吳 斌 趙 娜 張 琳 肇慧君

（遼寧出入境檢驗檢疫局，遼寧大連 116000）

鯉春病毒RT-PCR檢測方法的建立與應(yīng)用

吳 斌 趙 娜 張 琳 肇慧君

（遼寧出入境檢驗檢疫局，遼寧大連 116000）

本文根據(jù)鯉春病毒糖蛋白設(shè)計并合成引物，對SVCV進(jìn)行擴增鑒定，對所建立的RT-PCR方法進(jìn)行靈敏度和特異性實驗，實驗結(jié)果表明，只有SVCV能夠擴增出特異性片段，大小為714bp，對照組核酸均沒有擴增，表明所設(shè)計的引物具有良好的特異性，方法的靈敏度為10-5。利用建立的方法對人工感染SVCV的鯉魚進(jìn)行檢測，實驗結(jié)果表明，2個感染樣品中均檢出SVCV病毒。本實驗建立的RT-PCR為SVCV檢測診斷提供了新的技術(shù)手段。

鯉春病毒（SVCV）；RT-PCR；特異性；靈敏度；人工感染

鯉春病毒血癥（Spring viraemia of carp，SVC）是一種由鯉春病毒（SVCV）引起的急性出血并伴有高度傳染的流行病，對漁業(yè)生產(chǎn)將帶來極大危害甚至是毀滅性的風(fēng)險。鯉科是SVCV最容易感染的魚類，一般在鯉、錦鯉、草魚、鰱、鳙、鯽等魚中都能夠產(chǎn)生明顯的病癥，但鯉是這幾種魚中最敏感的宿主，SVC發(fā)病的特征為腹部漲水、魚體滲血、發(fā)病急并且死亡率很高，通常在春季暴發(fā)并引起急性死亡。SVC最早流行于歐洲、中東和俄羅斯，2008年，我國將鯉春病毒血癥列為一類動物疫病并添加在新頒布的動物疫病名錄中[1]。本文建立了SVCV的RT-PCR檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒

實驗室保存的凍存毒株，經(jīng)細(xì)胞系FHM增殖得到SVCV，用于特異性分析的傳染性胰腺壞死病毒（IPNV）、傳染性造血器官壞死病毒（IHNV）、病毒性出血敗血癥病毒（VHSV）均為實驗室保存。

1.1.2 儀器和試劑

（1）儀器

RT-PCR儀：美國ABI公司生產(chǎn)的9700PCR儀。

電泳儀：美國Bio-rad生產(chǎn)的A101439。

（2）試劑

PrimeScript?OneStepRT-PCRKitVer.2（DyePlus）、TaKaRaMiniBESTViralRNA/DNAExtractionKitVer.5.0購自寶生物公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計

根據(jù)SVCV糖蛋白基因設(shè)計引物并由寶生物（大連）有限公司合成（表1）。

表1 SVCV RT-PCR引物

1.2.2 一步法RT-PCR

反應(yīng)總體系為50μl，分別為2×One-Step Buffer25μL，PrimeScript 1 Step Enzyme Mix2μL，RT-PCR Forward Primer（10uM）1μl，RT-PCR Reverse Primer（10uM）1μL，DEPC處理的滅菌雙蒸15μl，將 5μL的RNA加入到體系中，充分混勻，簡單離心，置于PCR儀中。反應(yīng)條件為：50℃逆轉(zhuǎn)錄30min，min，95℃預(yù)變性2 min，95℃ 1min、55℃ 1min、72℃ 1min s，35個循環(huán)，最后 72℃ 延伸10min，4℃保存。PCR 產(chǎn)物用 1.5 %的瓊脂糖凝膠電泳（90V，15min）進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 病毒擴增鑒定結(jié)果

在病毒提取完畢后，對所提取的RNA進(jìn)行RT-PCR擴增，其擴增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，標(biāo)準(zhǔn)條帶為Marker 2000，其電泳圖片如下。結(jié)果表明，SVCV具有清晰明顯的條帶，大小為714bp。

圖1 SVCV擴增RT-PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果

2.2 特異性實驗結(jié)果

根據(jù)合成的兩條引物對VHSV、SVCV、IPNV、IHNV進(jìn)行特異性擴增實驗，結(jié)果如圖2，只有SVCV出現(xiàn)清晰明顯的條帶，大小為714bp，其他三種核酸沒有特異性條帶出現(xiàn)。

圖2 特異性實驗PCR電泳圖

2.3 敏感性實驗結(jié)果

將已測定病毒的SVCV進(jìn)行10倍稀釋，按照1.2.3進(jìn)行RNA提取，以10 倍系列稀釋RNA10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、陽性對照為模板，進(jìn)行RT-PCR 敏感性檢測，結(jié)果顯示該方法的最低可以檢測出10-5（圖3）

圖3 靈敏性實驗PCR電泳圖

2.4 對人工感染鯉魚鑒定結(jié)果

人工感染的草鯉魚，在注射的第四周末出現(xiàn)無目的漂游，與對照組相比較，沒有積極進(jìn)食表現(xiàn)。第五周后病魚體色深，腹部腫大（如圖4 A），皮膚有明顯出血現(xiàn)象（圖4B，C），出現(xiàn)感染鯉春病毒血癥的典型癥狀。

圖4 出現(xiàn)典型癥狀的實驗組魚和健康草鯉魚魚對比圖

人工感染的帶有典型病癥的鯉魚樣品RNA經(jīng)過RT-PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示。其中，經(jīng)人工感染SVCV的病魚樣品RNV通過RT-PCR得到的產(chǎn)物，經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳得到的結(jié)果如圖5，SVCV病魚樣品的到了與陽性質(zhì)粒與相同大小的片段714bp，說明鯉魚被成功感染鯉春病毒。

圖5 感染SVCV病魚樣品RT-PCR結(jié)果圖

3 結(jié)論

本文根據(jù)鯉春病毒糖蛋白設(shè)計并合成引物，對SVCV進(jìn)行擴增鑒定，對所建立的RT-PCR方法進(jìn)行靈敏度和特異性實驗，實驗結(jié)果表明，只有SVCV能夠擴增出特異性片段，大小為714bp，對照組核酸均沒有擴增，表明所設(shè)計的引物具有良好的特異性，方法的靈敏度為10-5。因為普通RT-PCR和套式PCR相結(jié)合的方法可以增強實驗靈敏度、增強檢測的敏感性、可靠性。利用建立的方法對人工感染SVCV的鯉魚進(jìn)行檢測，實驗結(jié)果表明，2個感染樣品中均檢出SVCV病毒。本實驗建立的RT-PCR為SVCV檢測診斷提供了新的技術(shù)手段。

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國家質(zhì)檢公益項目（201410059）

吳斌（1968—），女，遼寧大連人，博士研究生，研究員，主要從事水生動物疫病研究。