胞無法得到充分刺激。由于孵育時(shí)間較長(zhǎng)，為避免液體蒸發(fā)，反應(yīng)板放入培養(yǎng)箱之前應(yīng)貼上封板膜或蓋好蓋子，也可放入濕盒，培養(yǎng)期間定期觀察CO2濃度情況。

3.試劑。試劑現(xiàn)用現(xiàn)配，分裝成管，反復(fù)凍融會(huì)造成試劑（抗體或重組細(xì)胞因子）失活，因此，配好的試劑盡量在保質(zhì)期內(nèi)使用。試劑的用量要不斷的優(yōu)化，要與細(xì)胞的數(shù)量成相應(yīng)的比例，檢測(cè)不同的細(xì)胞因子應(yīng)加入合適的細(xì)胞量，因?yàn)镃K分泌細(xì)胞分泌不同細(xì)胞因子的量是不同的，如果細(xì)胞濃度過大，大量分泌的細(xì)胞因子將融合形成斑點(diǎn)，從而造成技術(shù)誤差。

4.顯色。對(duì)顯色反應(yīng)溫度和時(shí)間的把控，是試驗(yàn)數(shù)據(jù)有效、精準(zhǔn)的必要條件，顯色時(shí)間過長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致背景加深，過短會(huì)使顯色不完全。讀板時(shí)，PDFV膜在濕潤(rùn)的情況下儀器無法讀取斑點(diǎn)數(shù)，所以在底物洗去后應(yīng)將板倒置自然控干，避免液體回流到板底。特異性斑點(diǎn)呈邊緣模糊，有暈，形狀圓而規(guī)則。

四、結(jié)語

總之，隨著ELISpot技術(shù)的不斷發(fā)展，此技術(shù)在動(dòng)物疫病診斷的領(lǐng)域也將更加廣泛深入，近幾年利用ELISpot技術(shù)對(duì)豬藍(lán)耳病、口蹄疫的研究層出不窮，ELISpot技術(shù)即將成為基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)室及獸醫(yī)診斷實(shí)驗(yàn)室的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)。試劑質(zhì)量、細(xì)胞質(zhì)量、人員操作、主觀判定等都是影響此項(xiàng)檢測(cè)技術(shù)結(jié)果準(zhǔn)確與否的主要因素。正確的實(shí)驗(yàn)方法和操作細(xì)節(jié)對(duì)ELISpot在獸醫(yī)領(lǐng)域的研究和診斷意義重大。

（略）