姜冰

摘要：本實(shí)驗(yàn)室前期從大連灣地區(qū)健康的仿刺參養(yǎng)殖池塘沉積物中分離出兩株芽孢桿菌即B6和B7。首先，通過(guò)分析二者的生長(zhǎng)特性發(fā)現(xiàn)，B6和B7的最適生長(zhǎng)溫度為15～35 ℃；最適pH范圍為6～8；最適鹽度為3%～5%。 菌株產(chǎn)酶特性檢測(cè)結(jié)果表明，B6和B7均可產(chǎn)生淀粉酶和蛋白酶， B7產(chǎn)脂肪酶。將兩種菌懸液投喂仿刺參后發(fā)現(xiàn)，B6和B7可有效提高仿刺參腸道內(nèi)的消化酶活性以及體腔液中多種非特異性免疫酶活性。本研究結(jié)果表明：B6和B7可作為益生菌劑的基礎(chǔ)菌株添加至仿刺參生長(zhǎng)環(huán)境中，并且對(duì)仿刺參的消化及免疫功能具有正向刺激作用。

關(guān)鍵詞：芽孢桿菌；仿刺參；消化酶；非特異性免疫酶活性

仿刺參（Apostichopus japonicus）營(yíng)養(yǎng)豐富，具有較高的藥用及食用價(jià)值，是目前我國(guó)遼寧沿海養(yǎng)殖范圍最廣的經(jīng)濟(jì)品種之一[1-2]。近年來(lái)，養(yǎng)殖規(guī)模逐漸擴(kuò)張，養(yǎng)殖密度過(guò)高，仿刺參相關(guān)病害問(wèn)題日趨凸顯，極大制約了其養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的持續(xù)、健康、穩(wěn)定的發(fā)展[3]。近年來(lái)，益生菌在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用越來(lái)越多。益生菌的應(yīng)用抑制病原，激活免疫，從而減少疾病的發(fā)生；益生菌可以作為補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)成分，促進(jìn)生長(zhǎng)。在水產(chǎn)養(yǎng)殖中推廣使用益生菌，有利于保障遼寧水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的健康持續(xù)發(fā)展[4]。

芽孢桿菌，是具有芽孢的好氧革蘭氏陽(yáng)性菌，具有耐酸、耐鹽、耐高溫和可分泌多種能降解有機(jī)物的酶類（蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶）等特點(diǎn)，有助動(dòng)物對(duì)飼料的消化，增強(qiáng)動(dòng)物的免疫力，因此現(xiàn)今常將其作為一種益生菌劑添加至動(dòng)物飼料以及養(yǎng)殖環(huán)境中[5-6]。Kozasa等[7]將從土壤中分離的芽孢桿菌投喂鰻鱺，發(fā)現(xiàn)該菌可有效提高鰻鱺對(duì)弧菌的抵抗能力，增強(qiáng)其抗病性；除此之外，袁豐華等[8]在尖吻鱸飼料中添加不同量的凝結(jié)芽孢桿菌，發(fā)現(xiàn)該菌對(duì)尖吻鱸的生長(zhǎng)有一定的促進(jìn)作用，并可以影響其肝蛋白酶和胃淀粉酶的活性。目前應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域中的益生芽孢桿菌有枯草芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌等，且在魚(yú)蝦養(yǎng)殖中的應(yīng)用較為常見(jiàn)，在仿刺參養(yǎng)殖過(guò)程中卻少有報(bào)道，更多研究亟待深入[9]。本實(shí)驗(yàn)室前期自大連地區(qū)健康仿刺參養(yǎng)殖池塘底泥中篩選并鑒定到兩株芽孢桿菌，分別命名為B6和B7，通過(guò)分析二者的生長(zhǎng)特性，產(chǎn)酶特性以及對(duì)仿刺參消化酶和非特異性免疫酶活性的影響，探討二者作為仿刺參益生菌種資源的可行性，為芽孢桿菌在仿刺參養(yǎng)殖過(guò)程中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1菌種本研究中使用的芽孢桿菌株B6和B7，來(lái)自遼寧省海洋水產(chǎn)科學(xué)研究院菌種保藏室，從大連灣地區(qū)的健康仿刺參養(yǎng)殖池塘底泥中分離得到。

1.1.2培養(yǎng)基

2216E固體以及液體培養(yǎng)基：采購(gòu)于青島海博生物科技有限公司；

LB培養(yǎng)基：酵母粉 5 g，蛋白胨 10 g，氯化鈉 10 g，NaOH調(diào)pH至7.0，121 ℃、20 min高壓滅菌。

淀粉瓊脂培養(yǎng)基（W/L）：酵母粉5 g，蛋白胨10 g，淀粉5 g，瓊脂15 g，NaCl 10 g，1 000 mL純凈水，于121 ℃滅菌20 min后，均勻倒入平板中備用。

脫脂牛奶培養(yǎng)基（W/L）：蛋白胨10 g，NaCl 10 g，脫脂奶粉 5 g，酵母粉5 g，瓊脂15 g，1 000 mL蒸餾水，于121 ℃滅菌20 min后，均勻倒入平板中備用。

羅丹明B橄欖油瓊脂培養(yǎng)基（W/L）：蛋白胨10 g，酵母粉5 g，瓊脂15 g，NaCl 10 g，1 000 mL蒸餾水，121 ℃滅菌20 min，向滅菌后培養(yǎng)基中加入31.25 mL橄欖油和10 mL羅丹明B溶液（ 1 g /L），經(jīng)磁力攪拌器劇烈攪拌后，靜置幾分鐘，均勻倒入平板中備用。

1.1.3實(shí)驗(yàn)儀器酶標(biāo)儀，潔凈工作臺(tái)，恒溫培養(yǎng)箱，恒溫培養(yǎng)搖床，熒光顯微鏡，離心機(jī)。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1菌株的生長(zhǎng)特性分析將B6和B7菌株進(jìn)行活化后，分別按照5%的接種量轉(zhuǎn)接至100 mL的LB培養(yǎng)基中，不同溫度、鹽度和pH條件下對(duì)其進(jìn)行震蕩培養(yǎng)，每隔三小時(shí)取一次樣，利用分光光度計(jì)測(cè)定菌液在660 nm處的吸光度值，并繪制菌株的生長(zhǎng)曲線。實(shí)驗(yàn)溫度設(shè)定為15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃和35 ℃五個(gè)梯度，鹽度設(shè)定為30‰、50‰、75‰、100‰和125‰五個(gè)梯度，pH設(shè)定為6、6.5、7、8和9五個(gè)梯度。

1.2.2菌株的產(chǎn)酶特性分析通過(guò)盧革氏碘液法測(cè)定考察菌株產(chǎn)淀粉酶特性；通過(guò)脫脂牛奶法考察菌株的產(chǎn)蛋白酶特性；通過(guò)羅丹明B橄欖油法考察菌株產(chǎn)脂肪酶特性[10]。

1.2.3實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與管理試驗(yàn)于遼寧省海洋水產(chǎn)科學(xué)研究院苗室進(jìn)行。選取規(guī)格相近（約13 g）、生長(zhǎng)環(huán)境相似的健康仿刺參，在實(shí)驗(yàn)室暫養(yǎng)一周后，分別飼養(yǎng)于裝有50 L水體的藍(lán)色水槽中，每個(gè)水槽中10頭， 4個(gè)水槽為一組，其中一組加入芽孢桿菌B6，一組加入芽孢桿菌B7，另外一組作空白對(duì)照。試驗(yàn)階段水溫為15±1 ℃，期間連續(xù)充氣。試驗(yàn)組，按仿刺參體質(zhì)量的5%投餌并投入終密度為108 cfu/L的菌懸液；對(duì)照組只投餌不投喂菌液，每組2個(gè)重復(fù)。實(shí)驗(yàn)時(shí)間設(shè)定為28 d。每7 d取樣一次，從實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組中隨機(jī)抽取5頭仿刺參，充分消毒后，解剖并取其體腔液上清和腸道，置于-80 ℃冷凍保藏待測(cè)。

1.2.4仿刺參腸道消化酶的測(cè)定選取仿刺參腸道脂肪酶、淀粉酶以及蛋白酶作為消化酶的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。將仿刺參腸道樣品從-80 ℃ 冰箱中取出，于冰上解凍。稱取相同重量腸道樣品置于手動(dòng)勻漿器中，加入9 倍體積的0.9%氯化鈉溶液，冰浴勻漿。勻漿后的樣品液置于離心管中，4 000 r /min，離心10 min，取上清液待測(cè)。

采用南京建成生物工程研究所試劑盒檢測(cè)仿刺參腸道蛋白酶、脂肪酶以及淀粉酶活性，具體測(cè)定方法參照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)。

1.2.5仿刺參非特異性免疫酶活性測(cè)定仿刺參的非特異性免疫酶選取4個(gè)指標(biāo)作為評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，包括：總超氧化物歧化酶活性（T-SOD）、堿性磷酸酶（AKP）、酸性磷酸酶（ACP）、酚氧化酶活性（PO）的活性。

采用南京建成生物工程研究所試劑盒檢測(cè)仿刺參體腔總超氧化物歧化酶活性（T-SOD）、酸性磷酸酶（ACP）、堿性磷酸酶（AKP）活性，具體測(cè)定方法參照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)。其中酚氧化酶的檢測(cè)采用多巴絡(luò)合物生成法[11]。

2實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1菌株生長(zhǎng)特性

菌株的生長(zhǎng)隨溫度、鹽度、pH變化曲線如圖1所示。由圖1可知，菌株B6和B7在15～35 ℃范圍內(nèi)均可生長(zhǎng)，且長(zhǎng)勢(shì)良好；二者生長(zhǎng)所需的最適pH范圍較為寬泛，菌株B6在pH為6.0～9.0范圍內(nèi)生長(zhǎng)較快，于6 h后進(jìn)入指數(shù)增長(zhǎng)期，18 h后進(jìn)入穩(wěn)定期；菌株B7在pH為6.0～8.0范圍內(nèi)生長(zhǎng)較快，而在pH為9時(shí)生長(zhǎng)相對(duì)緩慢，于24 h時(shí)才進(jìn)入指數(shù)增長(zhǎng)期，由此得出，二者生長(zhǎng)最適pH范圍為6.0～8.0；除此之外，菌株B6在鹽度為30‰～50‰時(shí)生長(zhǎng)較快，在12 h后進(jìn)入指數(shù)增長(zhǎng)期，而菌株B7在鹽度為30‰～75‰范圍內(nèi)生長(zhǎng)較快，于6 h后便進(jìn)入指數(shù)增長(zhǎng)期。

2.2菌株的產(chǎn)酶特性

將芽孢桿菌株B6、B7點(diǎn)種于不同的產(chǎn)酶特征瓊脂平皿，培養(yǎng)48 h后觀察結(jié)果。結(jié)果顯示：在淀粉瓊脂培養(yǎng)基上，加入盧革氏碘液后，B6、B7菌落周?chē)兩?，說(shuō)明兩菌株均可產(chǎn)淀粉酶；在脫脂奶粉瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)后，兩株菌株的周?chē)a(chǎn)生透明水圈，說(shuō)明二菌株都可產(chǎn)蛋白酶；但在羅丹明B瓊脂培養(yǎng)基上在紫外線照射下，B7菌株周?chē)吹匠壬馊?，說(shuō)明該菌株自身可產(chǎn)生脂肪酶，而在B6菌株周?chē)窗l(fā)現(xiàn)橙黃色熒光圈，說(shuō)明B6菌株未產(chǎn)生脂肪酶。

2.3菌株對(duì)仿刺參腸道消化酶的影響

如圖3所示，菌株B6和B7可以有效提高仿刺參體內(nèi)多種消化酶的活性，其中B6和B7菌株對(duì)仿刺參體腸道內(nèi)脂肪酶的活性影響較大，而對(duì)淀粉酶的并沒(méi)有顯著的刺激作用，而B(niǎo)6菌株對(duì)蛋白酶的作用效果優(yōu)于B7菌株，由此初步推斷，益生菌株對(duì)仿刺參體內(nèi)酶活的影響可能具有相對(duì)特異性。

2.4菌株對(duì)仿刺參體腔非特異性免疫酶的影響

如圖4所示，菌株B6和B7對(duì)仿刺參體腔液中的ACP、AKP、T-SOD和PO的活性均有顯著性的影響，尤其是兩種處理樣品中ACP的活性明顯高于對(duì)照組。而菌株B7對(duì)AKP、T-SOD以及PO的影響均較B6菌株顯著。從圖中可以看出菌株的投喂對(duì)仿刺參的免疫刺激作用均有正向刺激，且B7菌株作用效果優(yōu)于B6。

3討論

微生物生長(zhǎng)需要在特定的溫度、鹽度和pH范圍內(nèi)，因而明確菌株的生長(zhǎng)特性也是菌株應(yīng)用的前提和基礎(chǔ)。仿刺參作為一種重要的養(yǎng)殖品種，其生長(zhǎng)最適溫度往往不得高于23 ℃，最適鹽度為3%，最適pH范圍為7.9～8.4，在此范圍內(nèi)仿刺參長(zhǎng)勢(shì)良好。據(jù)此，在篩選對(duì)刺參具有益生作用的菌株時(shí)，首先應(yīng)選用生長(zhǎng)條件與仿刺參接近的益生菌。通過(guò)分析B6和B7的生長(zhǎng)特性發(fā)現(xiàn)，二者生長(zhǎng)所需的條件較為寬泛，最適溫度為15～35 ℃，最適pH范圍為6～8，最適鹽度為3%～5%，因此兩株菌株可以作為候選益生菌，進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

芽孢桿菌作為水生益生菌劑中常用的菌種，在其發(fā)酵過(guò)程中可產(chǎn)生許多胞外酶如蛋白酶和淀粉酶等[12-13]，因而當(dāng)把該菌株添加至飼料中可有效提高動(dòng)物的生產(chǎn)性能。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：B6和B7均可以產(chǎn)蛋白酶和淀粉酶，且B7自身可產(chǎn)生脂肪酶，因此兩株菌株具有潛在的益生作用。除此之外，將B6和B7菌株添加至仿刺參飼料中發(fā)現(xiàn)，二者可提高仿刺參腸道內(nèi)蛋白酶和脂肪酶的活性，然而對(duì)于淀粉酶的活性并沒(méi)有顯著影響，尤其是B7菌株雖自身可產(chǎn)生淀粉酶，卻未能有效增強(qiáng)仿刺參體內(nèi)該酶的活性。因此，關(guān)于B6和B7菌株對(duì)于仿刺參腸道內(nèi)消化酶的影響機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。

除了消化酶之外，本研究發(fā)現(xiàn)兩種芽孢桿菌可以提高刺參體腔液中的多種免疫酶活性。酸性磷酸酶（ACP）是巨噬細(xì)胞內(nèi)溶酶體標(biāo)志酶，是溶酶體的重要組成部分，主要參與吞噬水解機(jī)體內(nèi)的異物[14]；堿性磷酸酶（AKP）是生物體內(nèi)的一種重要的調(diào)控酶，在堿性環(huán)境下可催化磷酸單酯水解，參與蛋白質(zhì)的合成等，也是溶酶體酶的重要組成部分[15-16]；總超氧化物歧化酶（T-SOD）能夠有效清除機(jī)體代謝過(guò)程所產(chǎn)生的超氧根陰離子，與生物的免疫水平密切相關(guān)，其活性變化可以作為反映某些海洋生物的機(jī)能健康狀況及衡量其免疫狀態(tài)的指標(biāo)[17]；酚氧化酶（PO）是無(wú)脊椎動(dòng)物的免疫防御中的重要免疫酶，它往往以無(wú)活性的免疫酶原形式存在，可將酚催化形成黑色素，而黑色素及中間產(chǎn)物具有抗微生物的活性，所以酚氧化酶對(duì)于維持動(dòng)物體液的無(wú)菌性十分重要[18]。綜上可見(jiàn)，上述幾種酶均可以作為評(píng)價(jià)動(dòng)物免疫能力的重要指標(biāo)。本研究結(jié)果表明，菌株B6和B7對(duì)仿刺參體腔液中的ACP、AKP、T-SOD和PO的活性均可產(chǎn)生正向的刺激作用，尤其是對(duì)ACP酶活性的影響最為顯著，該結(jié)論與近期許多研究結(jié)果相符合。朱學(xué)芝[19]等用枯草芽孢桿菌投喂凡納濱對(duì)蝦后，發(fā)現(xiàn)蝦血中的ACP和AKP的活性顯著升高；駱?biāo)囄腫20]用添加了0.1%的復(fù)合芽孢桿菌制劑的餌料投喂仿刺參后，發(fā)現(xiàn)仿刺參體腔液中的AKP、ACP、T-SOD和PO活性顯著高于對(duì)照組，以上結(jié)果均與本研究得出的結(jié)論相符合。綜上所述，將芽孢桿菌B6和B7作為益生菌劑的基礎(chǔ)菌株添加至刺參飼料中具有可行性，二者可在一定程度上提高刺參體內(nèi)的消化酶及免疫酶活性，更好地增強(qiáng)仿刺參的消化和抗病能力。

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