劉貴友 鄒瑤 顧楊霞 戴傳超

摘要：在實驗室條件下研究3種內(nèi)生真菌對連作花生土壤尖孢鐮刀菌的拮抗作用。結(jié)果表明：擬莖點霉NJ4.1菌株、擬莖點霉B3菌株和角擔(dān)子菌B6菌株對花生根腐病病原菌尖孢鐮刀菌均有拮抗作用，其中擬莖點霉NJ4.1菌株對尖孢鐮刀菌抑制作用明顯，抑菌率為38.93%，與尖孢鐮刀菌生態(tài)位重疊指數(shù)為1/3；擬莖點霉NJ4.1菌株生長過程中產(chǎn)生的揮發(fā)物對尖孢鐮刀菌抑菌率為18.15%，擬莖點霉NJ4.1菌株發(fā)酵液對尖孢鐮刀菌也有一定的抑制作用，但明顯小于揮發(fā)物對尖孢鐮刀菌的影響。

關(guān)鍵詞：內(nèi)生真菌；花生根腐?。患怄哏牭毒?；拮抗作用；生態(tài)位重疊指數(shù)

中圖分類號： S435.652文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）12-0171-04

收稿日期：2015-10-27

基金項目：國家自然科學(xué)基金（編號：31370507）；江蘇省教育廳產(chǎn)業(yè)化推進項目（編號：JHB2012-16）。

作者簡介：劉貴友（1973—），男，江蘇南京人，博士，副教授，研究方向為微生物轉(zhuǎn)化和微生物生態(tài)學(xué)。E-mail：liuguiyou2001@163.com。

通信作者：戴傳超，博士，教授，研究方向為微生物生態(tài)學(xué)和土壤生態(tài)與修復(fù)。E-mail：daichuanchao@njnu.edu.cn。

花生是世界上分布較廣泛的作物，世界六大洲都有種植。花生是我國重要的油料、經(jīng)濟作物，2013年我國花生種植面積463萬hm2，花生總產(chǎn)量1 697萬t，因此可見，我國是世界上花生總產(chǎn)量和花生油總產(chǎn)量最大的國家[1]。近年來，我國大豆產(chǎn)業(yè)受到國外沖擊，花生行業(yè)的穩(wěn)定及可持續(xù)發(fā)展對食用油安全有著重要意義。因土地資源有限，產(chǎn)區(qū)相對集中，很多地方已經(jīng)形成傳統(tǒng)的優(yōu)勢花生種植產(chǎn)業(yè)，農(nóng)民常常連片、大規(guī)模種植，有的甚至已連作10～20年，往往導(dǎo)致花生根腐病、白絹病等真菌病害加劇[2]，莢果產(chǎn)量下降，生產(chǎn)成本增加[3]。

花生根腐病俗稱“鼠尾”、爛根，它是由包括尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）、腐皮鐮刀菌（Fusarium solani）在內(nèi)的鐮刀菌屬引起的。最新研究表明，隨著花生連續(xù)種植，尖孢鐮刀菌的相對豐度顯著增加，連作花生根腐病發(fā)病率提高2倍[4]，是限制連作花生生產(chǎn)的關(guān)鍵因素。病原真菌侵染不僅引起花生減產(chǎn)，而且還會影響花生品質(zhì)[5]。目前，克服病原真菌引起的花生減產(chǎn)、質(zhì)量下降的方法主要是使用大量有機肥和藥劑等，這不僅增加生產(chǎn)成本，還會引起環(huán)境污染，危害人體健康等。生物防治是一種對環(huán)境友好、對病害具有潛在應(yīng)用價值的綜合治理方法。

研究表明，一些來源于病害植株的根際微生物可以對病菌形成拮抗作用[6]。外源施加哈茨木霉（Trichoderma harzianum）可以誘導(dǎo)黃瓜發(fā)生防御反應(yīng)，產(chǎn)生可降解病菌細(xì)胞壁的相關(guān)酶[7]，顯著防治黃瓜枯萎病[8-9]。從花生根際土壤中篩選得到側(cè)孢短芽孢桿菌，對峙試驗表明，側(cè)孢短芽孢桿菌對花生根腐病、白絹病、瘡痂病、葉斑病等病原菌有顯著的抑制作用，盆栽和田間試驗表明，該菌對花生根腐病、白絹病等均有明顯的防治效果[10]。

研究發(fā)現(xiàn)，植物內(nèi)生真菌施加到土壤環(huán)境中不僅可以促進植物生長[11-13]，而且可以誘導(dǎo)植物幼苗提高防御能力[14-17]，減少病害發(fā)生[18]，但是內(nèi)生真菌的抗病機制不是非常清楚。本研究主要探討實驗室條件下內(nèi)生真菌與花生常見病害——根腐病病原菌之間的拮抗機制，以期為花生根腐病的生物防治提供一定理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1供試菌株內(nèi)生真菌：擬莖點霉屬真菌（Phomopsis sp.）NJ4.1，分離自菊科茅蒼術(shù)（Rhizoma areactylodis Lanceae）葉片[12]；角擔(dān)子菌屬真菌（Ceratobasidum stevensii）B6，分離自大戟科重陽木（Bischofia polycarpa）莖內(nèi)皮；擬莖點霉屬真菌（Phomopsis liquidambari）菌株B3，分離自大戟科重陽木莖內(nèi)皮[19]?；ㄉ≡婢杭怄哏牭毒‵usarium oxysporum，簡稱Fo）。供試菌株均為南京師范大學(xué)江蘇省功能微生物與功能基因組學(xué)重點實驗室保藏菌株。

1.1.2培養(yǎng)基PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，瓊脂15 g，葡萄糖20 g，加水至1 L；PDB培養(yǎng)液：配方（不加瓊脂）與PDA相同；單一碳/氮源培養(yǎng)基[20]：碳/氮源10 mmol/L，瓊脂15 g，加水至1 L。內(nèi)生真菌發(fā)酵液培養(yǎng)基：無菌發(fā)酵液10 mL，PDA培養(yǎng)基90 mL。

1.2內(nèi)生真菌與病原菌平板對峙培養(yǎng)[21]

內(nèi)生真菌和花生病原菌分別接入PDB培養(yǎng)液中，28 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)4 d。轉(zhuǎn)接至PDA培養(yǎng)基平板，28 ℃培養(yǎng)5 d。在PDA培養(yǎng)基上活化的菌落邊緣打取5 mm菌塊，轉(zhuǎn)接至新鮮PDA培養(yǎng)基平板上，內(nèi)生真菌與病原菌之間距離 4 cm，28 ℃培養(yǎng)5 d，分別觀察2種菌生長情況。在新鮮PDA培養(yǎng)基平板上接5 mm空白PDA培養(yǎng)基和5 mm病原菌菌塊作為對照。按下式計算抑菌率：

抑菌率=（對照組菌落半徑-試驗組菌落半徑）/對照組菌落半徑×100%[22]。

1.3內(nèi)生真菌與病原菌營養(yǎng)利用相似性

將內(nèi)生真菌和花生病原菌分別接入PDB培養(yǎng)液中，28 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)4 d活化。將活化的內(nèi)生真菌和病原菌分別接種到含唯一碳/氮源的瓊脂平板上，本試驗共有16種單一碳/氮源培養(yǎng)基（碳/氮源：果糖，葡萄糖，棉子糖，木糖，海藻糖，組氨酸，D-密二糖，丙氨酸，絲氨酸，精氨酸，蔗糖，苯丙氨酸，脯氨酸，蘇氨酸，亮氨酸，甲硫氨酸）。用直徑為5 mm的打孔器分別在母菌平板上打孔，得到均勻內(nèi)生真菌和病原真菌，接種到每一種碳/氮源培養(yǎng)基的中心。對照組為接種在不含任何碳/氮源的瓊脂平板上的內(nèi)生真菌和病原真菌[23]。28 ℃培養(yǎng)5 d，觀察內(nèi)生真菌與病原真菌的生長情況。生態(tài)位重疊指數(shù)計算公式：

生態(tài)位重疊指數(shù)=2種菌共同利用的碳氮源數(shù)量/測試菌利用的碳氮源數(shù)量[24]。

1.4內(nèi)生真菌的發(fā)酵液對病原菌生長的影響

將內(nèi)生真菌接種到PDB培養(yǎng)液中，28 ℃培養(yǎng)14～15 d，[JP2]5 000 r/min 離心10 min，收集上清液。上清液經(jīng)3層濾紙抽濾，除去菌絲體。濾液通過0.22 μm濾膜，得到無菌發(fā)酵原液。

無菌發(fā)酵原液用無菌水稀釋，得到一系列不同濃度梯度（稀釋5、2倍，原液）的發(fā)酵液，以1 ∶[KG-*3]9的體積比與PDA培養(yǎng)基混合，充分搖勻，制成平板。將5 mm病原真菌菌塊接種在平板中心，28 ℃培養(yǎng)5 d，測量菌落半徑（cm）。以不加發(fā)酵液，僅加1/10體積無菌水的PDA作為對照。按“1.2”節(jié)公式計算抑菌率。

1.5內(nèi)生真菌揮發(fā)物對病原菌生長的影響

在2個PDA平板中分別接種3個內(nèi)生真菌菌塊和1個病原真菌菌塊。將2個平板的皿口相扣，用封口膜封好。培養(yǎng)病原真菌的平板放在上面，28 ℃恒溫培養(yǎng)5 d。以接種病原真菌而未接種內(nèi)生真菌的菌塊作為對照。按“1.2”節(jié)公式計算抑菌率。

2結(jié)果與分析

2.1內(nèi)生真菌與病原菌平板對峙培養(yǎng)結(jié)果

[JP2]從圖1-a可見，尖孢鐮刀菌的菌落呈深色（圖1-a），肉眼觀察呈紫色。從圖1-b可見，NJ4.1菌落包圍尖孢鐮刀菌菌落，尖孢鐮刀菌不再生長，NJ4.1也不再生長，對峙處有較為明顯的隔離帶（抑菌圈）。B6菌株與尖孢鐮刀菌的對峙處也有較為明顯的隔離帶（圖1-c）。內(nèi)生真菌B3菌落呈淺色（圖[JP3]1-d），肉眼觀察呈淡黃色，對尖孢鐮刀菌的抑制作用較為明顯。

由表1可見，對峙培養(yǎng)中3種內(nèi)生真菌對尖孢鐮刀菌均有不同程度的抑制，其中內(nèi)生真菌NJ4.1菌株對尖孢鐮刀菌抑制作用較為明顯，抑菌率達(dá)到38.93%。

2.2擬莖點霉NJ4.1菌株與尖孢鐮刀菌營養(yǎng)利用相似性

由表2可見，平板上內(nèi)生真菌NJ4.1菌株與尖孢鐮刀菌相互抑制的部分原因是兩者之間營養(yǎng)利用具有相似性。在同一平板上生長時，內(nèi)生真菌NJ4.1菌株與尖孢鐮刀菌發(fā)生了營養(yǎng)利用競爭，引起了抑制作用，內(nèi)生真菌NJ4.1菌株與病原菌尖孢鐮刀菌的生態(tài)位重疊指數(shù)為1/3。

2.3內(nèi)生真菌NJ4.1菌株發(fā)酵液對尖孢鐮刀菌生長的影響

由圖2可見，與對照組相比，不同濃度的發(fā)酵液對尖孢鐮刀菌有不同程度的抑制作用。

2.4內(nèi)生真菌NJ4.1的揮發(fā)物對尖孢鐮刀菌生長的影響

與對照組（圖3-a）相比，NJ4.1揮發(fā)物對病原真菌尖孢鐮刀菌的抑制作用明顯（圖3-b）。測定結(jié)果表明，對照組、試驗組菌落半徑分別為（2.76±0.10）、（2.26±0.14） cm。NJ4.1揮發(fā)物對尖孢鐮刀菌的抑菌率為18.12%。

3結(jié)論與討論

[JP2]研究發(fā)現(xiàn)，在土壤中施加廣譜植物內(nèi)生真菌擬莖點霉B3菌株，可以顯著加快連作土壤中植物凋落物中纖維素、木質(zhì)素降解和植物殘茬的腐解，協(xié)同土中G-細(xì)菌加速酚酸降解，減少化感物質(zhì)的自毒作用，誘導(dǎo)植物幼苗提高防御能力[14-17]；此外，可以有效改變土壤微生物區(qū)系，改善土壤酶活性，改良土壤環(huán)境，提高花生產(chǎn)量[11-13]，克服花生連作障礙。施加到土壤環(huán)境中的擬莖點霉NJ4.1、擬莖點霉B3和角擔(dān)子菌B6不僅可以促進植物生長，而且可以增強植物防御系統(tǒng)，減少病害發(fā)生，但是抗病機制尚未清楚，因此揭示土壤中施加內(nèi)生真菌抵御花生病害的抗病機制，對于克服花生連作障礙具有重要意義。

植物內(nèi)生菌與病原菌具有相同的生態(tài)位，在植物體內(nèi)相互競爭空間、營養(yǎng)。內(nèi)生真菌為占據(jù)有效生態(tài)位，通過產(chǎn)生次級代謝產(chǎn)物和一些抗菌成分，強烈抑制病原菌生長，使病原菌得不到正常的營養(yǎng)供給而消亡，從而增強宿主抵御病害的能力[25]。分離自茅蒼術(shù)內(nèi)生熒光假單胞菌ALEB 7B，能夠顯著抑制羅耳阿太菌菌株SY4的生長，并且能夠顯著降低茅蒼術(shù)組培苗白絹病的發(fā)病率[26]。近年來，關(guān)于內(nèi)生真菌擬莖點霉屬次級代謝產(chǎn)物領(lǐng)域的研究倍受關(guān)注。分離自蒲公英擬莖點霉PG23的菌株培養(yǎng)濾液含有抗菌化合物2-羥基-6-甲基苯酸，對一些病原菌顯示出拮抗作用，體外培養(yǎng)表現(xiàn)出強烈的抑菌活性[27]。分離自箭葉菊（Senecio kleiniiformis）擬莖點霉No.7133，它合成的4種次生代謝產(chǎn)物也表現(xiàn)出不同的抑菌活性[28]。但是由于擬莖點霉屬在種級水平的鑒定存在實際困難，一些能在體外發(fā)揮作用的次級代謝產(chǎn)物功效目前尚不清楚[29-30]。實驗室條件下，綠色木霉TR28菌株與尖孢鐮刀菌平板對峙結(jié)果表明，綠色木霉生長快于尖孢鐮刀菌FO2G1，接觸后FO2G1生長停止[31]。生防菌JK-2（短短芽孢桿菌，Brevibacillus brevis） 對尖孢鐮刀菌效果特別顯著[32]。

本研究表明，內(nèi)生真菌NJ4.1、B3和B6菌株對尖孢鐮刀菌均有明顯拮抗作用，其中NJ4.1菌株對尖孢鐮刀菌抑制作用最為明顯，抑菌率達(dá)到38.93%。進一步研究發(fā)現(xiàn)，NJ4.1菌株和尖孢鐮刀菌生態(tài)位重疊指數(shù)為1/3，NJ4.1菌株生長過程中產(chǎn)生的揮發(fā)物對尖孢鐮刀菌的抑菌率為18.15%，NJ4.1菌株發(fā)酵液對尖孢鐮刀菌也有一定的抑制作用。

如何鑒定出NJ4.1菌株的揮發(fā)物和發(fā)酵液中的次生代謝產(chǎn)物以及內(nèi)生真菌如何在自然環(huán)境下抑制病菌生長，促進花生植株抵御病菌侵染，減少花生患病概率，提高花生產(chǎn)量，均有待進一步探討。

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