白孟麟，李勝，夏梅

(1南昌大學(xué)江西醫(yī)學(xué)院瑪麗女王學(xué)院，南昌330006；2山東大學(xué)附屬山東省腫瘤醫(yī)院；3山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院；4山東省藥物研究院)

腎癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測及其臨床意義的研究現(xiàn)狀

白孟麟1，李勝2,3，夏梅4

(1南昌大學(xué)江西醫(yī)學(xué)院瑪麗女王學(xué)院，南昌330006；2山東大學(xué)附屬山東省腫瘤醫(yī)院；3山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院；4山東省藥物研究院)

腎癌是臨床上較為常見的惡性腫瘤。由于早期癥狀不明顯，約30%的腎癌患者在確診時已發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。腫瘤細(xì)胞進(jìn)入血液循環(huán)是腫瘤轉(zhuǎn)移過程中的重要步驟，循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTCs)是指脫離原發(fā)病灶并進(jìn)入外周血循環(huán)系統(tǒng)的一類細(xì)胞。目前已經(jīng)報道的CTCs檢測技術(shù)有50余種，其中應(yīng)用較為廣泛的方法為RT-PCR法及CellSearch法，近年新開展的微流體芯片法和eTumorType法表現(xiàn)出了較高的檢出率，具有較好的應(yīng)用前景。研究提示，外周血CTCs水平可以用于判斷腎癌患者的臨床分期和評估預(yù)后，在腫瘤的早期微轉(zhuǎn)移中具有重要作用。

腎細(xì)胞癌；循環(huán)腫瘤細(xì)胞；腫瘤轉(zhuǎn)移；檢測方法；預(yù)后

腎細(xì)胞癌(RCC)是一種較常見的惡性腫瘤，2015年，中國共有6.68萬例新增腎癌患者，約2.34萬人因腎癌死亡[1]。轉(zhuǎn)移是腎癌患者死亡的主要原因，Ⅳ期RCC患者的5年生存率僅為11.7%，顯著低于Ⅰ期患者的92.6%[2]。但由于腎癌的早期癥狀不明顯，30%左右的患者在被確診腎癌時都已出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。因此，找到一種能反映腫瘤細(xì)胞早期轉(zhuǎn)移的生物標(biāo)記物一直是近年來RCC研究的熱點。經(jīng)血液循環(huán)進(jìn)行轉(zhuǎn)移是腎癌轉(zhuǎn)移灶形成的重要途徑。循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTCs)是指人體中脫離原發(fā)病灶并進(jìn)入外周血循環(huán)系統(tǒng)的一類細(xì)胞，這些細(xì)胞在人體血液系統(tǒng)中伴隨血液進(jìn)行循環(huán)，可以在脫離血液循環(huán)后形成新的轉(zhuǎn)移灶。由于CTCs在腫瘤的早期微轉(zhuǎn)移中具有重要作用，CTCs的檢測和分析對腫瘤微轉(zhuǎn)移的發(fā)現(xiàn)、療效評價及預(yù)后評估等方面有重要意義[3]。本文對CTCs檢測技術(shù)在腎癌領(lǐng)域中應(yīng)用及其臨床意義的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 CTCs概述

1867年，澳大利亞醫(yī)學(xué)家Ashworth首次在1例死亡腫瘤患者的外周血中發(fā)現(xiàn)了與腫瘤細(xì)胞類似的血細(xì)胞，由此提出了CTCs的概念。CTCs是人體中脫離最初病灶進(jìn)入外周血的腫瘤細(xì)胞，一般認(rèn)為腫瘤細(xì)胞在經(jīng)歷過上皮間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)換(EMT)的過程后，獲得了脫離原發(fā)病灶并進(jìn)行轉(zhuǎn)移入侵的能力。在進(jìn)入血液循環(huán)后，只有極少部分CTCs能夠逃過機(jī)體免疫監(jiān)視，并最終穿越內(nèi)皮細(xì)胞層脫離外周血管，來到其他臟器的微環(huán)境中。小部分脫離血液循環(huán)的CTCs可以安全度過靜止期，并最終在多種細(xì)胞因子的作用下形成新的轉(zhuǎn)移病灶。CTCs可以來自于腫瘤的原發(fā)病灶或轉(zhuǎn)移病灶，作為一種腫瘤生物標(biāo)記物具有較為豐富的應(yīng)用價值，包括腫瘤微轉(zhuǎn)移的早期發(fā)現(xiàn)、判斷疾病分期、預(yù)后評估以及指導(dǎo)治療等。在臨床實踐中，在外周血中發(fā)現(xiàn)CTCs并不一定反映患者一定發(fā)生了遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，但卻可提示發(fā)生轉(zhuǎn)移的可能性大大增加，從而可以對患者采取更為積極的治療策略。外周血CTCs具有較強(qiáng)的特異性且含量極少，一般每106～107個血細(xì)胞中才含有一個CTCs。這對外周血CTCs檢測技術(shù)的敏感度提出了較高的要求，一直到20世紀(jì)末期，外周血CTCs檢測才逐漸被應(yīng)用在臨床中[4]。

2 腎癌患者外周血CTCs檢測方法

在一些惡性腫瘤(如乳腺癌、膀胱癌等)中，外周血CTCs的檢測技術(shù)已經(jīng)相對成熟，但關(guān)于腎癌患者外周血CTCs檢測的研究則相對較少。目前報道的對腎癌患者外周血CTCs的檢測方法包括RT-PCR法、CellSearch法、免疫磁珠分選法(MACS)、尺寸排除法、流式細(xì)胞法、丫啶橙熒光染色法(AO-F)、微流體芯片法以及結(jié)合計算機(jī)算法的eTumorType等，其中應(yīng)用較為廣泛的方法為RT-PCR法及CellSearch法。

2.1 RT-PCR法 RT-PCR技術(shù)是一種通過檢測腫瘤特異性標(biāo)記物mRNA的表達(dá)情況來推斷CTCs水平的方法。RT-PCR法是第一批用于檢測腎癌患者外周血CTCs的方法之一，在1999年，McKiernan等[5]以一種在透明細(xì)胞癌中廣泛表達(dá)的基因碳酸酐酶9(CAIX)的 mRNA作為檢測標(biāo)志物，發(fā)現(xiàn)該方法對腎透明細(xì)胞癌診斷的敏感度和特異度分別為50%、98.2%。除CAIX mRNA外，鈣黏蛋白6(CDH6)的mRNA也可以作為外周血CTCs的檢測標(biāo)志物。Shimazui等[6]報道，在87例各分期的腎癌患者中，外周血CDH6 mRNA的檢出率為52.9%。RT-PCR法在檢測外周血CTCs方面表現(xiàn)出一定的敏感度和特異度，但是該方法目前尚無統(tǒng)一的標(biāo)志物，且除早期文獻(xiàn)外并無新的文獻(xiàn)報道。除此之外，該方法在應(yīng)用時需要破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)來提取mRNA，限制了對檢出的CTCs進(jìn)行進(jìn)一步計數(shù)和形態(tài)學(xué)分析的可能性，因此盡管RT-PCR法起步較早，但其一直未被批準(zhǔn)應(yīng)用于臨床。

2.2 CellSearch法 CellSearch檢測系統(tǒng)(CSS)是惟一經(jīng)FDA批準(zhǔn)，可以用于對乳腺癌、結(jié)直腸癌等惡性腫瘤進(jìn)行療效監(jiān)測和預(yù)后評價的檢測方法。在檢測過程中，患者血樣中的CTCs和白細(xì)胞首先被含有抗上皮細(xì)胞黏質(zhì)因子(EpCAM)抗體的磁鐵流體富集，富集的CTCs和白細(xì)胞進(jìn)而分別被CK8/18/19抗體及CD45抗體標(biāo)記，并使用4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)進(jìn)行核染，最后篩選出的EpCAM+/CK+/DAPI+/CD45-細(xì)胞被標(biāo)記為CTCs。Allard等[7]在對CellSearch法進(jìn)行評估時發(fā)現(xiàn)，盡管在乳腺癌、結(jié)直腸癌等惡性腫瘤中，CSS表現(xiàn)出較高的檢出率，但RCC患者的外周血CTCs檢出率僅為25%。而在漢族人群中，腎癌患者的外周血CTCs檢出率同樣偏低，僅為12.5%[8]。

CellSearch法的低CTCs檢出率與腎癌細(xì)胞較低的EpCAM表達(dá)水平有關(guān)。作為一種上皮細(xì)胞癌，腎癌細(xì)胞在經(jīng)歷EMT過程后，表面的EpCAM抗原含量急劇減少，在透明細(xì)胞癌患者中，EpCAM的檢出率僅為20%～40%[9]。而Gradilone等[10]使用RT-PCR法對腎癌患者外周血的CK8/18/19及CD44水平進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)腎癌患者的腫瘤細(xì)胞具有較低的CK8/18/19表達(dá)水平及較高的CD44表達(dá)水平，但具體原因尚不明確，需要進(jìn)一步研究。

2.3 其他方法 腎癌細(xì)胞較低的EpCAM表達(dá)推動了一系列替代方法的研究，如免疫磁珠負(fù)性分選法[11,12]、尺寸排除法[13]、微流體芯片法[14]、丫啶橙染色法[15,16]、eTumorType法[17]和流式細(xì)胞法[18]等。在這些方法中，微流體芯片法和eTumorType法表現(xiàn)出了較高的檢出率，具有較好的應(yīng)用前景。

微流芯片法是Liu等[14]于2016年提出的一套基于腎癌細(xì)胞的特異性標(biāo)志物CAIX和CD147的正性分選法。該法的裝置包含了一個混沌混合裝置以及覆蓋了抗CAIX及CD147抗體的納米線基板。在對CTC進(jìn)行分選之前，Liu等對透明細(xì)胞癌中CAIX和CD147的表達(dá)水平進(jìn)行了檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)97.1%的透明腎細(xì)胞腫瘤都呈CAIX/CD147陽性，而僅有18.6%呈EpCAM陽性；之后對76例腎癌患者和15例健康志愿者的外周血樣的分析提示，該系統(tǒng)的檢出率和特異性分別為94.7%和86.7%。

在2017年由Zou等[17]提出的eTumorType算法是另一個具有廣泛前景的CTCs檢測方法。該算法根據(jù)400余例腎癌患者的SNP數(shù)據(jù)，通過對細(xì)胞基因復(fù)制數(shù)變異(CNV)的分析來對外周血CTCs的含量進(jìn)行檢測。在腎癌CTCs的分析中，該方法表現(xiàn)出90%左右的檢出率，具有較高的檢出率，但仍缺乏后續(xù)研究。

但CTCs檢測技術(shù)仍需面對很多問題。如各項檢測技術(shù)并無統(tǒng)一的檢測標(biāo)準(zhǔn)，致使不同方法之間CTCs的檢出結(jié)果相差巨大；目前尚缺乏對CTCs檢測與其臨床應(yīng)用價值的大樣本實驗，CTCs檢測技術(shù)的臨床應(yīng)用價值不能得到有效的證實；除此之外還需注意的是，CTCs與腎癌患者發(fā)生進(jìn)展或轉(zhuǎn)移的機(jī)制原理尚不清晰，還亟待進(jìn)一步的細(xì)胞學(xué)研究進(jìn)行分析。

3 腎癌CTCs檢測的臨床意義

3.1 CTCs在臨床分期與輔助診斷中的應(yīng)用價值 研究發(fā)現(xiàn)，腎癌患者的5年生存率與臨床分期存在較強(qiáng)的相關(guān)性，Ⅰ期患者的生存率高達(dá)90%以上，而發(fā)生轉(zhuǎn)移的Ⅳ期患者的5年生存率僅為11.7%。可見臨床分期是影響腎癌患者預(yù)后的重要因素，準(zhǔn)確判斷腎癌患者的臨床分期對提高患者的生存率具有關(guān)鍵作用。在臨床上，相較于傳統(tǒng)的檢測方法如影像學(xué)檢查等，CTCs檢測具有對早期腫瘤微轉(zhuǎn)移檢出率高、無創(chuàng)等優(yōu)點[19,20]。大量研究已經(jīng)證實了CTCs檢測可用于協(xié)助判斷腫瘤患者臨床分期。Shimazui等于2003年使用RT-PCR法對87名腎癌患者的外周血CTCs檢測標(biāo)記物CDH6 mRNA表達(dá)情況進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)M1期患者的檢出率顯著高于M0期。Bluemke等在使用免疫磁珠分選法對154例腎癌患者的外周血CTCs水平進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)，患者的CTCs檢出率與淋巴結(jié)狀態(tài)(N分期)和轉(zhuǎn)移(M分期)情況具有顯著相關(guān)性。劉敏等[15]和張濤等[18]分別應(yīng)用丫啶橙熒光染色法和流式細(xì)胞法對27例健康對照和50例腎癌患者的外周血CTCs水平進(jìn)行了檢測，發(fā)現(xiàn)患者的T分期與CTCs檢出率顯著正相關(guān)。

以上研究雖然表明腎癌患者的CTCs檢出情況與患者的臨床分期存在相關(guān)性，但由于其檢測方法的檢出率普遍較低，在臨床上應(yīng)用價值有限。Liu等[14]于2016年提出的微流芯片法是一種具有廣泛適用性的方法，除了具有較高的CTCs檢出率(94.7%)外，還發(fā)現(xiàn)當(dāng)結(jié)合腫瘤標(biāo)記物CK8/18/19與Vimentin進(jìn)行陽性篩選時，Ⅲ、Ⅳ期腎癌患者的CTCs檢出量較Ⅰ、Ⅱ期患者高1.2倍，且Ⅳ期患者的CTCs檢出量顯著高于Ⅲ期患者，表明患者的外周血CTCs計數(shù)與其臨床分期明顯相關(guān)。可見在腎癌診療中，患者的CTCs檢出情況可以反映患者疾病的發(fā)展趨勢，作為臨床診斷的有益補(bǔ)充，對腫瘤早期轉(zhuǎn)移的發(fā)現(xiàn)具有重要意義。

3.2 CTCs與腎癌患者的預(yù)后評估 預(yù)后評估是目前CTCs應(yīng)用最為廣泛的領(lǐng)域之一。研究指出，CTCs可以被作為腫瘤治療領(lǐng)域的獨立預(yù)后指標(biāo)。目前關(guān)于CTCs檢測技術(shù)對腫瘤患者進(jìn)行預(yù)后評估的報道[21,22]較為多見，但在腎癌領(lǐng)域仍缺乏相關(guān)報道。Gilbert等[23]應(yīng)用RT-PCR技術(shù)對41例進(jìn)行腎臟切除術(shù)前的患者外周血CTCs標(biāo)記物CAIX mRNA表達(dá)情況進(jìn)行檢測，檢出率為31.7%，隨訪調(diào)查發(fā)現(xiàn)，CAIX mRNA陽性的腎癌患者相較于陰性患者表現(xiàn)出了更低的5年無病生存率。Shimazui等[24]使用RT-PCR法檢測了55例腎癌患者的外周血CTCs標(biāo)記物CDH6 mRNA表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)在CDH6 mRNA陽性的腎癌患者中，33.33%出現(xiàn)了疾病復(fù)發(fā)，而陰性患者的復(fù)發(fā)率僅為7.14%，陰性患者表現(xiàn)出了更長的無復(fù)發(fā)存活時間。Bluemke等[12]對154例腎癌患者通過免疫磁珠分選法分別篩選出CD45陰性和CK陽性的細(xì)胞，隨訪發(fā)現(xiàn)CK陽性的CTC檢出率與患者的預(yù)后情況存在正相關(guān)性，CK陽性的CTCs是腎癌患者預(yù)后的獨立影響因素。結(jié)合之前所論述的關(guān)于CTCs檢測在判斷患者病理分期中的應(yīng)用價值，CTCs的檢出情況可以作為判斷腎癌患者預(yù)后的輔助信息，比傳統(tǒng)的影像學(xué)檢查更加快速、及時的評估患者預(yù)后。

3.3 CTCs與個性化治療的指導(dǎo) 在乳腺癌和非小細(xì)胞肺癌等腫瘤中，CTCs被廣泛應(yīng)用于指導(dǎo)個體化治療[25,26]。由于CTCs來自腫瘤組織，因此可以較為完整地反映機(jī)體腫瘤的形態(tài)學(xué)和遺傳學(xué)特征，包括其分化程度及組織學(xué)亞型等。相較于傳統(tǒng)的穿刺取樣，對外周血CTCs的分離和檢測可以在無創(chuàng)的情況下實現(xiàn)對患者腫瘤細(xì)胞的分析。除此之外，由于CTCs可以來自原發(fā)灶和繼發(fā)灶，因此CTCs檢測可以更全面反映患者體內(nèi)腫瘤的生物學(xué)特性，可以用于協(xié)助對患者制定更為全面的治療方案[27]。

CTCs檢測水平的改變亦可以反映腫瘤對不同治療措施的敏感程度。陳業(yè)剛等[28]研究發(fā)現(xiàn)，一部分被判斷為早期分期的腎癌患者在進(jìn)行腎切除術(shù)后仍然出現(xiàn)了遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，而這部分患者的術(shù)前CTCs水平一般明顯高于未出現(xiàn)轉(zhuǎn)移的患者，且其CTCs水平在經(jīng)過抗血管生成的靶向治療后會出現(xiàn)明顯下降，由此認(rèn)為早期腎癌患者中較高的CTCs水平可以作為是否需要在術(shù)前進(jìn)行抗血管生成靶向治療的選擇標(biāo)準(zhǔn)。

綜上所述，近年來CTCs檢測在腎癌的檢測和治療領(lǐng)域取得了一系列進(jìn)步。CTCs檢測技術(shù)在腎癌患者的分期評估、預(yù)后判斷以及個性化治療指導(dǎo)等領(lǐng)域表現(xiàn)出了較強(qiáng)的指導(dǎo)作用，提供了一種特異性強(qiáng)、檢出率高的CTCs檢測方法。

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10.3969/j.issn.1002-266X.2017.46.033

R737.11

A

1002-266X(2017)46-0103-04

山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥衛(wèi)生科技創(chuàng)新工程。

夏梅(E-mail： 1005790425@qq.com)

2017-08-07)