張喜峰程 廣 何 倩 張芬琴 羅光宏

(1. 河西學(xué)院農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，甘肅 張掖 734000；2. 甘肅省河西走廊特色資源利用重點實驗室，甘肅 張掖 734000；3. 河西學(xué)院凱源生物技術(shù)開發(fā)中心，甘肅 張掖 734000；4. 甘肅省微藻工程技術(shù)研究中心，甘肅 張掖 734000)

雙水相萃取分離葡萄籽中原花青素

張喜峰1,2程 廣1何 倩1張芬琴1羅光宏

(1. 河西學(xué)院農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，甘肅 張掖 734000；2. 甘肅省河西走廊特色資源利用重點實驗室，甘肅 張掖 734000；3. 河西學(xué)院凱源生物技術(shù)開發(fā)中心，甘肅 張掖 734000；4. 甘肅省微藻工程技術(shù)研究中心，甘肅 張掖 734000)

采用雙水相萃取葡萄籽中原花青素，首先研究雙水相萃取體系組成、輔助萃取方法、萃取策略對原花青素萃取效果的影響，并采用正交試驗對原花青素萃取條件進行優(yōu)化。結(jié)果表明，雙水相萃取體系組成為無水乙醇/硫酸銨，輔助萃取方法為微波輔助法，萃取策略為乙醇+水+葡萄籽微波處理后加入硫酸銨，條件為無水乙醇/硫酸銨萃取體系為質(zhì)量分數(shù)30%無水乙醇/質(zhì)量分數(shù)20%硫酸銨，加入葡萄籽質(zhì)量分數(shù)為3%，pH為4.0，微波功率100 W，微波時間5 min，在該條件下，葡萄籽中原花青素的萃取率為94.1%，得率為25.8 mg/g；

葡萄籽；原花青素；雙水相萃取

在葡萄酒釀造過程中，每年約產(chǎn)生500～900萬t葡萄皮渣廢棄物[1]，近年來僅用于動物飼料和燃料，附加值較低。因此，尋找一種有效的葡萄皮渣處理方法迫在眉睫。

原花青素是葡萄籽多酚類化合物的重要組成之一，具有抗氧化、抗腫瘤、抗過敏、抗突變等活性[2-4]。廖素鳳等[5]采用丙酮提取葡萄籽中原花青素，因丙酮有一定毒性，限制了其應(yīng)用范圍；Hernández-Jiménez A等[6]研究了乙醇濃度對葡萄籽原花青素提取效果的影響，結(jié)果表明，乙醇濃度對葡萄籽中原花青素提取影響較小。樊金玲等[7]對提取后沙棘籽原花色素與葡萄籽原花青素抗氧化活性進行了比較研究，發(fā)現(xiàn)沙棘籽原花青素相對葡萄籽原花青素抗氧化性較強。金華等[8]采用超聲輔助提取葡萄籽中原花青素，獲得原花青素提取率為2.482%。Pérez C等[9]采用超臨界CO2萃取葡萄籽中原花青素，并對其抗氧化性進行了分析研究。該法存在設(shè)備成本較高、能耗大等缺點。原花青素純化方法主要有大孔樹脂層析法，該法存在溶劑用量大、生產(chǎn)周期長和操作繁瑣等缺點。

有機溶劑/鹽雙水相萃取指將親水性有機溶劑和鹽混合后由于鹽析作用可形成兩相；當葡萄籽粉末加入雙水相體系后，蛋白質(zhì)、多糖、少量多酚類物質(zhì)進入下相(富鹽相)，大部分多酚類物質(zhì)進入上相(有機溶劑相)。該技術(shù)具有操作簡單、傳質(zhì)速度快、容易放大、收率高等優(yōu)點[10]。該技術(shù)在生物工程領(lǐng)域發(fā)展較快[11]。筆者[12]前期曾采用聚乙二醇(PEG)/硫酸銨雙水相體系對葡萄籽粗提液中原花青素進行了研究，原花青素被萃取到PEG相，但原花青素中PEG的去除增加了后續(xù)工作的難度。

本試驗擬采用雙水相萃取分離葡萄籽中原花青素，首先分析了雙水相萃取體系組成、輔助萃取方法、萃取策略對原花青素萃取效果的影響，在此基礎(chǔ)上對萃取過程影響因素進行系統(tǒng)考察，旨在為葡萄籽中原花青素萃取提供最佳方法，同時為其它活性成分萃取提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

葡萄籽：品種為赤霞珠，取自甘肅順意生物科技有限公司，經(jīng)挑選、洗凈晾干、粉碎至50～100目備用；

乙醇：分析純，成都市科龍化工試劑廠；

香草醛：分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；

兒茶素標準品：純度≥99.8%，上海源葉生物科技有限公司；

硫酸銨：分析純，天津市致遠化學(xué)試劑有限公司；

電子分析天平：JA2003型，梅特勒-托利多有限公司；

超聲波微波組合反應(yīng)系統(tǒng)：XO-SM50型，南京先歐儀器制造有限公司；

可見光分光光度計：722S型，上?，F(xiàn)科分光儀器有限公司。

1.2 雙水相萃取

1.2.1 香草醛—鹽酸法測定原花青素的含量 分別吸取不同濃度的兒茶素標準溶液0.5 mL，加4%香草醛甲醇溶液3 mL，再加入1.5 mL濃鹽酸，避光反應(yīng)15 min。以0.5 mL蒸餾水，4%香草醛甲醇溶液3 mL，1.5 mL濃鹽酸為空白對照，在500 nm處測定吸光值[13]。以反應(yīng)體系所測吸光值y為縱坐標，兒茶素含量x(mg)為橫坐標，作標準曲線，求得回歸方程為：y=6.010 4x+0.012 4，R2=0.997 6。

1.2.2 雙水相萃取方法 將一定量的有機溶劑(無水乙醇或丙酮)、無機鹽(磷酸氫二鉀或硫酸銨)、葡萄籽粉末充分混勻，加蒸餾水使質(zhì)量分數(shù)為100%，攪拌至無機鹽溶解，按照一定萃取方法和策略進行，待靜置至兩相分離，讀取上下相的體積，測定上下相的吸光度，并按式(1)～(4)計算相比、分配系數(shù)、萃取率及得率。

(1)

(2)

(3)

(4)

式中：

R——相比；

V上——上相體積，mL；

V下——下相體積，mL；

K——分配系數(shù)；

C上——上相中原花青素的質(zhì)量濃度，mg/mL；

C下——下相中原花青素的質(zhì)量濃度，mg/mL；

E——萃取率，%；

Y——得率，mg/g；

m——葡萄籽粉末質(zhì)量，g。

1.2.3 萃取體系組成的確定 分別按照體系中最終質(zhì)量分數(shù)為28%無水乙醇/22% 硫酸銨、28%無水乙醇/22% 磷酸氫二鉀、28%丙酮/22% 磷酸氫二鉀，加入質(zhì)量分數(shù)2%葡萄籽粉末，補加蒸餾水使質(zhì)量分數(shù)為100%，攪拌至充分溶解，靜置至兩相分離，讀取上下相的體積，測定上下相的吸光度，并計算相比、分配系數(shù)、萃取率及得率，確定原花青素萃取的雙水相體系組成。

1.2.4 輔助萃取方法的確定 在質(zhì)量分數(shù)為28%無水乙醇和22% 硫酸銨中，加入質(zhì)量分數(shù)2%葡萄籽粉末，補加蒸餾水使質(zhì)量分數(shù)為100%，攪拌至充分混勻。分別采用100 W超聲處理5 min、室溫浸提5 min、100 W微波處理5 min 3種輔助方法。靜置至兩相分離，讀取上下相的體積，測定上下相的吸光度，并計算相比、分配系數(shù)、萃取率及得率，確定原花青素萃取的輔助方法。

1.2.5 萃取策略的確定 按照策略1：無水乙醇+硫酸銨+葡萄籽粉末+水，然后100 W微波處理5 min；策略2：硫酸銨+水+葡萄籽粉末混合后100 W微波處理5 min，加入無水乙醇，策略3：無水乙醇+水+葡萄籽粉末混合后100 W微波處理5 min，加入硫酸銨。3種萃取體系組成均為100%。靜置至兩相分離，讀取上下相的體積，測定上下相的吸光度，并計算相比、分配系數(shù)、萃取率及得率，從而確定原花青素萃取的最佳策略。

1.2.6 影響微波輔助萃取葡萄籽原花青素的因素

(1) 無水乙醇/硫酸銨質(zhì)量分數(shù)：按照無水乙醇+水+葡萄籽粉末加入順序混合后100W微波處理5 min，加入硫酸銨使體系中無水乙醇/硫酸銨的最終質(zhì)量分數(shù)分別為34%/16%，32%/18%，30%/20%，28%/22%，26%/24%，24%/26%，22%/28%，研究無水乙醇/硫酸銨質(zhì)量分數(shù)組成對原花青素萃取率和得率的影響。

(2) 葡萄籽粉末質(zhì)量分數(shù)：以質(zhì)量分數(shù)30%無水乙醇/20% 硫酸銨為雙水相萃取體系，加入葡萄籽粉末使其質(zhì)量分數(shù)分別為1%，2%，3%，4%，5%，100 W微波處理5 min，研究葡萄籽粉末加入量對原花青素萃取率和得率的影響。

(3) 體系pH：以質(zhì)量分數(shù)30%無水乙醇/20% 硫酸銨為雙水相萃取體系，加入葡萄籽粉末使其質(zhì)量分數(shù)為3%，調(diào)節(jié)體系pH分別為3，4，5，6，7，8，在微波功率為100 W條件下，處理5 min，研究體系pH對原花青素萃取率和得率的影響。

(4) 微波功率：以質(zhì)量分數(shù)30%無水乙醇/20% 硫酸銨為雙水相萃取體系，加入葡萄籽粉末使其質(zhì)量分數(shù)為3%，調(diào)節(jié)體系pH為4，在微波功率分別為50，60，70，80，90，100 W條件下，處理5 min。研究微波功率對原花青素萃取率和得率的影響。

(5) 微波時間：以質(zhì)量分數(shù)30%無水乙醇/20% 硫酸銨為雙水相萃取體系，加入葡萄籽粉末使其質(zhì)量分數(shù)為3%，調(diào)節(jié)體系pH值為4，在微波功率為90 W條件下，分別處理1，3，5，7，9 min。分析微波時間對原花青素萃取率和得率的影響。

1.2.7 正交試驗設(shè)計 在雙水相體系組成基礎(chǔ)上，對葡萄籽粉末質(zhì)量分數(shù)、pH值、微波功率、微波時間進行L9(34)正交試驗，以原花青素萃取率和得率為分析指標確定葡萄籽原花青素的最佳萃取條件。采用評分優(yōu)選法[14]即將各項指標除以該列最大值乘以100為該項得分。權(quán)衡原花青素萃取率和得率兩項指標，確定二者的權(quán)重系數(shù)均為0.5，對兩項指標進行加權(quán)求和，即綜合評分t=(原花青素萃取率t1/94.1%)×100×0.5+(得率t2/27.4)×100×0.5。

1.3 雙水相萃取后葡萄籽中原花青素薄層層析分析

將1 mg/mL原花青素標準品和兒茶素標準品及雙水相萃取后上、下相溶液進行薄層層析檢測，分別將上述標準品和樣品溶液點樣于薄層層析硅膠上，在層析缸中展開，擴展劑為V正丁醇∶V冰乙酸∶V水∶V甲醇=4∶1∶3∶4，顯色劑為20 mL/100 mL硫酸甲醇溶液與1%香草醛甲醇溶液等量混合噴霧，干燥后顯色，分析雙水相體系對葡萄籽中原花青萃取效果。

2 結(jié)果與分析

2.1 萃取體系組成對原花青素萃取率和得率的影響

由圖1可知，對28%無水乙醇22% 硫酸銨、24%無水乙醇26% 磷酸氫二鉀、34%丙酮16% 磷酸氫二鉀 3個雙水相萃取體系而言，無水乙醇—硫酸銨雙水相萃取體系的原花青素的萃取率和得率最高。原因可能是原花青素在乙醇中的溶解度比在丙酮中的高，同時丙酮毒性較大，存在安全性隱患，乙醇不會對人體造成傷害，滿足綠色萃取的需求[15]。磷酸氫二鉀與硫酸銨相比，硫酸銨參與組成雙水相體系有較高的電荷密度和水化能力[16]，更利于原花青素提取。因此，原花青素的雙水相萃取體系組成以無水乙醇/硫酸銨為最佳。

2.2 輔助萃取方法對原花青素萃取率和得率的影響

由圖2可知，原花青素的得率和萃取率從高到低依次是：微波輔助萃取法>超聲輔助萃取法>室溫萃取法。微波輔助萃取法與超聲波輔助萃取法、室溫輔助萃取法相比具有省時、高效和溶劑用量少的特點[17]。其原因可能是微波有助于提高溶劑分子及原花青素分子的動能，促進了擴散傳質(zhì)運動，進而得到較高的得率和萃取率。故原花青素的萃取方法采用微波輔助萃取法。

2.3 萃取策略對原花青素萃取率和得率的影響

由圖3可知，3種萃取策略中，策略3中原花青素的得率和萃取率較策略1和策略2高，即將無水乙醇和葡萄籽粉末、水混合，微波處理后加入硫酸銨比直接向雙水相體系中加入葡萄籽粉末的萃取效果好，原因可能與無水乙醇和水的極性有關(guān)，另外經(jīng)過乙醇提取的粗提液原花青素的濃度較大。故采用乙醇提取后再加入硫酸銨。

2.4 體系中無水乙醇/硫酸銨質(zhì)量分數(shù)比值對原花萃取率和得率的影響

由表1可知，隨著無水乙醇/硫酸銨質(zhì)量分數(shù)比值減小，原花青素的得率和萃取率先呈逐漸升高趨勢。在30%/20%時達到最大，隨后原花青素的得率和萃取率呈下降趨勢。其原因可能是當無水乙醇/硫酸銨質(zhì)量分數(shù)比值較大時，在萃取原花青素同時，其它物質(zhì)如單寧、白藜蘆醇等也會被萃取，影響原花青素得率和萃取率；當無水乙醇/硫酸銨質(zhì)量分數(shù)比值較小，萃取不充分，且硫酸銨質(zhì)量分數(shù)過高，由于鹽析作用的結(jié)果，影響原花青素萃取后兩相轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致得率和萃取率降低[16]。因此選擇30%無水乙醇/20% 硫酸銨為雙水相體系組成。

2.5 葡萄籽粉末質(zhì)量分數(shù)對原花青素萃取率和得率的影響

由圖4可知，在30%無水乙醇/20% 硫酸銨雙水相萃取體系中，隨著葡萄籽粉末質(zhì)量分數(shù)逐漸增加，原花青素得率和萃取率先增加后減小。當葡萄籽粉末質(zhì)量分數(shù)為3%時，原花青素得率和萃取率達到最大值。原因可能是粉末加入量較少時，在微波作用下，水分子有效吸收所需要的微波能，使水分子汽化，加強了萃取原花青素的驅(qū)動力，從而萃取效果較好；當葡萄籽粉末加入量過大時，由于上相萃取原花青素的量達到飽和，導(dǎo)致萃取率和得率下降。因此，選擇葡萄籽粉末質(zhì)量分數(shù)為3%。

2.6 pH對原花青素萃取率和得率的影響

由圖5可知，當萃取體系pH為4時，原花青素得率和萃取率達最大值，可能是在無水乙醇/硫酸銨雙水相體系中，上、下相間存在電位差。當pH值較低時，影響原花青素的解離度，使其吸附H+而攜帶正電荷，原花青素主要富集在電位為負的下相，導(dǎo)致萃取率和得率較低；當萃取體系pH值為4時，酸性條件破壞原花青素與蛋白質(zhì)、多糖等的結(jié)合，提高萃取效果；當pH值過大時，會破壞原花青素結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致原花青素的得率和萃取率降低。因此選擇pH=4.0為最佳。

2.7 微波功率對原花青素萃取率和得率的影響

由圖6可知，隨微波功率的逐漸增加，原花青素得率在90 W時達到最大值，之后逐漸下降，而萃取率一直呈現(xiàn)增加趨勢。原因可能是在微波功率較低條件下，體系溫度較低，熱效應(yīng)緩慢，隨著微波功率的增加，溫度升高，擴散系數(shù)增加，固體表面的液膜層變薄，減少了擴散阻力[18]，促使原花青素得率和萃取率增加；當微波功率超過90 W時，可能其它物質(zhì)浸出也較多，影響原花青素的得率。因此，最佳微波功率為90 W。

2.8 微波時間對原花青素萃取率和得率的影響

由圖7可知，原花青素得率和萃取率隨微波時間的延長逐漸增加，在5 min時達到最大值，之后趨于穩(wěn)定并逐漸下降。原因可能是隨著微波時間的延長，高頻電磁波穿透并滲透到細胞內(nèi)部極性分子上，使內(nèi)部溫度突然升高，壓力增加，細胞壁破裂[19]，促使葡萄籽中原花青素釋放；之后再繼續(xù)延長微波時間，熱量繼續(xù)積累，原花青素易降解、氧化，使原花青素結(jié)構(gòu)受到破壞[20]。因此，最佳微波時間為5 min。

2.9 正交試驗結(jié)果及分析

在確定雙水相萃取體系為30%無水乙醇/20% 硫酸銨基礎(chǔ)上，通過改變葡萄籽粉末質(zhì)量分數(shù)、pH、微波功率、微波時間4個因素，以原花青素萃取率和得率為分析指標進行L9(34)正交試驗，因素水平見表2，試驗及計算結(jié)果見表3。

由表3、4可知，葡萄籽粉末質(zhì)量分數(shù)、微波功率對原花青素萃取率和得率影響顯著，各因素對原花青素萃取率和得率影響大小為：葡萄籽粉末質(zhì)量分數(shù)>微波功率>微波時間>pH；最佳工藝條件為A2B2C3D2，即葡萄籽粉末質(zhì)量分數(shù)3%，pH 4，微波功率100 W，微波時間為5 min。

在30%無水乙醇/20% 硫酸銨雙水相體系中，按照葡萄籽粉末質(zhì)量分數(shù)為3%，pH 4，微波功率100 W，微波時間5 min重復(fù)3次驗證實驗，原花青素平均萃取率和得率分別為94.1%和25.8 mg/g，綜合評分為97.08分。

2.10 萃取后葡萄籽中原花青素薄層層析分析

由圖8可知，上相中原花青素進行薄層展開顯現(xiàn)的斑點比下相明顯；上、下相樣品展開后斑點的Rf值與原花青素和兒茶素標準品的Rf值基本保持一致，說明雙水相體系可有效萃取葡萄籽中原花青素。

? *表示誤差列。

3 結(jié)論

利用雙水相體系對葡萄籽中的原花青素進行萃取，主要研究了萃取體系組成、輔助萃取方式、萃取策略對原花青素得率和萃取率的影響，在此基礎(chǔ)上對萃取過程影響因素進行了系統(tǒng)考察，獲得了一種較好的雙水相萃取方法。

葡萄籽中原花青素的最佳萃取體系組成為無水乙醇/硫酸銨，最佳的輔助萃取方法為微波輔助萃取法，并確定了無水乙醇/硫酸銨雙水相萃取體系的質(zhì)量分數(shù)為30%無水乙醇/20% 硫酸銨，葡萄籽粉末質(zhì)量分數(shù)為3%，pH為4.0，微波功率為100 W，微波時間為5 min，在該條件下原花青素平均萃取率和得率分別為94.1%和25.8 mg/g。萃取后原花青素經(jīng)薄層層析檢測，上相中原花青素顯現(xiàn)斑點比下相明顯，說明雙水相體系可有效萃取原花青素，且該法可為雙水相萃取其它天然產(chǎn)物活性成分提供技術(shù)參考。

1～3. 萃取后上相 4. 萃取后下相 5. 原花青素標準品 6. 兒茶素標準品

圖8 雙水相萃取后原花青素的薄層層析

Figure 8 Thin layer chromatograph of the procyanidin by aqueous two-phase system

本試驗過程中僅通過萃取效果分析了輔助萃取方法的優(yōu)劣，若能將不同萃取方法獲得的原花青素進行抗氧化性比較分析，本研究內(nèi)容將更加豐富；萃取后原花青素對抑制晚期糖基化末端產(chǎn)物如何，有待進一步研究。

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Separation of procyanidin from grape seed by aqueous two-phase system

ZHANG Xi-feng1,2CHENGGuang1HEQian1ZHANGFen-qin13,4LUOGuang-hong3,4

(1.CollegeofAgricultureandBiotechnology,HexiUniversity,Zhangye,Gansu734000,China; 2.KeyLaboratoryofHexiCorridorResourcesUtilizationofGansu,Zhangye,Gansu734000,China; 3.KaiyuanBio-TechDevelopmentCenter,HexiUniversity,Zhangye,Gansu734000,China; 4.KaiyuanBio-TechDevelopmentCenter,HexiUniversity,Zhangye，Gansu734000,China)

Procyanidin from grape seed were separated and purified by the aqueous phase two-extraction. Aqueous two-phase extraction systems, differently assisted extraction methods and the extraction strategies were firstly studied. The best extractions of procyanidin by aqueous two-phase system were investigated based on orthogonal experimental design. The results showed that, in the aqueous two-phase extraction system of ethanol and (NH4)2SO4, the extraction method was the microwave-assisted extraction, i.e., Ethanol, water, and compounded by microwave treatment, as well as (NH4)2SO4were added. It was found that the best extraction conditions were 30%(w/w) ethanol/20%(w/w) (NH4)2SO4, 3%(w/w) grape seed powders, pH=4.0, microwave power 100W, ,and microwave time 5 min. Under these best extraction conditions, the recovery rate of procyanidin was 94.1%, and its yield was 25.8 mg/g.

grape seed; procyanidin; aqueous two-phase extraction

甘肅省中小企業(yè)創(chuàng)新基金項目(編號：1047GCCG001)；國家級大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目(編號：201510740005)

張喜峰，男，河西學(xué)院講師，碩士。

羅光宏(1965—)，男，河西學(xué)院教授，碩士。 E-mail：luoguanghong@163.com

2016-12-11

10.13652/j.issn.1003-5788.2017.03.035