師偉++李娣

【摘 要】 目前國內水生生物監(jiān)測手段已無法滿足快速發(fā)展的管理需求，PCR技術是一種新型的水生生物監(jiān)測技術，其具有簡便、靈敏、快速、特異性強等優(yōu)點，將其應用于水生生物監(jiān)測領域，可快速反應水體中污染現狀，大大提高國內水生生物監(jiān)測能力和水平。PCR技術對環(huán)境管理具有深遠的意義。

【關鍵詞】 環(huán)境污染 監(jiān)測 基因

隨著經濟與人口的快速發(fā)展，環(huán)境污染導致生態(tài)系統(tǒng)功能退化，以致引起生物多樣性降低，物種的分布與群落組成發(fā)生了巨大的變化。與此同時，分子水平上研究污染過程中污染物在生物體內的吸收與遷移不斷受到人們的關注。PCR技術具有快速、靈敏、簡便等優(yōu)點，在環(huán)境監(jiān)測領域方面的應用日趨顯現。

1 PCR技術

聚合酶鏈式反應（Polymerase Chain Reaction；PCR）是一種用于放大擴增特定的DNA片段的分子生物學技術，它可看作是生物體外的特殊DNA復制，PCR的最大特點，是能將微量的DNA大幅增加。目前PCR技術在微生物學、醫(yī)學等方面已得到較好的應用[1]。這種技術具有簡便、快速、靈敏的特點，已廣泛應用于基因獲取、基因定點突變、DNA序列分析、醫(yī)學診斷、基因檢測等方面。PCR技術也成為微生物領域重要的監(jiān)測手段，在此基礎上發(fā)展起來的Real-time PCR（實時熒光定量PCR技術），以Power SYBR Green（熒光標記染料）和熔解曲線為基礎，可用于檢測不同的核苷酸序列；相對于普通PCR，熒光定量PCR（RT-PCR）能對樣品中的目標生物進行相對或絕對定量，且靈敏度高，可重復性強，便于實驗結果的比較等諸多優(yōu)勢。

近年來，實時定量PCR技術開始在環(huán)境領域中顯示巨大生機。迅猛發(fā)展的PCR技術使生物監(jiān)測深入到分子水平，形成了一系列可依據多種分子技術來進行生物監(jiān)測的分子學方法。如熒光定量PCR可以用來檢測環(huán)境中的微生物在河流中隨季節(jié)的變化情況。熒光定量PCR還可以用來檢測地表水和飲用水中致病菌的含量。對于微生物，特別能快速監(jiān)測具有高效去除營養(yǎng)物質能力的微生物，熒光定量PCR能快速監(jiān)測[2]。如利用PCR技術能定量污水處理廠一級硝化處理后混合液懸浮固體中總細菌、硝化螺菌屬數量、氨氧化細菌數量，從而可以實時掌握污水處理情況。法國國家研究中心從活動熱泉附近的一個沉積物核中提取DNA來研究原生動物物種進化關系，利用測得的DNA序列數據構建系統(tǒng)進化樹時，發(fā)現沉積物中至少含有兩種遺傳組成上與已知原生生物差異極大的細菌，發(fā)現了許多新原生生物世系。這些發(fā)現為水生生物基因學分類開創(chuàng)了先河，也將推動基因學在更廣泛的領域得到應用。2003年初，Hebert等[3]首次提出了DNA條形碼的概念。DNA條形碼技術（DNA barcoding）是通過對一個標準目的基因的DNA序列進行分析從而進行物種鑒定的技術，用DNA序列作為標記來與物種信息建立一一對應關系。DNA條形碼是指利用短的標準DNA序列的核苷酸多樣性進行物種的鑒定和快速識別。

2 在水生生物監(jiān)測領域的應用

目前水生生物監(jiān)測主要包括水體中微生物、浮游動物、底棲動物等類群的監(jiān)測，通過野外觀測水體中指示物種、群落結構組成和多樣性，了解和掌握實際水體中環(huán)境污染的狀況。全世界每年有2億5千萬人感染水源性疾病，因此而死亡的人數為1千萬-2千萬。這要求對水體中致病菌進行準確檢測，以保證后續(xù)工作的正常開展。研究者[4]發(fā)現PCR技術對星狀病毒的檢測比電鏡技術更為靈敏，并可鑒定這一病毒的不同血清型。

隨著高通量測序技術的發(fā)展，以及人們對PCR技術的研究的深入，PCR技術能夠從單個環(huán)境樣品中獲取DNA。在水生生物監(jiān)測方面，當前國際上美國EPA，加拿大環(huán)保署以及歐洲的一些科研單位正在開展PCR技術在水生生態(tài)監(jiān)測中的應用研究；在我國，水生生物監(jiān)測仍使用傳統(tǒng)的形態(tài)學鏡檢，目前僅有少數研究利用分子生物學技術[5-6]，更沒有形成一定的體系，以前行業(yè)規(guī)范。

3 PCR技術用于水生生物監(jiān)測的優(yōu)缺點

相對于之前的監(jiān)測方法，PCR技術具有四大優(yōu)勢：（1）操作過程快速簡便，非專業(yè)分類學者也可利用PCR數據庫完成鑒定工作，（2）易于構建統(tǒng)一鑒定標準，（3）成本低，（4）易于質量控制。

相對于傳統(tǒng)的監(jiān)測方法，PCR技術的不足：（1）假陽性問題，當不相關的核酸分子中存在與模板非常相似的堿基序列時，PCR很可能做出假陽性的結果，這要求在引物的設計上要更為嚴格、更為細心。（2）質控問題，由于PCR靈敏度高，要求實驗過程中不能帶入干擾物質，無菌操作環(huán)境。（3）前期投入成本高，PCR鑒定水生生物多樣性，需先構建本土物種PCR基因數據庫，這要求投入大量的人力、物力、財力。

盡管如此，相信未來隨著人們研究的不斷深入，技術方法的不斷優(yōu)化，PCR技術將會給水生生物監(jiān)測注入新的生命力。

參考文獻：

[1]張瑾.“聚合酶鏈反應（PCR）原理”的教學設計[J].生物學通報，2013，48（11）：29-31.

[2]Rochelle PA. Comparison of primers and optimization of PCR conditions for detection of Cryptosporidium parvum and Giardia lamblia in water.Appl[J].Environ Microbiol，1997， 63：106-114.

[3]Hebert PDN，Cywinska A， Ball SL， de Waard JR.2003.Biological identifications through DNA barcodes. Proceedings of the Royal Society of London. Series B： Biological Sciences，2003，270： 313-321.

[4]Marx FE.Animproved lest System for PCR-based specific detection of Echinococcus multicularios eggs[J].Water Sci.Technol，1995，31：371-374.

[5]張占會，謝數濤，韓博平，林少君，鐘秀英，林桂花.全細胞多重PCR檢測藍藻、微囊藻及產毒微囊藻方法初探[J].生態(tài)科學，2005，24（1）：31-34.

[6]靳志剛.東平湖湖水藍細菌多樣性分析及mcyE基因的定量檢測[D].山東農業(yè)大學，2012.