羅宏麗，肖順林，余欣（西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院藥學(xué)部，四川 瀘州 646000）

抑毒調(diào)肝合劑抗大鼠肝纖維化的作用及機制研究Δ

羅宏麗＊，肖順林，余欣（西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院藥學(xué)部，四川 瀘州 646000）

目的：研究抑毒調(diào)肝合劑抗大鼠肝纖維化的作用及機制。方法：將60只SD大鼠隨機分為正常組、模型組、秋水仙堿組（陽性對照，0.2 mg/kg）和抑毒調(diào)肝合劑低、中、高劑量組（2.7、5.4、10.8 mL/kg）。除正常組外，其余各組大鼠均復(fù)制肝纖維化模型，并于造模同時ig相應(yīng)藥物，每天1次，連續(xù)8周。檢測大鼠血清中丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）、透明質(zhì)酸（HA）、Ⅲ型前膠原（PCⅢ）、Ⅳ型膠原（CⅣ）、基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子1（TIMP-1）、基質(zhì)金屬蛋白酶1（MMP-1）、MMP-2、MMP-13、轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGF-β1）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）水平和肝組織中羥脯氨酸（Hyp）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、過氧化氫酶（CAT）、丙二醛（MDA）、TGF-β1、TNF-α水平。結(jié)果：與正常組比較，模型組大鼠血清中ALT、AST、HA、PCⅢ、CⅣ、TIMP-1、MMP-2、TGF-β1、TNF-α水平顯著升高，MMP-1、MMP-13水平顯著降低（P＜0.05）；肝組織中Hyp、TGF-β1、TNF-α、MDA水平顯著升高，SOD、GSH-Px、CAT水平顯著降低（P＜0.05）。與模型組比較，抑毒調(diào)肝合劑中、高劑量組和秋水仙堿組大鼠血清中ALT、AST、HA、PCⅢ、CⅣ、TIMP-1、TNF-α水平以及肝組織中Hyp、TGF-β1、TNF-α、MDA水平均顯著降低（P＜0.05）；抑毒調(diào)肝合劑高劑量組和秋水仙堿組大鼠血清中MMP-1、MMP-13水平以及肝組織中CAT水平均顯著升高（P＜0.05），且血清中MMP-2、TGF-β1水平顯著降低（P＜0.05）；抑毒調(diào)肝合劑低劑量組大鼠上述指標(biāo)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論：抑毒調(diào)肝合劑抗大鼠肝纖維化的作用機制可能與調(diào)節(jié)TIMP/MMP平衡、抗氧化應(yīng)激、降低TGF-β1水平和減少細胞外基質(zhì)沉積有關(guān)。

抑毒調(diào)肝合劑；肝纖維化；大鼠

肝纖維化是多種慢性肝病共有的病理變化，表現(xiàn)為以膠原為主的細胞外基質(zhì)（Extracellular matrix，ECM）在肝臟內(nèi)的過度沉積[1]。研究證實，通過積極有效地對原發(fā)病和肝纖維化進行治療可預(yù)防肝纖維化發(fā)展為肝硬化或肝癌[2]，因此肝纖維化的早期診斷和有效治療顯得尤其重要。由于肝纖維化的行成過程具有多因素、多步驟、多環(huán)節(jié)的特征，雖然臨床上也使用秋水仙堿、青霉胺等藥物進行治療，但毒副作用大，其治療方法尚未有突破。而中藥具有多靶點、多環(huán)節(jié)、多層次的作用特點，近年來中藥單味及復(fù)方制劑在抗肝纖維化治療中已顯示出明顯優(yōu)勢[3-4]。抑毒調(diào)肝合劑是由西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院自主研發(fā)生產(chǎn)的醫(yī)院制劑，由虎杖、丹參、黨參、綿馬貫眾、黃精等5味中藥材組成，在臨床主要用于治療慢性肝炎，癥見疲乏無力、不思飲食、肝區(qū)隱痛、自汗者，但在肝纖維化方面應(yīng)用較少。筆者在前期研究中已對該方的制劑工藝進行了優(yōu)化，建立了其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，并證實了其具有一定抗肝纖維化作用[5-6]，但具體作用機制尚不明確。本研究在此基礎(chǔ)上進一步探討抑毒調(diào)肝合劑對大鼠肝纖維化的作用機制，為其臨床合理用藥提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

KS604721放射免疫分析儀（北京科思佳科技有限責(zé)任公司）；FA1004電子分析天平（上海精科天平廠）；AMS-18A全自動生化分析儀（北京奧普森科技有限公司）；MK3酶標(biāo)儀[熱電（上海）儀器有限公司]。

1.2 藥品與試劑盒

抑毒調(diào)肝合劑（西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院中藥制劑室自制，批準(zhǔn)文號：川藥制字Z20070510，批號：150217，規(guī)格：20 mL/支，每1 mL含生藥約1.12 g）；秋水仙堿片（云南植物藥業(yè)有限公司，批號：20150504，規(guī)格：0.5 mg/片）；丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、過氧化氫酶（CAT）、丙二醛（MDA）、羥脯氨酸（Hyp）試劑盒（南京建成生物工程研究所）；透明質(zhì)酸（HA）、Ⅲ型前膠原（PCⅢ）、Ⅳ型膠原（CⅣ）放射免疫試劑盒（北京華英生物技術(shù)研究所）；基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子1（TIMP-1）、基質(zhì)金屬蛋白酶1（MMP-1）、MMP-2、MMP-13、轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGF-β1）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）試劑盒（上海西唐生物科技有限公司）。

1.3 動物

清潔級成年健康SD大鼠60只，♀♂各半，體質(zhì)量180～200 g，由西南醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，動物合格證號為SYXK（川）2013-065。

2 方法

2.1 分組、造模與給藥

將60只SD大鼠隨機分為正常組、模型組、秋水仙堿組（陽性對照，0.2 mg/kg，相當(dāng)于成人臨床用量的6倍劑量）和抑毒調(diào)肝合劑低、中、高劑量組（2.7、5.4、10.8 mL/kg，分別相當(dāng)于成人臨床用量的3、6、12倍劑量），每組10只。除正常組大鼠sc橄欖油溶液外，其余各組大鼠均sc 40%CCl4橄欖油溶液（首次劑量為5 mL/kg，以后每次劑量為3 mL/kg），每周2次，連續(xù)8周；造模開始前2周給予高脂飲食（80%玉米粉+20%豬油），以后改用普通飼料，造模期間以10%乙醇為飲用水。自造模第1天起，各給藥組大鼠ig相應(yīng)藥液，每天1次；正常組大鼠ig等體積蒸餾水。每天觀察大鼠一般活動情況。

2.2 指標(biāo)測定

2.2.1 血清指標(biāo) 末次給藥后24 h，稱大鼠體質(zhì)量，麻醉，腹主動脈取血，以離心半徑為10 cm、3 000 r/min離心10 min（下同），分離血清。采用全自動生化分析儀測定血清中ALT、AST水平，采用放射免疫法測定血清中HA、PCⅢ、CⅣ水平，采用ELISA法測定血清中TIMP-1、MMP-1、MMP-2、MMP-13、TGF-β1、TNF-α水平，實驗操作嚴(yán)格按照相應(yīng)試劑盒說明書進行。

2.2.2 肝臟指標(biāo) 取血后處死大鼠，摘取肝臟，冷生理鹽水漂洗，冰浴中制成10%肝組織勻漿，離心，取上清。分別采用堿水解法、硫代巴比妥酸法（TBA法）、黃嘌呤氧化法測定肝組織中Hyp、MDA、SOD水平，采用比色法測定肝組織中GSH-Px、CAT水平，采用ELISA法測定肝組織中TGF-β1、TNF-α水平，實驗操作嚴(yán)格按照相應(yīng)試劑盒說明書進行。

2.3 統(tǒng)計學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 一般情況觀察結(jié)果

正常組大鼠皮毛光滑潤澤，活動及飲食基本正常，無死亡。模型組大鼠隨給藥時間的延長，進食和活動逐漸減少，皮毛干澀、枯亂，反應(yīng)遲鈍，分別于造模第6周和第7周各死亡1只。抑毒調(diào)肝合劑低劑量組大鼠的一般狀態(tài)與模型組無明顯區(qū)別，死亡1只。抑毒調(diào)肝合劑中、高劑量組大鼠的飲食情況較模型組改善，毛色逐漸趨于正常，活動度較好。秋水仙堿組大鼠整體情況與抑毒調(diào)肝合劑高劑量組相似，但有輕微腹瀉癥狀。

3.2 血清中ALT、AST、HA、PCⅢ、CⅣ水平和肝組織中Hyp水平測定結(jié)果

與正常組比較，模型組大鼠血清中ALT、AST、HA、PCⅢ、CⅣ水平和肝組織中Hyp水平均顯著升高（P＜0.05），提示造模成功。與模型組比較，抑毒調(diào)肝合劑中、高劑量組和秋水仙堿組大鼠上述指標(biāo)水平均顯著降低（P＜0.05），提示抑毒調(diào)肝合劑和秋水仙堿具有一定抗肝纖維化作用。與秋水仙堿組比較，抑毒調(diào)肝合劑高劑量組大鼠上述指標(biāo)均無顯著變化（P＞0.05），結(jié)果詳見表1。

3.3 血清中TIMP-1、MMP-1、MMP-2、MMP-13水平測定結(jié)果

與正常組比較，模型組大鼠血清中TIMP-1、MMP-2水平均顯著升高（P＜0.05），MMP-1、MMP-13水平均顯著降低（P＜0.05）。與模型組比較，抑毒調(diào)肝合劑高劑量組和秋水仙堿組大鼠上述指標(biāo)均顯著改善（P＜0.05）。與秋水仙堿組比較，抑毒調(diào)肝合劑高劑量組大鼠血清中MMP-1、MMP-2、MMP-13水平均無顯著差異（P＞0.05），結(jié)果詳見表2。

表1 各組大鼠血清中ALT、AST、HA、PCⅢ、CⅣ水平和肝組織中Hyp水平測定結(jié)果（±s）Tab 1 The levels ofALT，AST，HA，PCⅢ，CⅣin serum and Hyp in liver tissue of rats in each group（±s）

表1 各組大鼠血清中ALT、AST、HA、PCⅢ、CⅣ水平和肝組織中Hyp水平測定結(jié)果（±s）Tab 1 The levels ofALT，AST，HA，PCⅢ，CⅣin serum and Hyp in liver tissue of rats in each group（±s）

注：與正常組比較，＊P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與秋水仙堿組比較，ΔP＜0.05Note：vs.normal group，＊P＜0.05；vs.model group，#P＜0.05；vs. colchicine group，ΔP＜0.05

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表2 各組大鼠血清中TIMP-1、MMP-1、MMP-2、MMP-13水平測定結(jié)果（±s，μg/L）Tab 2 The serum levels of TIMP-1，MMP-1，MMP-2 and MMP-13 of rats in each group（±s，μg/L）

表2 各組大鼠血清中TIMP-1、MMP-1、MMP-2、MMP-13水平測定結(jié)果（±s，μg/L）Tab 2 The serum levels of TIMP-1，MMP-1，MMP-2 and MMP-13 of rats in each group（±s，μg/L）

注：與正常組比較，＊P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與秋水仙堿組比較，ΔP＜0.05Note：vs.normal group，＊P＜0.05；vs.model group，#P＜0.05；vs. colchicine group，ΔP＜0.05

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3.4 血清和肝組織中TGF-β1、TNF-α水平測定結(jié)果

與正常組比較，模型組大鼠血清和肝組織中TGF-β1、TNF-α水平均顯著升高（P＜0.05）。與模型組比較，抑毒調(diào)肝合劑中、高劑量組和秋水仙堿組大鼠血清和肝組織中TNF-α水平均顯著降低（P＜0.05）；抑毒調(diào)肝合劑高劑量組和秋水仙堿組大鼠血清和肝組織中TGF-β1水平以及抑毒調(diào)肝合劑中劑量組大鼠肝組織中TGF-β1水平均顯著降低（P＜0.05）。與秋水仙堿組比較，抑毒調(diào)肝合劑中、高劑量組大鼠上述指標(biāo)均無顯著差異（P＞0.05），結(jié)果詳見表3。

3.5 肝組織中SOD、GSH-Px、CAT、MDA水平測定結(jié)果

與正常組比較，模型組大鼠肝組織中SOD、GSHPx、CAT水平均顯著降低（P＜0.05），MDA水平顯著升高（P＜0.05）。與模型組比較，抑毒調(diào)肝合劑中、高劑量組和秋水仙堿組大鼠肝組織中SOD、GSH-Px水平以及抑毒調(diào)肝合劑高劑量組和秋水仙堿組大鼠肝組織中CAT水平均顯著升高（P＜0.05），MDA水平均顯著降低（P＜0.05）。與秋水仙堿組比較，抑毒調(diào)肝合劑中、高劑量組大鼠上述指標(biāo)均無顯著差異（P＞0.05），結(jié)果詳見表4。

表3 各組大鼠血清和肝組織中TGF-β1、TNF-α含量測定結(jié)果（±s，μg/L）Tab 3 The contents of TGF-β1and TNF-α in serum and liver tissue of rats in each group（±s，μg/L）

表3 各組大鼠血清和肝組織中TGF-β1、TNF-α含量測定結(jié)果（±s，μg/L）Tab 3 The contents of TGF-β1and TNF-α in serum and liver tissue of rats in each group（±s，μg/L）

注：與正常組比較，＊P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與秋水仙堿組比較，ΔP＜0.05Note：vs.normal group，＊P＜0.05；vs.model group，#P＜0.05；vs. colchicine group，ΔP＜0.05

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表4 各組大鼠肝組織中SOD、GSH-Px、CAT、MDA水平測定結(jié)果（±s）Tab 4 The levels of SOD，GSH-Px，CAT and MDA in liver tissue of rats in each group（±s）

表4 各組大鼠肝組織中SOD、GSH-Px、CAT、MDA水平測定結(jié)果（±s）Tab 4 The levels of SOD，GSH-Px，CAT and MDA in liver tissue of rats in each group（±s）

注：與正常組比較，＊P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與秋水仙堿組比較，ΔP＜0.05Note：vs.normal group，＊P＜0.05；vs.model group，#P＜0.05；vs. colchicine group，ΔP＜0.05

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4 討論

臨床上常用的肝纖維化診斷方法有血清學(xué)指標(biāo)（膠原及其代謝產(chǎn)物HA、LN、PCⅢ、CⅣ等）、肝穿刺病理學(xué)及B超瞬時彈性檢測。膠原纖維主要由膠原蛋白構(gòu)成，而Hyp又是膠原蛋白的特有成分，因此測定肝組織總Hyp含量可間接反映肝纖維化的程度[7]。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠肝組織中Hyp、HA、PCⅢ、CⅣ水平明顯升高，表明肝纖維化大鼠模型制備成功；而預(yù)防性給予抑毒調(diào)肝合劑后，上述指標(biāo)均顯著降低，表明該中藥復(fù)方可通過降低肝組織中Hyp含量、抑制膠原纖維合成，從而發(fā)揮抗纖維化作用。

MMP和TIMP是ECM合成和降解調(diào)節(jié)中的兩個重要因子。目前發(fā)現(xiàn)有20多種MMP，其中MMP-1主要降解Ⅰ、Ⅲ型膠原，減少ECM的沉積；MMP-2降解細胞間基質(zhì)成分和ECM CⅣ，并參與纖維結(jié)締組織的重建、炎癥反應(yīng)等；MMP-13需鋅離子的激活并參與肝內(nèi)ECM的降解，在肝損傷等狀態(tài)下表達降低[8]。TIMP是組織中MMP的內(nèi)源性抑制因子，可與活性MMP結(jié)合，抑制其對ECM的降解活性，從而導(dǎo)致ECM在肝臟內(nèi)的過度沉積，促使肝纖維化形成。目前發(fā)現(xiàn)有4種TIMP，肝臟中主要存在TIMP-1和TIMP-2。其中TIMP-1可抑制除MMP-14、MMP-19外的所有MMP，通過其N-末端特異性地與MMP-1催化活性中心的鋅離子結(jié)合，從而封閉其催化活性，使MMP-1失活[9]。TIMP-1對肝纖維化的診斷特異性和敏感性高于TIMP-2，其表達在肝纖維化過程中逐漸增強，到肝硬化階段達到高峰，增加的程度可反映肝纖維化的嚴(yán)重程度。因此，本實驗設(shè)計檢測MMP-1、MMP-2、MMP-13、TIMP-1等指標(biāo)，以評價模型復(fù)制是否成功和探討藥物的作用機制。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，造模8周后模型組大鼠血清中TIMP-1、MMP-2水平顯著升高，MMP-1、MMP-13水平則顯著降低；預(yù)防性給予抑毒調(diào)肝合劑后，血清中TIMP-1、MMP-2水平顯著降低，MMP-1、MMP-13水平則顯著升高，提示抑毒調(diào)肝合劑能明顯升高肝纖維化大鼠血清中MMP-1、MMP-13水平并下調(diào)血清中TIMP-1、MMP-2水平，使TIMP表達下降并解除對MMP的抑制，從而增加ECM的降解。

不論何種病因引起的肝纖維化，肝細胞損害是共同的始動因子，而臨床研究和動物實驗均提示肝纖維化的發(fā)生發(fā)展直接或間接與氧化應(yīng)激、氧自由基損傷、脂質(zhì)過氧化有關(guān)[10-11]。抑毒調(diào)肝合劑中多種成分具有清除氧自由基、抑制脂質(zhì)過氧化的藥理作用[12-13]。MDA是脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的終末產(chǎn)物，其高低間接反映了機體細胞受自由基攻擊的嚴(yán)重程度。本研究發(fā)現(xiàn)，CCl4復(fù)合因素作用后，在大鼠肝纖維化形成的同時，肝組織中MDA水平顯著升高，這表明肝纖維化形成與氧化應(yīng)激有關(guān)。而SOD、GSH-Px、CAT等氧化指標(biāo)水平顯著降低，則更加證實了這點。預(yù)防給予抑毒調(diào)肝合劑后，顯著降低了大鼠血清中ALT、AST水平和肝組織中MDA水平，提高了肝組織中SOD、GSH-Px、CAT的水平，提示抑毒調(diào)肝合劑對肝細胞的保護作用與抑制氧化應(yīng)激及脂質(zhì)過氧化反應(yīng)有關(guān)。

TGF-β1、TNF-α主要由肝星狀細胞（HSC）、庫普弗細胞等產(chǎn)生。研究表明，TGF-β1在ECM的合成和降解過程起關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用。TGF-β1對肝纖維化的調(diào)控主要是通過TGF-β1/Smad信號傳導(dǎo)通路實現(xiàn)的，可促進ECM的合成，增加ECM的沉積，還可通過抑制MMP等多種水解酶的產(chǎn)生與活性、增加TIMP的表達，從而減少ECM的降解。TNF-α能明顯抑制活化HSC凋亡，直接刺激HSC增殖和膠原合成，還能增強TGF-β1對HSC增殖和膠原合成的刺激作用[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，抑毒調(diào)肝合劑高劑量組大鼠血清和肝組織中TGF-β1和TNF-α水平均較模型組降低，提示TGF-β1、TNF-α表達減少可能是抑毒調(diào)肝合劑抗肝纖維化的分子機制之一，與TGF-βl/ Smad信號傳導(dǎo)通路下游的關(guān)系將是筆者下一步研究的方向。

綜上所述，抑毒調(diào)肝合劑能明顯改善大鼠肝功能，具有一定的抗肝纖維化作用。其作用機制可能與抗氧化應(yīng)激、抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)、抑制HSC活化、降低TGF-β1水平、調(diào)節(jié)TIMP/MMP平衡、減少ECM沉積等有關(guān)。但其更多分子乃至基因水平的作用機制還有待進一步研究。

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Study on Anti-hepatic Fibrosis Effects of Yidu Tiaogan Mixture on Rats and Its Mechanism

LUO Hongli，XIAO Shunlin，YU Xin（Dept.of Pharmacy，the Affiliated Hospital of Southwest Medical University，Sichuan Luzhou，646000，China）

OBJECTIVE：To study the anti-hepatic fibrosis effects of Yidu tiaogan mixture on rats and its mechanism.METHODS：60 SD rats were randomly divided into normal group，model group，colchicine group（positive control，0.2 mg/kg）and Yidu tiaogan mixture low-dose，medium-dose and high-dose groups（2.7，5.4，10.8 mL/kg）.Except for normal group，liver fibrosis model was induced in other groups，and they were given relevant medicine intragastrically during modeling，once a day，for 8 weeks.Serum levels of ALT，AST，HA，PCⅢ，CⅣ，TIMP-1，MMP-1，MMP-2，MMP-13，TGF-β1and TNF-α and the levels of Hyp，SOD，GSH-Px，CAT，MDA，TGF-β1and TNF-α in liver tissue were detected in rats.RESULTS：Compared with normal group，the serum levels of ALT，AST，HA，PCⅢ，CⅣ，TIMP-1，MMP-2，TGF-β1and TNF-α were increased significantly in model group，while the serum levels of MMP-1 and MMP-13 were decreased significantly（P＜0.05）；the levels of Hyp，TGF-β1，TNF-α and MDA in liver tissue were increased significantly，while the levels of SOD，GSH-Px and CAT were decreased significantly（P＜0.05）.Compared with model group，the serum levels of ALT，AST，HA，PCⅢ，CⅣ，TIMP-1 and TNF-α as well as the levels of Hyp，TGF-β1，TNF-α and MDA in liver tissue were all decreased significantly of rats in Yidu tiaogan mixture mediumdose，high-dose and colchicine groups（P＜0.05）；the serum levels of MMP-1 and MMP-13 as well as the level of CAT in liver tissue were increased significantly in Yidu tiaogan mixture high-dose group and colchicine group（P＜0.05），while the serum levels of MMP-2 and TGF-β1were decreased significantly（P＜0.05）.There was no statistical significance in above indexes in Yidu tiaogan mixture low-dose group（P＞0.05）.CONCLUSIONS：Yidu tiaogan mixture exerts protective effects on liver fibrosis of rat through regulating TIMP/MMP balance，suppressing oxidative stress，decreasing the level of TGF-β1and reducing deposition of extracellular matrix in liver.

Yidu tiaogan mixture；Liver fibrosis；Rat

R285.5

A

1001-0408（2017）04-0501-04

瀘州市科技計劃項目[No.2015-S-45（3/5）]

＊副主任藥師，碩士。研究方向：中藥藥理學(xué)、臨床藥學(xué)。E-mail：luohongli@stu.xjtu.edu.cn

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.04.19