秦凱迪++++++童仕倫++++++鄭勇斌++++++孫偉++++++肖曠++++++宋丹

[摘要] 構建結直腸癌的動物模型在研究人類結直腸癌的預防與治療中具有重大意義，而研究腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉移中扮演重要角色的癌組織局部免疫狀態(tài)的動物模型尚處于探索階段。其中局部免疫基因工程模型的研究發(fā)展迅速，并在突變結腸干細胞成瘤以及解決因原發(fā)腫瘤生長而導致的腸梗阻上取得了突破性進展。由此，一種未來理想局部免疫基因工程模型已展露雛形。

[關鍵詞] 結直腸癌；局部免疫狀態(tài)；基因工程小鼠模型；結腸干細胞

[中圖分類號] R656 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）02（b）-0028-03

[Abstract] The establishment of animal models of colorectal cancer in the study of human colorectal cancer prevention and treatment has great significance， and the study of tumor occurrence， development and metastasis which plays an important role in the local immune status of cancer animal model is still in the exploratory stage. The study of local immune genetic engineering model has developed rapidly and has made breakthrough progress in mutating colonic stem cell and solving intestinal obstruction caused by primary tumor growth. Thus， an ideal local immune genetic engineering model has been exposed prototype.

[Key words] Colorectal cancer； Local immune status； Genetic engineering mouse model； Colon stem cells

結直腸癌目前已是全世界第二大高致死率的腫瘤[1]。其癌細胞的產(chǎn)生與轉移、機體內(nèi)外多種因素相關，而癌組織的局部免疫狀態(tài)在其中發(fā)揮的重要作用越來越得到學者的重視。最初研究結直腸癌的局部免疫狀態(tài)的資料多來源于臨床手術標本，但它的局限性也是顯而易見的，如受人體的醫(yī)學倫理學限制取材缺乏可重復性以及因切除標本多為中晚期腫瘤而缺乏廣泛代表性等。后來學者的研究重點放到了小鼠模型上，現(xiàn)有的結直腸癌小鼠模型根據(jù)成瘤機制不同可分為三種：其中一種是運用致癌劑誘變細胞成瘤；另外一種是直接移植腫瘤細胞進而使小鼠成瘤；最后一種就是運用基因工程方法使小鼠成瘤，其中基因工程學小鼠模型研究發(fā)展迅速。三種模型各有優(yōu)缺點，但現(xiàn)階段終究都不是理想的結直腸癌的局部免疫研究模型。未來理想的結直腸癌動物模型要滿足兩個要求：一方面人體結直腸癌病理生理過程可通過反復無損傷取材而被模型重現(xiàn)并全程監(jiān)測，另一方面小鼠免疫功能不被人為原因破壞，滿足局部免疫研究要求。本文將闡述結直腸癌與局部免疫狀態(tài)的關系、回顧現(xiàn)有的結直腸癌局部免疫動物模型和討論理想的局部免疫動物模型研究進展。

1 結直腸癌局部免疫動物模型必要性

腫瘤特別是結直腸癌的發(fā)生、發(fā)展、轉移是個復雜而緩慢的過程，病灶局部免疫狀態(tài)在其中發(fā)揮重要作用。通常狀態(tài)下，一方面，人體免疫系統(tǒng)能夠及時識別體內(nèi)突變細胞并加以消滅，另一方面，研究表明，腫瘤細胞可以逃避免疫系統(tǒng)的識別和殺傷[2-3]。雖然其具體逃避機制尚不明確，但是大量的臨床研究表明，腫瘤細胞可與其局部免疫狀態(tài)之間發(fā)生某些適應性改變?nèi)缑庖咛右莺兔庖咭种疲惚苋梭w免疫系統(tǒng)的負性調節(jié)，從而造成腫瘤細胞進一步的發(fā)生、發(fā)展及轉移[4-6]。

具體來說，由于人體對腫瘤組織的免疫反應是個多環(huán)節(jié)、多影響因素的復雜病理生理過程，既包括先天性免疫系統(tǒng)的作用，又包括獲得性免疫系統(tǒng)的影響。在腫瘤產(chǎn)生階段，個體差異決定了其免疫系統(tǒng)功能強弱的不同，造成某些情況下腫瘤細胞發(fā)生時免疫系統(tǒng)不能將其及時識別及消除，從而形成腫瘤原發(fā)灶。在腫瘤轉移階段，腫瘤細胞可通過某種機制逃脫免疫監(jiān)視，隨人體體液系統(tǒng)到達新定植點，新定植點局部免疫系統(tǒng)將與癌細胞發(fā)生繁瑣的互相適應性改變，甚至其病灶局部免疫細胞種類都會發(fā)生變化，從而使轉移灶形成和生長[7-11]。如乳腺癌轉移時，轉移器官如肺的局部免疫功能會被腫瘤細胞降低，這樣轉移來的癌細胞將得到一個合適的定植環(huán)境，從而促進乳腺癌細胞肺轉移病灶的形成與生長[12]。

這些發(fā)現(xiàn)均提示機體局部免疫狀態(tài)和結直腸癌的發(fā)生和發(fā)展關系密切，而合適的結直腸癌局部免疫動物模型是現(xiàn)階段此領域發(fā)展的基礎和熱點。

2 當前結直腸癌局部免疫小鼠模型比較

近些年，結直腸癌小鼠模型發(fā)展迅速，現(xiàn)有的結直腸癌小鼠模型根據(jù)成瘤機制不同可分為三種。

第一類模型即致癌劑誘變小鼠模型：這種模型通過特定致癌劑直接作用于動物細胞從而誘發(fā)其發(fā)生細胞突變，但其并不適合成為現(xiàn)階段理想的結直腸癌局部免疫動物模型，這是因為一方面，現(xiàn)階段已知的致癌劑誘發(fā)活體動物細胞癌變的發(fā)生率低且不可預測，誘發(fā)后成瘤周期也較長；另一方面，致癌劑不可避免地帶來諸多副作用，常常造成機體的免疫功能損傷。

第二類模型即癌細胞原位或異位移植小鼠模型：它是在活體動物機體中直接原位或異位移植腫瘤細胞，通過移植腫瘤細胞自身的生長而成瘤，這類模型又可分為異基因系小鼠移植模型及同基因系小鼠移植模型兩大類：前者因為受體免疫系統(tǒng)可識別及殺傷移植細胞，要想成瘤常常需抑制受體動物的免疫功能，這種局限性嚴重限制了其在結直腸癌局部免疫狀態(tài)領域的應用；后者則避免了免疫排斥的缺點，如有研究者通過外科手術將小鼠結腸癌細胞系注入另外一種小鼠體內(nèi)，試圖形成小鼠結腸癌轉移模型并研究其免疫功能變化[13]。但此類模型仍有不足，首先，這類模型無法避免手術這一有創(chuàng)操作對受體動物的免疫功能的影響；其次，模型腫瘤組織取材也需通過手術操作甚至處死動物，不能反復多次取材，從而對腫瘤病程監(jiān)測缺乏連貫性，阻礙了此類模型的發(fā)展。

第三類模型即基因工程小鼠模型：它是通過基因打靶、基因沉默和轉基因等基因工程技術產(chǎn)生基因剔除、轉基因疾病小鼠模型和基因功能研究模型，最初的基因工程型模型由于生命周期短及基因技術嚴重影響機體免疫功能而很少應用于局部免疫學研究[14]，隨著能使動物基因選擇性“湮滅”的基因工程方法出現(xiàn)，此類模型取得了突破性的進展，如有研究者將遠端結腸上皮內(nèi)APCloxP等位基因特異性敲除，從而形成理想的散發(fā)性結腸癌模型[15]。但是，不能監(jiān)測腫瘤發(fā)生早期局部免疫狀態(tài)的不足，限制了該模型的應用。

3 局部免疫基因工程模型的研究突破

現(xiàn)階段結直腸癌局部免疫基因工程模型的突破性進展來源于通過基因工程技術突變結腸干細胞成瘤以及突變成瘤后原發(fā)腫瘤生長導致腸梗阻的解決這兩個方面。

具體來說，首先，研究表明，在正常情況下，小鼠隱窩基底部干細胞的分裂與結腸細胞的凋亡處于動態(tài)平衡，動態(tài)平衡的打破將導致腺瘤形成[16]。敲除Apc基因的小鼠，腺瘤發(fā)生概率大，且常會癌變[17]；當結腸干細胞的Kras基因被突變后，其腺瘤常向腺癌軸向發(fā)展[18-19]。當Apc基因和Kras基因同時發(fā)生變化時，原發(fā)癌灶常會形成并合并自發(fā)性轉移灶[20]。而且，現(xiàn)階段已有研究者通過特異性激活小鼠結腸干細胞內(nèi)的特殊顏色基因來標記干細胞，通過研究單個干細胞的增殖，進而說明腫瘤的發(fā)生與轉移。這些都說明可以通過突變干細胞研究腫瘤的發(fā)生轉移過程[21-22]。

在此基礎上，由于突變結直腸干細胞成瘤后，結直腸癌發(fā)生與轉移需很長時間，小鼠常因腫瘤生長導致的腸梗阻死亡。近些年，小鼠結腸鏡的研究進展為局部腸梗阻的解決提供了條件，通過小鼠結腸鏡研究者在鏡下可反復將擴張支架置于狹窄腸管處或切除部分腫瘤組織使其恢復到通暢狀態(tài)[23-25]。模型小鼠的研究時限將被延長，更有利于轉移灶的形成，從而為全程監(jiān)測小鼠局部免疫狀態(tài)提供了基礎。

4 一種理想的局部免疫基因工程模型展望

根據(jù)現(xiàn)階段局部免疫基因工程模型的研究進展，參照國外學者對單個干細胞標記的方法，可嘗試通過基因工程學方法，使小鼠Apc基因和Kras基因同時發(fā)生變化并特異性突變且標記結腸干細胞使其成瘤，并在腫瘤的發(fā)生和轉移過程中，隨時通過小鼠結腸鏡和活體顯像系統(tǒng)監(jiān)測目標干細胞的腫瘤病理生理過程并同時解決腸梗阻狀態(tài)，最終構建具有以下特點的一個理想的局部免疫研究模型：①目標突變結腸干細胞能被特異性示蹤，進而動態(tài)監(jiān)測腫瘤的發(fā)生、轉移全過程，構建其腫瘤病理生理過程滿足人體腺瘤-腺癌-轉移發(fā)展規(guī)律的動物模型；②可通過非手術的方式對癌周組織反復取材，并能避免腫瘤生長迅速導致腸梗阻造成的不良結局；③在研究全過程中動物免疫功能保持健全。

此模型將在研究結直腸癌的發(fā)生、發(fā)展、轉移等過程與機體免疫系統(tǒng)的相互關系上發(fā)揮重要作用。

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