肖慎華 張國敏

摘要：胚胎體外發(fā)育能力的評估在人類輔助生殖技術(shù)中起關(guān)鍵作用。多胎妊娠帶來的圍產(chǎn)期死亡和醫(yī)療負(fù)擔(dān)日益凸顯。因此，如何獲得高發(fā)育潛能的胚胎以減少多胎率和提高臨床妊娠率是目前輔助生殖技術(shù)研究的重點(diǎn)。代謝組學(xué)作為一種非侵入性檢測方法，主要通過對卵泡液或胚胎的培養(yǎng)液進(jìn)行檢測分析，能客觀地評價(jià)胚胎質(zhì)量和預(yù)測胚胎的發(fā)育潛能。因此，通過代謝組學(xué)判斷和選擇具有良好發(fā)育潛能的胚胎，對孕育健康后代和減少經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)具有重要意義。本文首先對代謝組學(xué)的概況及研究方法進(jìn)行了簡單介紹，然后對代謝組學(xué)在生殖領(lǐng)域的最新應(yīng)用進(jìn)行了綜述。

關(guān)鍵詞：代謝組學(xué)；胚胎體外發(fā)育；卵泡液；胚胎培養(yǎng)液

中圖分類號： S857.2文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）12-0042-03

收稿日期：2016-08-16

基金項(xiàng)目：第58批博士后科學(xué)基金（編號：80252115）。

作者簡介：肖慎華（1963—），男，江蘇徐州人，碩士，研究方向?yàn)檠蛏a(chǎn)學(xué)。

通信作者：張國敏，博士，主要從事羊生產(chǎn)學(xué)與動物胚胎生物學(xué)研究。E-mail：zhangguomin@njau.edu.cn。

隨著輔助生殖技術(shù)的廣泛應(yīng)用，如何選擇高質(zhì)量胚胎進(jìn)行移植已成為研究者面臨的主要問題。目前，移植胚胎的發(fā)育潛能評估主要是依據(jù)胚胎的形態(tài)學(xué)評分。但這種方法重復(fù)性低、不能準(zhǔn)確反映胚胎的質(zhì)量，并且可能在無異常表現(xiàn)的胚胎中存在遺傳缺陷[1]。因此，尋找一種新的評價(jià)配子和胚胎發(fā)育潛能的方法迫在眉睫。近年的研究表明，利用代謝組學(xué)的方法，通過測定卵泡液或胚胎培養(yǎng)液中代謝物質(zhì)的變化，探索這種變化與卵母細(xì)胞或胚胎質(zhì)量及其發(fā)育潛能的關(guān)系，以此來評價(jià)配子和胚胎的質(zhì)量，能達(dá)到提高妊娠率并降低多胎妊娠風(fēng)險(xiǎn)的目的[2]。由于卵泡液和培養(yǎng)液是卵母細(xì)胞和胚胎發(fā)育與成熟的重要微環(huán)境，代謝產(chǎn)物的變化可以直接反映卵母細(xì)胞和胚胎對基因、營養(yǎng)物質(zhì)和環(huán)境等所產(chǎn)生的生理變化[3- 4]，因此，卵泡液和胚胎培養(yǎng)基的代謝成分就成為人們對胚胎活力評價(jià)的潛在指標(biāo)。

1代謝組學(xué)概述

代謝組學(xué)（metabonomics）是繼基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)之后新發(fā)展起來的一門學(xué)科，主要對細(xì)胞、組織或器官中所有低相對分子質(zhì)量代謝產(chǎn)物進(jìn)行定性和定量分析，從而判斷或預(yù)測細(xì)胞、組織或器官的健康狀態(tài)[5-6]。代謝組學(xué)是以組群指標(biāo)分析為基礎(chǔ)、以高通量檢測和數(shù)據(jù)處理為手段，以信息建模與系統(tǒng)整合為目標(biāo)的系統(tǒng)生物學(xué)的一個(gè)分支。在特定的環(huán)境中，經(jīng)基因組表達(dá)和新陳代謝產(chǎn)生的中間物和終產(chǎn)物，是代謝組學(xué)研究的重點(diǎn)，物質(zhì)的變化能反映生物體系受外部刺激所做出的應(yīng)答。

與基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)以及其他組學(xué)相比，代謝組學(xué)具有很大的優(yōu)勢：（1）代謝物的種類較少，遠(yuǎn)少于基因組和蛋白組所檢測到的數(shù)目；（2）基因和蛋白質(zhì)的微小變化會在代謝產(chǎn)物上得到放大，從而更易檢測；（3）無需建立全基因測序以及大量表達(dá)序列標(biāo)簽數(shù)據(jù)庫；（4）目前對大多數(shù)小分子內(nèi)源性代謝物的作用及其所在代謝途徑及相關(guān)代謝通路的認(rèn)識更加全面[7]?；谝陨蟽?yōu)點(diǎn)，代謝組學(xué)已成為所有組學(xué)研究中的熱點(diǎn)之一，有很大的發(fā)展和應(yīng)用前景。

2代謝組學(xué)的分析技術(shù)

利用代謝組學(xué)分析數(shù)據(jù)的過程一般分為：代謝組數(shù)據(jù)的采集、數(shù)據(jù)預(yù)處理、多變量數(shù)據(jù)分析、標(biāo)記物識別和途徑分析等步驟[8]。通常代謝組學(xué)的分析技術(shù)包括質(zhì)譜分析技術(shù)（mass spectrometry，MS）、核磁共振波譜分析技術(shù)（nuclear magnetic resonance，NMR）、光譜分析技術(shù)（spectroscopy）和色譜分析技術(shù)（chromatograph）。NMR具有對樣品實(shí)現(xiàn)無創(chuàng)性、無偏向的檢測，有良好的客觀性和重現(xiàn)性，且無需對樣品預(yù)處理，被認(rèn)為是唯一能用于活體和原位研究的代謝組學(xué)檢測技術(shù)[9]。質(zhì)譜適用于生物小分子的分析，尤其是氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC/MS）、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（LC/MS）和電泳-質(zhì)譜聯(lián)用（CE/MS）等聯(lián)用技術(shù)在各個(gè)研究領(lǐng)域應(yīng)用較為廣泛。由于代謝物種類繁多，各物質(zhì)之間差異比較大，且濃度分布范圍廣，僅靠一種分析技術(shù)無法完成。因此，必須聯(lián)合使用幾種分析技術(shù)才能對代謝產(chǎn)物進(jìn)行全面分析[3]。目前NMR和色譜-質(zhì)譜聯(lián)用是代謝組學(xué)檢測中最為常用的檢測方法。此外，隨著代謝組學(xué)分析技術(shù)的快速發(fā)展，對檢測儀器的改造也越來越高級。Liu等利用快速高分辨液相色譜系統(tǒng)（rapid resolution liquid chromatography，RRLC）與MS聯(lián)用技術(shù)，也獲取了樣品的全部內(nèi)源性小分子代謝物信息[10]，并且此方法有可能成為后續(xù)代謝物檢測的主要方法。

3代謝物對胚胎體外發(fā)育潛能預(yù)測的研究

3.1卵泡液

卵母細(xì)胞存在于卵泡發(fā)育整個(gè)過程的99%以上，因此，卵泡液中的各種代謝物均可反映卵泡液所處的內(nèi)環(huán)境[11]。卵泡液由多種物質(zhì)組成，主要包括血漿、顆粒細(xì)胞、卵泡膜細(xì)胞和卵母細(xì)胞的代謝物等。這些代謝物質(zhì)可能與卵母細(xì)胞的質(zhì)量及其發(fā)育潛能密切相關(guān)[12]。Thomas等首次將代謝組學(xué)分析技術(shù)應(yīng)用于卵泡液的測定，發(fā)現(xiàn)卵泡液中代謝物組成（脂肪酸和磷酸鹽等）成分的不同會影響卵母細(xì)胞的發(fā)育潛能[13]。同時(shí)，Bender等通過測定牛卵泡液中飽和脂肪酸的水平，得出高飽和脂肪酸不利于卵母細(xì)胞的成熟和早期胚胎發(fā)育的結(jié)論[14]。Zeron等也得出卵泡液中脂肪酸含量的高低會影響卵母細(xì)胞的成熟和早期胚胎發(fā)育的結(jié)果[15]。McRae等利用代謝組學(xué)技術(shù)對10名婦女不同生理周期中卵泡的卵泡液進(jìn)行分析，結(jié)果表明月經(jīng)周期中卵泡液中乳酸鹽和丙酮酸鹽的含量較高，但是卵泡液中的葡萄糖含量卻很低[16]。另外也有研究證實(shí)，卵泡液中膽固醇水平的高低也可作為預(yù)測卵母細(xì)胞發(fā)育潛能的一個(gè)代謝標(biāo)記指標(biāo)[17]。但是，利用代謝組學(xué)來預(yù)測卵母細(xì)胞發(fā)育潛能也存在一定的劣勢，比如卵泡液中所檢測出的標(biāo)志物質(zhì)非常有限，且不能確定是何種標(biāo)志物起作用，因此在利用代謝組學(xué)技術(shù)通過卵泡液中的標(biāo)志物來預(yù)測卵母細(xì)胞及胚胎的發(fā)育還需要深入研究[12]。

3.2胚胎培養(yǎng)液

3.2.1碳水化合物胚胎體外培養(yǎng)液中使用的碳水化合物主要有丙酮酸和葡萄糖。胚胎早期培養(yǎng)主要以丙酮酸和乳酸為功能底物，而在晚期主要以葡萄糖為功能物質(zhì)。因此，培養(yǎng)基中丙酮酸和葡萄糖的吸收量被作為胚胎發(fā)育潛能的評價(jià)指標(biāo)[18]。研究表明，丙酮酸攝取量高的胚胎易發(fā)育至囊胚[19]。Turner等研究也指出丙酮酸吸收量與胚胎植入能力有關(guān)[20]。然而，這一結(jié)論卻與之前的研究的結(jié)果[21-22]相反。究其原因，可能是因?yàn)橛捎谠囼?yàn)中使用的培養(yǎng)液不同以及物種不同所致。綜上所述，丙酮酸的攝取量與胚胎發(fā)育能力的關(guān)系還沒有統(tǒng)一的定論，因此，丙酮酸攝取量能否作為胚胎發(fā)育和生殖潛能的標(biāo)志有待進(jìn)一步研究。

在胚胎的發(fā)育過程中，葡萄糖的攝入量逐漸升高。Gardner等研究表明，在胚胎發(fā)育過程中，優(yōu)質(zhì)囊胚對葡萄糖的攝取量顯著高于劣質(zhì)囊胚[23]。Sakkas等[1]也得出了類似的結(jié)論。然而，Lane等發(fā)現(xiàn)糖酵解活性低的囊胚有較高的發(fā)育能力，且移植后妊娠率高于糖酵解活性高的囊胚[24]。此外，Jones等發(fā)現(xiàn)，葡萄糖的攝取量與胚胎的發(fā)育潛能沒有直接的相關(guān)性[25]。因此，在胚胎的發(fā)育過程中，通過葡萄糖含量的變化來預(yù)測胚胎的發(fā)育潛能也存在一定的分歧。依靠培養(yǎng)基中葡萄糖和丙酮酸的含量來預(yù)測胚胎發(fā)育潛能的理論還不完善，還需要深入研究。

3.2.2氨基酸氨基酸是蛋白質(zhì)合成的基礎(chǔ)，在胚胎的代謝過程中也起著重要的作用。主要作用如下：（1）提供能量；（2）維持細(xì)胞滲透壓；（3）調(diào)節(jié)pH值；（4）合成蛋白質(zhì)合成的前體物質(zhì)；（5）抗氧化作用；（6）信號傳遞。Houghton等首次利用HPLC-MS技術(shù)測定胚胎在發(fā)育的不同階段氨基酸的含量，結(jié)果表明，氨基酸代謝低的胚胎具有較好的發(fā)育潛能[26]。Brison等采用同樣的技術(shù)，發(fā)現(xiàn)氨基酸的含量與妊娠率有一定的相關(guān)性[27]。Stokes等研究表明，牛、豬和人胚胎發(fā)育不同階段的氨基酸代謝活性與DNA損傷呈正相關(guān)[28]。此外，研究證實(shí)不同性別的胚胎對氨基酸的利用率也有所差異[29]。雖然培養(yǎng)基中氨基酸的代謝在一定程度上能預(yù)測胚胎的發(fā)育潛能，但目前尚不能確定標(biāo)志性的氨基酸，因此還需要進(jìn)一步的試驗(yàn)去發(fā)現(xiàn)和驗(yàn)證。

3.2.3可溶性人白細(xì)胞抗原因子（soluble human leukocyte antigen-G，sHLA-G）sHLA-G由胚胎分泌，對維持正常的妊娠起著關(guān)鍵性的作用[30]。近年來研究表明，sHLA-G 在胚胎附植前的各發(fā)育階段中均有表達(dá)，且其含量與胚胎著床密切相關(guān)，可作為胚胎著床的標(biāo)志性分子。Fisch等研究表明，sHLA-G 同胚胎等級評分結(jié)合起來，可用于 D3胚胎移植后妊娠的預(yù)測[31]。Rebmann等也證實(shí)了這一結(jié)論[32]。同時(shí)，Rebmann等通過ICSI方法構(gòu)建的胚胎培養(yǎng)液中sHLA-G的表達(dá)與臨床妊娠率顯著相關(guān)，而通過IVF方法構(gòu)建的胚胎培養(yǎng)液中sHLA-G的表達(dá)與妊娠率不相關(guān)[32]。然而Noriko等在各發(fā)育階段胚胎的培養(yǎng)液中均未檢測出sHLA-G的存在[33]。研究結(jié)果之所以存在差異，可能與構(gòu)建胚胎的方法和培養(yǎng)液的成分等有一定的關(guān)系。

3.2.4胰島素樣生長因子（insulin-like growth factors，IGFs）IGFs是一種具有多種生物學(xué)活性的蛋白多肽物質(zhì)，主要包括IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ這2種，在卵泡的自分泌和旁分泌中起著重要的作用。IGF在植入前的胚胎中均有表達(dá)，提示IGF可能對胚胎的發(fā)育有一定的作用[34]。Lighten等研究證實(shí)，IGF對植入前胚胎的發(fā)育有促進(jìn)作用[35]。胚胎體外培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)液中胚胎分泌IGF-Ⅱ的含量可反映胚胎生長發(fā)育及著床能力，可能主要是通過促進(jìn)囊胚對葡萄糖的攝取而促進(jìn)胚胎的發(fā)育[36]。

3.2.5血小板活性因子（platelet activating factor，PAF）PAF是一種內(nèi)源性具有廣泛生物活性的磷脂類介質(zhì)，在動物生殖生理調(diào)控尤其是排卵、受精和分娩等方面起著重要的作用[37]。ONeill等最先發(fā)現(xiàn)妊娠胚胎分泌PAF的含量顯著高于未妊娠胚胎[38]。后來Roudebush等也得出了相同的結(jié)論。這提示我們：胚胎分泌PAF的能力與胚胎發(fā)育的狀況有一定的相關(guān)性，且胚胎發(fā)育越好，分泌量就越大，因此，胚胎代謝液中PAF可作為胚胎發(fā)育潛能的指示物[39]。Emerson等也研究發(fā)現(xiàn)，PAF主要通過刺激胚胎對葡萄糖和乳糖的代謝，進(jìn)而提高胚胎的發(fā)育率[40]。

4展望

代謝組學(xué)作為一種新興的技術(shù)與方法，可更便捷、更快速、更客觀地選擇優(yōu)質(zhì)胚胎進(jìn)行移植，在一定程度上彌補(bǔ)了基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)以及其他組學(xué)研究中的缺點(diǎn)。隨著研究的不斷深入，代謝組學(xué)的應(yīng)用范圍也得到不斷拓寬。在輔助生殖領(lǐng)域，研究者運(yùn)用代謝組學(xué)的方法進(jìn)行了有意義的探究，且取得了一定的成果。但是，應(yīng)用代謝組學(xué)對胚胎的發(fā)育潛能進(jìn)行評估處于剛起步階段，還存在一定的問題，比如目前研究的對象數(shù)量比較少，不適用于單一胚胎植入的妊娠檢測等，因此，利用代謝組學(xué)技術(shù)降低多胎妊娠率并達(dá)到精準(zhǔn)預(yù)測妊娠這一目的，還需要進(jìn)一步深入研究。

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