荊才，羅志軍，胡鵬剛*，李家斌，何志鴻，王紹江，羅波，許晗

（1.貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院，貴州貴陽550025；2.貴州大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，貴州貴陽550025；3.貴陽單寧科技有限公司，貴州貴陽550200；4.貴州理工學(xué)院科技處，貴州貴陽550003）

反萃取降低高純單寧酸生產(chǎn)中沒食子酸殘留量的應(yīng)用

荊才1，羅志軍3，胡鵬剛1*，李家斌3，何志鴻3，王紹江3，羅波4，許晗2

（1.貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院，貴州貴陽550025；2.貴州大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，貴州貴陽550025；3.貴陽單寧科技有限公司，貴州貴陽550200；4.貴州理工學(xué)院科技處，貴州貴陽550003）

為了進(jìn)一步降低單寧酸中沒食子酸殘留量，以單寧酸為原料，采取萃取、反萃取等分離技術(shù)，以單寧酸中沒食子酸殘留量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)提純工藝進(jìn)行優(yōu)化。其最終優(yōu)化工藝條件為選擇pH 6.8的磷酸鈉鹽溶液作為反萃劑，單寧酸與乙酸乙酯固液比為1∶5 (g∶mL)，單寧酸與反萃液固液比為1∶2.5(g∶mL)。在此條件下單寧酸中沒食子酸含量可降低到1%以內(nèi)。

沒食子酸；高純單寧酸；萃取；反萃?。惶峒儍?yōu)化

單寧酸（tannic acid，TA）又名丹寧酸、單寧，是植酸類物質(zhì)，廣泛存在于自然界中[1-2]，是水溶性有機(jī)物（dissolved natural organic matter，DOM）的重要組成部分[3]。單寧酸在天然產(chǎn)物中分布很廣[4]，可從橡樹[5-6]、五倍子[7]等植物中分離得到。單寧酸的分子質(zhì)量在500～3 000 u，其定義是指能沉淀生物堿、明膠及其他蛋白質(zhì)的水溶性多酚化合物[8]，是一類相對(duì)分子質(zhì)量較高的多元酚類化合物[9]，具有較強(qiáng)的生物活性和藥理活性[10]，與蛋白質(zhì)有很強(qiáng)的結(jié)合能力，與生物堿、酶、金屬離子等反應(yīng)活潑，還有較強(qiáng)的表面活性，對(duì)一些人體的傷病具有直接的生物處理作用。經(jīng)過毒理及藥效學(xué)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，此類化合物具有多種功效，如有明顯體外抑菌效果[11]、止痛、止血、抗突變、抗脂質(zhì)氧化[12-14]等，且具低毒、安全的特點(diǎn)。因此，單寧酸被廣泛的應(yīng)用在醫(yī)藥、食品、化妝品、制革、冶金、印染、選礦等工業(yè)生產(chǎn)上[15]。

單寧酸的理化性質(zhì)使得其可同酒類中的可溶性敏感蛋白質(zhì)結(jié)合，形成具有膠鏈結(jié)構(gòu)的絡(luò)合物沉淀析出，保證了啤酒生產(chǎn)過程中的澄清度，從而提高了非生物穩(wěn)定性，延長了保質(zhì)期，并且不影響啤酒的口感[16]。目前，國內(nèi)啤酒年產(chǎn)量超過5 000萬L，對(duì)單寧酸的需求量很大，市場前景廣闊。同時(shí)，也對(duì)單寧酸的質(zhì)量提出了更高的要求，即單寧酸含量越高越好，沒食子酸殘留量越低越好。

目前，國內(nèi)生產(chǎn)單寧酸的企業(yè)主要或部分采用熱水浸提、有機(jī)溶劑萃取、樹脂吸附、酒精洗脫、冷凍澄清、濃縮干燥等工藝方法進(jìn)行生產(chǎn)。本實(shí)驗(yàn)采用有機(jī)溶劑萃取法，萃取劑選用乙酸乙酯，其原因是乙酸乙酯相對(duì)于乙醇、丙酮等有機(jī)溶劑的親水性差，可與水較好的分層分離，且乙酸乙酯沸點(diǎn)低，易回收，成本低，可反復(fù)進(jìn)行使用。單寧酸在乙酸乙酯溶液和反萃（?。﹦┓峙湎禂?shù)不同，通過萃取技術(shù)，極大部分單寧酸可以進(jìn)入乙酸乙酯，從而達(dá)到提純的目的；通過反萃取技術(shù)，可使一部分沒食子酸從有機(jī)相乙酸乙酯中返回反萃液中，從而達(dá)到降低單寧酸中沒食子酸殘留量的目的。同時(shí)，反萃液中的沒食子酸可以利用堿進(jìn)行水解回收制備沒食子酸。

本試驗(yàn)通過使用乙酸乙酯作為溶劑進(jìn)行反萃取可以降低高純單寧酸中沒食子酸的殘留量，對(duì)影響反萃取的各種因素的試驗(yàn)，獲得降低高純單寧酸生產(chǎn)中沒食子酸殘留量的最佳工藝，從而提高產(chǎn)品特征，增加產(chǎn)品的附加值，降低成本增加經(jīng)濟(jì)效益。同時(shí)，減輕污水的處理負(fù)擔(dān)，提純后產(chǎn)生的污水經(jīng)過簡單的處理即可達(dá)到國家污水排放標(biāo)準(zhǔn)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

單寧酸（沒食子酸含量3.82%）：由貴陽單寧科技有限公司提供；乙酸乙酯（食品級(jí)）：河南尉氏縣香源香料有限公司；單寧酸標(biāo)準(zhǔn)品、沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品（分析純）：南京林化所；活性炭：黎平奧捷碳素有限公司；磷酸二氫鈉（分析純）：成都市科龍化工試劑廠；無水磷酸氫二鈉（分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；無水碳酸鈉（分析純）：重慶江川化工有限公司；磷酸二氫鉀（分析純）：重慶吉元化學(xué)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

JM-B10001型電子天平：余姚市紀(jì)銘稱重校驗(yàn)設(shè)備有限公司；ATY224型分析天平：日本SHIMADZU公司；754型紫外可見分光光度計(jì)：天津市普瑞斯儀器有限公司；202-00型電熱恒溫干燥箱：滬南電爐烘箱廠；202-1AB型電熱恒溫干燥箱、DZ-1AⅡ真空干燥箱：天津市泰斯特儀器有限公司；HH系列數(shù)顯恒溫水浴鍋（箱）：金壇市科析儀器有限公司；HY-5回旋振蕩器：金壇市富華儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 沒食子酸的反萃取

按照不同比例將單寧酸、乙酸乙酯溶液、反萃取液分別加入1 000 mL的四口圓底燒瓶，在30℃條件下機(jī)械攪拌萃取30 min。反萃取液與單寧酸和乙酸乙酯溶液發(fā)生反萃取反應(yīng)，將其中的沒食子酸和其他一些雜質(zhì)反萃取出來。然后傾于分液漏斗，于室溫條件下靜置分層，5 h左右后分離出反萃液。將反萃液和乙酸乙酯萃取液分別集中收集，前者用于堿水解回收沒食子酸，后者用于制備單寧酸。

1.3.2 單寧酸樣品的制備

將乙酸乙酯萃取液倒入四口圓底燒瓶回收乙酸乙酯溶液，15～30min后補(bǔ)加100mL高純水，使單寧酸進(jìn)入高純水形成單寧酸水濃縮液，至蒸出的液體含極少或不含乙酸乙酯時(shí)停止。將單寧酸水濃縮液倒入燒杯煮沸，加一定量的活性炭進(jìn)行吸附和脫色，趁熱抽濾。將單寧酸濾液倒入培養(yǎng)皿，置真空干燥箱干燥，所得固體經(jīng)過干燥后研碎裝入樣品袋，待檢測單寧酸樣品中沒食子酸殘留量。

1.3.3 單因素試驗(yàn)

根據(jù)前期試驗(yàn)綜合分析單寧酸與乙酸乙酯固液比、單寧酸與反萃取液固液比、不同反萃（取）劑對(duì)降低單寧酸中沒食子酸殘留量有一定的影響，因此選擇在30℃條件下進(jìn)行萃取反應(yīng)，考察單寧酸與乙酸乙酯固液比（1∶3、1∶4、1∶5、 1∶6、1∶7（g∶mL））、單寧酸與反萃取液固液比（1∶2.0、1∶2.5、1∶3.0、1∶3.5、1∶4.0（g∶mL））、不同反萃劑（pH 6.8的磷酸鈉鹽溶液、高純水、pH 7.5的磷酸鈉鉀鹽溶液、1%Na2CO3溶液、3% Na2CO3溶液）對(duì)單寧酸中沒食子酸殘留量的影響，進(jìn)行單因素試驗(yàn)。

1.3.4 正交試驗(yàn)

為了得到降低單寧酸中沒食子酸殘留量的最佳工藝條件，以單寧酸與乙酸乙酯固液比、單寧酸與反萃取液固液比和不同反萃劑作為考察因素，根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果選擇3個(gè)水平，以單寧酸中沒食子酸殘留量為考察指標(biāo)，按L9（34）正交試驗(yàn)表設(shè)計(jì)試驗(yàn)。正交試驗(yàn)因素水平見表1。

表1 反萃取沒食子酸工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for gallic acid counter extraction process optimization

1.3.5 樣品測定方法

單寧酸中沒食子酸含量按照國家林業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)LY/T 1642—2005中《單寧酸分析試驗(yàn)方法》進(jìn)行檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果分析

2.1.1 單寧酸與乙酸乙酯固液比對(duì)沒食子酸殘留量的影響

單寧酸與磷酸鈉鹽溶液（pH 6.8）固液比1∶2（g∶mL）、30℃條件下萃取30 min，考察單寧酸與乙酸乙酯固液比對(duì)單寧酸中沒食子酸殘留量的影響，其結(jié)果見圖1。

圖1 單寧酸與乙酸乙酯固液比對(duì)單寧酸中沒食子酸含量的影響Fig.1 Effect of tannic acid to ethyl acetate ratio on gallic acid content in tannin acid

由圖1可知，隨著單寧酸與乙酸乙酯固液比的增高，單寧酸中沒食子酸殘留量總體呈現(xiàn)下降趨勢，在乙酸乙酯固液比1∶5時(shí)沒食子酸殘留量有明顯下降，之后波動(dòng)不太明顯，趨于平緩，可能是過量的乙酸乙酯溶液將大部分單寧酸吸收，而反萃取液反萃取沒食子酸已到達(dá)或接近飽和致使單寧酸中沒食子酸殘留量保持在一定的值附近。因此，選擇單寧酸與乙酸乙酯固液比為1∶5（g∶mL）。

2.1.2 單寧酸與反萃取液固液比對(duì)沒食子酸殘留量的影響

單寧酸與乙酸乙酯溶液固液比1∶5（g∶mL），30℃條件下萃取30 min，考察單寧酸與反萃取液固液比對(duì)單寧酸中沒食子酸殘留量的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 單寧酸與反萃液固液比對(duì)單寧酸中沒食子酸含量的影響Fig.2 Effect of tannic acid to stripping agent ratio on gallic acid content in tannin acid

由圖2可知，在單寧酸與反萃取液固液比1∶2.0～1∶4.0（g∶mL）范圍內(nèi)，單寧酸中沒食子酸殘留量先下降，在單寧酸與反萃取液固液比為1∶3.0（g∶mL）時(shí)沒食子酸殘留量最低，1∶3.0（g∶mL）后又上升?？赡苁怯捎诜摧腿∫哼^量，促進(jìn)單寧酸的水解使得沒食子酸殘留量增高。同時(shí)，由于溶液中的鈉鹽離子增多，單寧酸的氧化性質(zhì)使得溶液出現(xiàn)不溶絮狀物，增大了酯相和水相的分離難度，也降低了單寧酸的含量。故選擇單寧酸與反萃取液固液比1∶3.0（g∶mL）。

2.1.3 不同反萃劑對(duì)沒食子酸殘留量的影響

單寧酸與乙酸乙酯溶液固液比1∶5（g∶mL）、單寧酸與反萃取液固液比1∶3（g∶mL），30℃萃取30 min，考察不同反萃劑對(duì)單寧酸中沒食子酸殘留量的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 反萃劑對(duì)單寧酸中沒食子酸含量的影響Fig.3 Effects of stripping agent on gallic acid content in tannin acid

由圖3可知，使用a（pH 6.8的磷酸鈉溶液）時(shí)，單寧酸中沒食子酸殘留量最低，為1.02%，其次是b（pH 7.5的磷酸鈉鉀鹽）和c（高純水），d（1%的Na2CO3溶液）pH值約為9，e（3%的Na2CO3溶液）pH值約為12，后兩種反萃劑由于pH值太高，對(duì)后期的污水處理帶來較大的不便，并且在靜置分層時(shí)生成大量不溶物，造成了工藝過濾困難。由于單寧酸受pH值影響較大，在堿性條件下易發(fā)生氧化，且隨著pH值增加，氧化加劇。所以在整個(gè)制備過程中，其反應(yīng)環(huán)境的pH值必須加以控制，尤其在生產(chǎn)階段，更加要注重這個(gè)問題。故選擇磷酸鈉鹽溶液（pH 6.8）作為反萃劑。

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果分析

正交試驗(yàn)的結(jié)果與分析如表2所示，方差分析見表3。

表2 反萃取沒食子酸正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for counter extraction process optimization

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal experiments results

由表2直觀結(jié)果顯示，第6組反萃取效果最好，得到單寧酸中沒食子酸殘留為0.99%。由極差分析可以得出最優(yōu)水平組合為A2B1C1，即單寧酸與乙酸乙酯固液比1∶5（g∶mL），單寧酸與反萃取液固液比1∶2.5（g∶mL），選擇磷酸鈉鹽溶液（pH 6.8）作為反萃劑。根據(jù)表3數(shù)據(jù)顯示，由極差分析可以看出3個(gè)因素對(duì)單寧酸中沒食子酸殘留量效果影響程度的大小為反萃劑（C）＞單寧酸與乙酸乙酯固液比（A）＞單寧酸與反萃取液固液比（B）。由表3方差分析可以看出，單寧酸與乙酸乙酯固液比對(duì)單寧酸中沒食子酸殘留量影響顯著，單寧酸與反萃取液固液比對(duì)單寧酸中沒食子酸殘留量影響不顯著，反萃劑對(duì)單寧酸中沒食子酸殘留含量有極顯著影響。由于最優(yōu)組合沒有出現(xiàn)在正交表中，在最優(yōu)條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果表明，最終單寧酸中沒食子酸殘留量降至1%以內(nèi)。所以最終優(yōu)化工藝條件為單寧酸與乙酸乙酯固液比1∶5（g∶mL），單寧酸與反萃取液固液比1∶2.5（g∶mL），選擇磷酸鈉鹽溶液（pH 6.8）作為反萃劑。

3 結(jié)論

為了滿足當(dāng)前啤酒市場對(duì)低沒食子酸殘留量的高純度食品級(jí)單寧酸的需求，本試驗(yàn)采用萃取、反萃取、活性炭吸附等分離提純技術(shù)對(duì)單寧酸中的沒食子酸殘留量進(jìn)行分離去除，從而降低高純度單寧酸中沒食子酸的殘留量。根據(jù)其結(jié)果顯示，經(jīng)過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)得到反萃取降低單寧酸中沒食子酸殘留量的最佳工藝條件，即選擇pH6.8的磷酸鈉鹽溶液作為反萃劑，單寧酸與乙酸乙酯固液比為1∶5（g∶mL），單寧酸與反萃取液固液比為1∶2.5（g∶mL）。在此條件下進(jìn)行分離反萃取可降低單寧酸中沒食子酸殘留量在1%以內(nèi)。該方法操作簡便可行，提純效果好，且生產(chǎn)成本低，適用于工業(yè)規(guī)模化生產(chǎn)。

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Application of counter extraction in gallic acid reduction during high-purity tannin acid production

JING Cai1,LUO ZhiJun3,HU Penggang1*,LI Jiabin3,HE Zhihong3,WANG Shaojiang3,LUO Bo4,XU Han2
(1.School of Liquor and Food Engineering,Guizhou University,Guiyang 550025,China;2.School of Chemistry and Chemical Engineering, Guizhou University,Guiyang 550025,China;3.Guiyang Gallotannin Co.,Ltd.,Guiyang 550200,China;4.Department of Science and Technology,Guizhou Institute of Technology,Guiyang 550025,China)

In order to further reduce the residual content of gallic acid in tannic acid,using tannic acid as raw material,by extraction,counter extraction and other separation techniques,the purification technology was optimized using gallic acid residual content in tannic acid as evaluation index. Finally the optimum technology conditions were obtained as sodium phosphates(pH6.8)as stripping agent,tannic acid to ethyl acetate ratio 1∶5(g∶ml) and tannic acid to strippingagentratio 1:2.5(g:ml).Under the conditions,the residualcontentofgallic acid in tannic acid could decrease to lessthan 1%.

gallic acid;high-purity tannic acid;extraction;counter extraction;purification and optimization

TQ941

0254-5071（2017）03-0156-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.03.031

2016-12-20

貴州省重大專項(xiàng)黔科合重大專項(xiàng)字（20126003）

荊才（1990-），男，碩士研究生，研究方向?yàn)榘l(fā)酵工程。

*通訊作者：胡鵬剛（1964-），男，教授，本科，研究方向?yàn)楝F(xiàn)代食品發(fā)酵工程專業(yè)技術(shù)應(yīng)用與現(xiàn)代生物物質(zhì)分離科學(xué)技術(shù)應(yīng)用。