謝越　周成　涂從　張祖亮　汪建飛

摘要應(yīng)用近紅外光譜（NIRS）技術(shù)定量分析連作滁菊土壤樣品中阿魏酸的含量。通過標(biāo)準(zhǔn)杠桿值、學(xué)生殘差和馬氏距離判斷異常光譜， 經(jīng)二階導(dǎo)數(shù)和Norris平滑濾噪預(yù)處理后， 在6000～4000 cm

Symbolm@@ 1范圍， 最佳因子數(shù)為7， 采用偏最小二乘法（PLS）構(gòu)建數(shù)學(xué)模型。結(jié)果表明， 模型校正集和驗證集與高效液相色譜儀（HPLC）測定的參考值之間均呈現(xiàn)良好相關(guān)關(guān)系， 校正相關(guān)系數(shù)Rc為0.9914， 交叉驗證相關(guān)系數(shù)Rcv為0.9935， 校正集誤差均方根（RMSEC）為0.484， 預(yù)測誤差均方根（RMSEP）為0.539， 交叉驗證誤差均方根（RMSECV）為0.615。研究結(jié)果表明， NIRS分析技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)連作土壤中阿魏酸的快速檢測， 結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

關(guān)鍵詞近紅外光譜； 連作土壤； 滁菊； 酚酸； 阿魏酸

1引 言

滁菊（Chrysanthemum morifolium cv. ‘Chuju）是國家地理標(biāo)志產(chǎn)品，也是安徽省的特色植物資源。因其含有黃酮類、多糖、多酚類等物質(zhì)，具有良好的藥物和食補功能，被國家衛(wèi)生部批準(zhǔn)為藥食兩用食物[1]。滁菊的種植已有兩千多年的栽培歷史，但是近年來滁菊種植出現(xiàn)了連作障礙現(xiàn)象，已經(jīng)成為滁菊產(chǎn)業(yè)發(fā)展的制約瓶頸[2]。

研究發(fā)現(xiàn)，由滁菊根系分泌和殘體腐解產(chǎn)生的酚酸類物質(zhì)大量分布在連作土壤中，其產(chǎn)生的自毒作用是滁菊連作障礙問題的重要原因之一[3]。產(chǎn)生自毒作用的酚酸類物質(zhì)種類很多，其中阿魏酸是一種廣泛分布的酚酸，同樣也常見于其它中草藥連作種植土壤中[4～6]。阿魏酸在連作滁菊土壤中的含量相對較高，達(dá)到18.24 μg/g[3]，是所有檢測到的酚酸物質(zhì)中含量較高的一類，這使得阿魏酸成為滁菊酚酸類自毒物質(zhì)的標(biāo)志性物質(zhì)。因此，對于阿魏酸的快速檢測，成為以滁菊為代表的中草藥種植過程中提前預(yù)防連作障礙問題發(fā)生的關(guān)鍵技術(shù)。

目前，阿魏酸的檢測方法主要有高效液相色譜法[3]、反相高效液相色譜法[7]、流動注射化學(xué)發(fā)光法[8]等。這些方法通常存在前處理復(fù)雜、分析時間較長、樣品容易污染等缺點。阿魏酸穩(wěn)定性差， 容易分解， 使得上述檢測手段無法滿足實際生產(chǎn)過程的定量分析要求。

近紅外光譜（NIRS）技術(shù)是近年來快速發(fā)展的綠色、無損分析技術(shù)，具有無需樣品預(yù)處理、無二次化學(xué)污染、操作簡便、快速的特點[4，9]，已廣泛用于農(nóng)業(yè)[10～12]、煙草[13]、食品[1]、藥物[5]等行業(yè)的成分定量測定。目前，采用NIRS定量分析中草藥土壤中阿魏酸的文獻(xiàn)尚未見報道。本研究采用近紅外光譜分析技術(shù)，應(yīng)用偏最小二乘法構(gòu)建數(shù)學(xué)模型，預(yù)測連作滁菊土壤樣品中阿魏酸的含量， 為以滁菊為代表的中草藥連作障礙問題的早期發(fā)現(xiàn)與預(yù)防提供新技術(shù)。

2實驗部分

2.1儀器與試劑

Antaris Ⅱ傅里葉變換近紅外光譜儀（美國Thermo公司），配液體透射檢測器，采樣系統(tǒng)以及TQ Analyst處理軟件； Waters 6002487高效液相色譜儀（美國Waters公司）； MS204電子天平、FE30 pH計（梅特勒托利公司）； AB5150B超聲波清洗機（天津奧特賽恩斯儀器有限公司）； D101大孔樹脂（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）； 阿魏酸（分析純，Sigma公司）； 乙腈（色譜純，德國Fisher公司）； 其余試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。實驗用水為超純水（18.2 MΩ cm2）。

2.2實驗方法

2.2.1樣品的制備取連作5年滁菊土壤樣品，加入20倍量95%乙醇，加熱回流提取2 h，提取3次，冷卻，0.45 μm微孔濾膜過濾3次， 合并提取液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至無乙醇味，收集濃縮液，再加入3倍量45℃溫水，室溫靜置24 h，以4500 r/min離心20 min，上清液儲存于棕色瓶中，4℃冷藏備用。D101大孔樹脂先用95%乙醇浸泡過夜，用超純水反復(fù)沖洗直至無乙醇味； 再用4% NaOH浸泡6 h，用超純水沖洗至中性； 然后用4% HCl溶液浸泡過夜，用超純水沖洗至中性，裝柱（200 mm×50 mm）備用。 提取液用50%乙醇以20 mL/h的速度洗脫，洗脫過程中每隔一段時間收集大孔樹脂富集純化后的樣品，5根樹脂柱子平行操作，每根收集30個樣品， 共得到150個樣品。

2.2.2阿魏酸的測定阿魏酸的測定方法參考本課題組關(guān)于酚酸的分析方法[3]，略做調(diào)整。具體HPLC測定條件如下： Symmetry C18色譜柱（250 mm× 4.6 mm，5 μm），柱溫30℃，檢測波長280 nm； 流動相為0.01% H3PO4溶液（A）和乙腈（B），以冰醋酸調(diào)節(jié)至pH 2.8，梯度洗脫： 0～10 min，95% A； 10～25 min， 85% A； 25～35 min，60% A； 35～40 min，65% A； 40～45 min，95% A。流速1.0 mL/min； 進(jìn)樣量10 μL。

2.2.4光譜數(shù)據(jù)處理與數(shù)學(xué)模型的建立和驗證在剔除奇異樣本后，隨機取100份樣品組成校正集，剩余樣品作為驗證集，驗證集不參與模型構(gòu)建。在光譜預(yù)處理基礎(chǔ)上，運用偏最小二乘法，利用TQ Analyst （Thermo Nicolet Com， USA）軟件，進(jìn)行數(shù)據(jù)的分析，建立近紅外光譜多元校正模型。通過TQ Analyst軟件的分析功能剔除異常光譜，由預(yù)測殘差平方和（Predicted residual error sum of squares， PRESS）結(jié)果確定所需因子數(shù)。表征近紅外光譜定量模型建模效果的指標(biāo)，主要有校正相關(guān)系數(shù)Rc、交叉驗證相關(guān)系數(shù)Rcv， 交叉驗證誤差均方根（Root mean square error of crossvalidation， RMSECV）、校正集誤差均方根（Root mean square error of calibration， RMSEC）和預(yù)測誤差均方根（Root mean square error of validation， RMSEP），各參數(shù)計算公式如下：

3.2異常光譜的診斷

樣品譜圖采集過程中，由于設(shè)備本身的誤差、操作的失誤、波長的漂移及環(huán)境因素的變化，近紅外光譜譜圖可能出現(xiàn)異常，從而引起模型精度的降低[14]。對于異常樣品的診斷，一般采用馬氏距離、標(biāo)準(zhǔn)杠桿值和學(xué)生殘差判斷。圖2為150個樣品的馬氏距離分布圖。

從圖2可見，樣品馬氏距離平均值為1.18，閾值為1.31，有3個樣品超過閾值，其標(biāo)準(zhǔn)杠桿值和學(xué)生殘差均較高，視為異常樣品。

圖3為樣品標(biāo)準(zhǔn)杠桿值和學(xué)生殘差關(guān)系圖，除了超過馬氏距離閾值的3個樣品外，還有2個樣品點的標(biāo)準(zhǔn)杠桿值和學(xué)生殘差較為離群，這5個樣品的標(biāo)準(zhǔn)杠桿值和學(xué)生殘差都較高，所以建模前將這5個奇異樣品剔除。

3.3建模光譜波段的選擇

PLS法雖然可以全波段建立數(shù)學(xué)模型，但是如果建模波段選擇過寬，必然包含有過多冗余信息，不利于模型預(yù)測的精確度[17]。依據(jù)TQ Analyst軟件推薦的模型構(gòu)建波段范圍，以及樣品阿魏酸特征波段的相關(guān)關(guān)系，建立了不同波段范圍內(nèi)阿魏酸的PLS定量數(shù)學(xué)模型，結(jié)果見表1。

Rc值越接近1，模型越精確。RMSEC和RMSECV值越小，越可有效消除測試樣品之間差別造成的光譜基線漂移和偏移。 RMSEC和RMSEP值越小，且兩者數(shù)值接近，意味著模型更穩(wěn)定，預(yù)測性能更好[18]。從表1可知，在不同近紅外波段范圍內(nèi)，對模型參數(shù)的影響程度不同。通過比較，發(fā)現(xiàn)在6000～4000 cm范圍，主因子數(shù)為7，采用PLS法構(gòu)建數(shù)學(xué)模型，校正集和HPLC測定的參考值之間的相關(guān)關(guān)系見圖 5，驗證集與參考值之間的相關(guān)關(guān)系見圖6。校正集和驗證集與HPLC的參考值之間均呈現(xiàn)良好相關(guān)關(guān)系，校正相關(guān)系數(shù)Rc為0.9914，交叉驗證相關(guān)系數(shù)Rcv為0.9935，校正集誤差均方根RMSEC為0.484，預(yù)測誤差均方根RMSEP為0.539，交叉驗證誤差均方根RMSECV為0.615。

實驗結(jié)果表明，以PLS法建立的近紅外數(shù)學(xué)模型預(yù)測連作滁菊土壤中的阿魏酸含量，所得結(jié)果與HPLC的測定結(jié)果吻合程度好，準(zhǔn)確可靠。因此，NIRS分析技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)連作土壤中阿魏酸的快速準(zhǔn)確檢測。

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AbstractA near infrared spectroscopy （NIRS） method was used for rapid quality evaluation of ferulic acid content in chrysanthemum morifolium cv. （Chuju） continuous cropping soil. Standard leverage， studentized residual and Mahalanobis distance were calculated to eliminate abnormal samples. After the initial near infrared spectrum was treated by two second derivative and Norris smoothing filter noise， 6000-4000 cm 1 wave number range and 7 factors were chosen for partial least squares （PLS） calibration model. The results showed that good correlation was presented between the calibration set/validation set and the values determined by high performance liquid chromatography， and the calibration correlation coefficient （Rc） and validation correlation coefficient （Rcv） were 0.9914 and 0.9935， respectively. Root mean square error of calibration （RMSEC）， root mean square error of validation （RMSEP） and root mean square error of crossvalidation （RMSECV） were 0.484， 0.539 and 0.615， respectively. This method was accurate， reliable， simple， rapid and nondestructive， and could be applied to the fast analysis for ferulic acid in continuous cropping soil.

KeywordsNear infrared transmittance spectroscopy； Continuous cropping soil； Chrysanthemum morifolium cv. （Chuju）； Phenolic acids； Ferulic acid