金曉君

（建湖縣近湖街道畜牧獸醫(yī)站，江蘇建湖 224730）

副豬嗜血桿菌病診斷方法研究進(jìn)展

金曉君

（建湖縣近湖街道畜牧獸醫(yī)站，江蘇建湖 224730）

副豬嗜血桿菌病快速敏感的檢測(cè)技術(shù)不僅對(duì)于及時(shí)采取措施防控疫情蔓延等至關(guān)重要，還能及早發(fā)現(xiàn)新菌株，找出最危險(xiǎn)的病原菌并開發(fā)相關(guān)疫苗，在防控疫情時(shí)掌握主動(dòng)。用于診斷副豬嗜血桿菌病的方法有很多，其中有適合臨床大批量血清檢測(cè)的ELISA方法，ELISA具有操作步驟簡(jiǎn)單、敏感性高和特異性好等很多優(yōu)點(diǎn)。

副豬嗜血桿菌病；診斷方法；研究進(jìn)展

對(duì)于副豬嗜血桿菌病的診斷在很大程度上仍依賴于病原的分離與培養(yǎng)，這對(duì)于發(fā)現(xiàn)病情和及時(shí)診斷帶來(lái)一定的困難。副豬嗜血桿菌的不同菌株可在一個(gè)豬場(chǎng)內(nèi)流行和傳播，從同一只豬身上，甚至在同一臟器內(nèi)，可以分離出多株副豬嗜血桿菌。因此，臨床診斷時(shí)無(wú)法鑒定出是哪一株副豬嗜血桿菌分離株是致病菌株。

1 病原學(xué)檢測(cè)

根據(jù)臨床癥狀、剖檢病變進(jìn)行細(xì)菌分離鑒定是副豬嗜血桿菌病的經(jīng)典診斷方法。然而該菌培養(yǎng)條件苛刻，生長(zhǎng)過程需要額外的NAD（煙酰胺腺嘌呤二核苷酸），且很難從患病動(dòng)物中分離到HPS，尤其是經(jīng)抗生素治療后，其分離更加復(fù)雜。

2 流行病學(xué)及臨床癥狀

副豬嗜血桿菌只感染豬，主要存在于豬的上呼吸道（鼻腔、扁桃體和氣管前段等）內(nèi)，通過豬群間的接觸和空氣飛沫及污染物傳播。臨床上主要感染2～4月齡的豬，特別是5～8周齡的小豬，感染高峰見于保育期的4～6周齡。主要臨床癥狀表現(xiàn)為咳嗽、呼吸困難、消瘦、跛行。主要剖檢病變表現(xiàn)為纖維素性胸膜炎、心包炎、腹膜炎、多關(guān)節(jié)炎和腦膜炎，心包積水，腹膜積水等。母源抗體和天然免疫對(duì)抵抗HPS感染很重要，在敏感豬群內(nèi)，HPS引起的死亡主要發(fā)生在幼豬，有些豬群在斷奶后1周就開始發(fā)病，這表明仔豬缺乏母源抗體保護(hù)力。當(dāng)繁殖和呼吸綜合癥病毒（PRRSV）、圓環(huán)病毒2型（PCV-2）、偽狂犬病毒（PRV）、豬流感病毒（SIV）感染后，幾乎總是伴隨著副豬嗜血桿菌感染，這已成為仔豬保育期死亡主要原因。近年來(lái)，還有從細(xì)菌性肺炎、化膿性支氣管炎病變中分離到副豬嗜血桿菌，通常將此菌看作是繼發(fā)性病原菌。根據(jù)病程的經(jīng)過，大致可分為最急性型、急性型、亞急性型、慢性型和隱性型5種類型，但所有這些類型可隨條件的變動(dòng)而互相轉(zhuǎn)變，不能截然區(qū)分。最急性型：可表現(xiàn)為無(wú)癥狀突然死亡。

3 病理變化

剖檢病死豬，可見胸腔出現(xiàn)纖維素性胸膜炎，腔內(nèi)存在大量的淡紅色液體及纖維素性滲出物凝塊；腹腔內(nèi)有多量透明黃褐色滲出液，有的呈膠胨狀凝塊。心包炎，心包積液，心包內(nèi)有奶酪樣或豆腐渣樣滲出物，使外膜與心臟粘連在一起，形成“絨化心”；心肌有時(shí)有出血點(diǎn)。全身淋巴結(jié)腫大，呈暗紅色，切面呈大理石樣花紋；關(guān)節(jié)腫大，關(guān)節(jié)腔內(nèi)有漿液性滲出性炎癥，有不等量的黃色或淡紅色液體，有的呈膠凍樣。肺臟呈纖維素性胸膜肺炎，肺呈暗紫紅色，臌脹，有纖維素性滲出物覆蓋在肺表面，有的肺與胸腔的側(cè)壁粘在一起；支氣管內(nèi)有黃白色或淡紅色泡沫樣滲出物；肺間質(zhì)灰白色到血樣，膠凍樣水腫是本病主要特征性病理變化之一。脾臟腫大，呈暗紅色。肝臟腫大，表面有灰白色小壞死灶。腎臟腫大有少量出血點(diǎn)，腎盂有淤泥狀物沉積。關(guān)節(jié)囊內(nèi)有黏膿性紅色滲出物，關(guān)節(jié)囊壁充血、出血、水腫。

4 毒力因子及診斷方法研究進(jìn)展

副豬嗜血桿菌的毒力因子十分復(fù)雜，各毒力因子的作用機(jī)理及毒力因子之間的相互聯(lián)系至今未被發(fā)現(xiàn)。近年來(lái)，人們作出許多嘗試去鑒定Hps的毒力因子或毒力標(biāo)記，已經(jīng)提出有關(guān)Hps許多毒力因子的推測(cè)，包含細(xì)菌的菌毛，外膜蛋白，莢膜，脂多糖，神經(jīng)氨酸酶，轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)合蛋白，hhdA和hhdB基因等。探索副豬嗜血桿菌致病性相關(guān)的毒力因子已經(jīng)成為研究的熱點(diǎn)和重點(diǎn)。在副豬嗜血桿菌毒力因子中，外膜蛋白是目前研究最多且成果顯著的一個(gè)。Mcvicker等在副豬嗜血桿菌中發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)與流感嗜血桿菌具有同源性的外膜蛋白P2和P5，該蛋白與細(xì)菌黏附有關(guān)，在毒力株和非毒力株中P2蛋白的大小有所不同，在毒力株中為48ku，在非毒力株中為55ku，可通過此項(xiàng)區(qū)分毒力株和非毒力株。目前，HPS實(shí)驗(yàn)室診斷應(yīng)用最廣泛的是PCR方法，其具有敏感性高、特異性好、穩(wěn)定性強(qiáng)和快速的優(yōu)點(diǎn)，可用于Hps感染的早期診斷和流行病學(xué)調(diào)查。劉建奎等針對(duì)HPS16SrRNA序列設(shè)計(jì)一段特異性引物，建立了快速準(zhǔn)確鑒定HPS的PCR診斷方法。用于副豬嗜血桿菌血清學(xué)診斷方法ELISA檢測(cè)方法具有操作簡(jiǎn)單、時(shí)間短、敏感性高，可用于大批量的抗原或抗體樣品檢測(cè)。王艷利用全菌作為包被抗原建立HPS抗體間接ELISA方法，具有較好的實(shí)驗(yàn)效果，石碧等提取HPS細(xì)菌莢膜多糖（CPS）作為抗原建立ELISA，具有很好的特異性。陳善真等利用表達(dá)純化的外膜蛋白（P5）建立HPS抗體間接ELISA方法。賈愛卿、李鵬、李淼都利用表達(dá)純化的HPSompP2蛋白作為抗原建立HPS間接ELISA方法。

4.1 病原學(xué)方法

一般認(rèn)為，病原菌的分離鑒定是檢測(cè)HPS的基本但較繁瑣的方法。臨床上從患病動(dòng)物的培養(yǎng)物中很難分離到該病原菌，特別是經(jīng)過抗生素治療的患病動(dòng)物，使得HPS更難分離和培養(yǎng)；加上HPS的菌落偏小，及復(fù)雜的生化試驗(yàn)鑒定等。所以，臨床上HPS的分離、培養(yǎng)和鑒定的方法并不作為常規(guī)的診斷檢測(cè)方法。目前，臨床上使用免疫組化技術(shù)（IHC）從試驗(yàn)感染的臨床病料可以分離鑒定HPS，但是采用此方法檢測(cè)的多抗與淀粉樣前體蛋白（APP）存在交叉反應(yīng)，所以IHC技術(shù)臨床意義上存在一定的局限性。

4.2 血清學(xué)方法

血清學(xué)方法因其特異性、快速和靈敏得到了廣泛的應(yīng)用。國(guó)內(nèi)外已經(jīng)建立起來(lái)的血清學(xué)方法主要包括間接血凝試驗(yàn)、瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)、乳膠凝集試驗(yàn)等，其中補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)可以檢測(cè)HPS抗體滴度，存在一定的交叉反應(yīng)；瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)是比較有效的方法之一，缺點(diǎn)是檢測(cè)時(shí)間偏長(zhǎng)。

4.3 分子生物學(xué)方法

隨著生命科學(xué)的快速進(jìn)展，在科研領(lǐng)域中，鑒于血清學(xué)方法存在波動(dòng)性、不準(zhǔn)確和不一致性，病原菌的檢測(cè)中引入了新的分子生物學(xué)方法。目前，應(yīng)用于HPS檢測(cè)的分子生物學(xué)方法主要是針對(duì)DNA分子水平的檢測(cè)，包括實(shí)時(shí)熒光定量PCR、常規(guī)PCR、原位雜交等檢測(cè)方法，以及RFLP-PCR、REF、ERIC-PCR等新型的分子生物學(xué)方法可以鑒定不同血清型的病原菌。

5 診斷中的一些注意問題

由于HPS營(yíng)養(yǎng)要求復(fù)雜，分離較為困難，需要在典型新鮮病料上采集、適宜的培養(yǎng)條件才能夠提高其臨床分離率，因此，在病料采集時(shí)，要選取臨床癥狀典型且最好未經(jīng)抗生素治療的病豬，要盡快采取多個(gè)新鮮組織樣品。同時(shí)應(yīng)注意，僅從鼻腔、扁桃體或氣管等組織臟器中分離細(xì)菌，是不能夠確診HPS，因?yàn)镠PS是上呼吸道的共棲菌，應(yīng)從內(nèi)臟如心肺組織，心包液、胸膜積液，關(guān)節(jié)液、心血、腦脊液等處進(jìn)行病原分離。

6 結(jié)語(yǔ)

副豬嗜血桿菌病在病毒性疫病感染后繼發(fā)感染或與其他疫病混合感染，使豬群的病情復(fù)雜化，病死率增加，給全世界養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大經(jīng)濟(jì)損失。本病沒有很好的治療措施，只能以預(yù)防為主，采取綜合措施加以防控。迄今為止，已對(duì)HPS進(jìn)行了一系列的研究探索，取得了許多顯著的成就，同時(shí)也存在很多難題，相當(dāng)一部分的臨床分離株并不難具體的血清型定型，HPS的感染分子機(jī)制并不清楚，以及一些常規(guī)的檢測(cè)HPS的方法也存在一定的局限和困難。這些難題都需要科研工作者深入研究，以便更加了解HPS和尋找到更好的診斷治療方法。

[1]陳善真.副豬嗜血桿菌OMP5基因的克隆表達(dá)及間接ELISA檢測(cè)方法的建立[D].華南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2010.

[2]谷禹.天津地區(qū)副豬嗜血桿菌病的流行病學(xué)調(diào)查及其防治措施的制定[D].吉林大學(xué)，2016.

[3]張巖.石河子墾區(qū)副豬嗜血桿菌病的流行病學(xué)調(diào)查研究[D].石河子大學(xué)，2013.