楊 慶,張超奇,馬麗曉,周文兵①,朱端衛(wèi),周易勇,肖乃東

〔1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)微量元素研究中心生態(tài)與環(huán)境工程研究室,湖北 武漢 430070;2.生豬健康養(yǎng)殖(湖北省)協(xié)同創(chuàng)新中心,湖北 武漢 430070;3.淡水生態(tài)與生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖北 武漢 430072〕

一株高效鳳眼蓮脫膠菌的篩選及鑒定

楊 慶1,2,張超奇1,馬麗曉1,周文兵1,2①,朱端衛(wèi)1,2,周易勇3,肖乃東1,2

〔1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)微量元素研究中心生態(tài)與環(huán)境工程研究室,湖北 武漢 430070;2.生豬健康養(yǎng)殖(湖北省)協(xié)同創(chuàng)新中心,湖北 武漢 430070;3.淡水生態(tài)與生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖北 武漢 430072〕

預(yù)處理是生物質(zhì)能源產(chǎn)品制備中最昂貴、最關(guān)鍵的環(huán)節(jié),生物預(yù)處理因環(huán)境友好和能耗低而受到廣泛關(guān)注。為獲得較好的生物預(yù)處理菌株,以脫膠效率為出發(fā)點(diǎn)篩選菌株,從鳳眼蓮(Eichhorniacrassipes)生長環(huán)境介質(zhì)中分離菌株,通過富集培養(yǎng)、剛果紅平板染色法初篩,獲得一株對鳳眼蓮脫膠效果較好的A1菌株。在最佳條件下A1菌株分泌的果膠酶活性、木聚糖酶活性和纖維素酶活性分別為3 925.00、8 331.67和4 883.62 nmol·s-1·mL-1;A1菌株對鳳眼蓮的1次脫膠減重率為33.37%,3次連續(xù)脫膠的累計(jì)減重率為49.26%。通過16S rRNA序列鑒定,構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹分析,該菌株為解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)。

脫膠;鳳眼蓮;篩選;解淀粉芽孢桿菌

鳳眼蓮(Eichhorniacrassipes)是我國外來入侵物種之一,在各類水體中泛濫成災(zāi),其具有纖維素、半纖維素含量高,生長不占用土地等優(yōu)點(diǎn),是能源產(chǎn)品生產(chǎn)的重要生物質(zhì)來源[1-3]。生物質(zhì)原料結(jié)構(gòu)復(fù)雜,其主要利用對象是構(gòu)成植物細(xì)胞壁的原纖維絲。木質(zhì)素、半纖維素和果膠等基礎(chǔ)物質(zhì)相互交聯(lián)包裹，組成堅(jiān)固的原纖維絲表層結(jié)構(gòu),使得纖維素成分難以被利用[4-5]。如何高效釋放出生物質(zhì)原料中能被發(fā)酵階段利用的糖進(jìn)而提高乙醇等能源物質(zhì)的生產(chǎn)效率，成為目前生物質(zhì)能源化利用中最大的技術(shù)與經(jīng)濟(jì)挑戰(zhàn)[6-8]。預(yù)處理是生物質(zhì)原料釋放可利用糖的關(guān)鍵步驟,其目的是破壞原纖維絲頑固的外表層結(jié)構(gòu),盡可能增大后續(xù)酶水解對結(jié)晶纖維素的可及度,從而提高生物質(zhì)利用效率[9-11]。生物脫膠是生物質(zhì)利用的預(yù)處理方法之一,其機(jī)理是通過特殊微生物對環(huán)境的適應(yīng)性,分泌果膠酶及半纖維素酶等酶系,將大分子的果膠及半纖維素轉(zhuǎn)化為小分子的生物可利用糖,進(jìn)而被脫膠菌株吸收利用[12]。目前脫膠菌多用于對苧麻的研究,通過去除麻類物質(zhì)中的膠質(zhì)成分同時(shí)保留其纖維成分,增強(qiáng)麻類纖維性能,這種脫膠方法鮮有涉及其他類型植物[13]。筆者借鑒前人對苧麻脫膠菌的篩選方法,從鳳眼蓮不同生長環(huán)境中篩選降解鳳眼蓮非纖維素的優(yōu)良菌株,并對其產(chǎn)酶特性和脫膠能力進(jìn)行了探究。目前報(bào)道的脫膠菌株有放線菌屬[14]、纖維單胞菌[15]、志賀菌屬[16]和枯草芽孢桿菌[17]等,這些都是對麻類的脫膠菌株,而對解淀粉芽孢桿菌脫膠報(bào)道較少。該研究報(bào)道了一種解淀粉芽孢桿菌作為鳳眼蓮脫膠菌的效果，解淀粉芽孢桿菌本身也可以消耗蛋白質(zhì)、脂肪和淀粉等有機(jī)物。具有果膠酶活性的解淀粉芽孢桿菌可以有效去除木質(zhì)纖維素中的蛋白質(zhì)和膠質(zhì)成分，為生物預(yù)處理鳳眼蓮提供生物基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌種來源與材料制備

選取華中農(nóng)業(yè)大學(xué)某生長鳳眼蓮的池塘水、池塘底泥和武漢南湖湖水分別作為菌種來源。選用華中農(nóng)業(yè)大學(xué)周邊隨機(jī)采摘的健壯鳳眼蓮植株,洗凈晾干,并將其根、葉與莖切離,將莖切成約2 cm小段,烘干備用。

分離培養(yǎng)基Ⅰ:w=0.01%的K2SO40.1 g,CaCl20.2 g,NaCl 0.2 g,MgSO4·7H2O 0.3 g,KNO30.5 g,(NH4)2SO40.5 g,K2HPO41 g,瓊脂20 g,蒸餾水1 L;分離培養(yǎng)基Ⅱ:果膠1 g,瓊脂5 g,pH值為7.0,蒸餾水1 L。在培養(yǎng)皿中倒雙層平板,表層為5 mL培養(yǎng)基Ⅱ,基層為10 mL培養(yǎng)基Ⅰ。

水解圈測定培養(yǎng)基Ⅰ:FeSO40.01 g,CaCl20.2 g,MgSO4·7H2O 0.5 g,NaCl 0.5 g,KH2PO41 g,NH4NO33 g,果膠5 g,瓊脂20 g,pH值為7.0,蒸餾水1 L;水解圈測定培養(yǎng)基Ⅱ:20 g瓊脂,蒸餾水1 L。在培養(yǎng)皿中倒雙層平板,表層為10 mL培養(yǎng)基Ⅰ,基層為10 mL 培養(yǎng)基Ⅱ。

脫膠培養(yǎng)基[18]:鳳眼蓮莖5 g,鹽溶液150 mL,pH值約為7.0。鹽溶液:MgSO4·7H2O 0.5 g,K2HPO40.5 g,(NH4)2SO45 g,無菌水1 L。

斜面培養(yǎng)基:牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基。

1.2 菌種的分離與篩選

1.2.1 菌種的分離與純化

設(shè)置5個(gè)處理,編號為A、B、C、D和E,處理設(shè)置見表1。取鳳眼蓮莖樣和水,按m(固)∶V(液)=1∶30的比例置于錐形瓶中,自然pH下(pH值約為7.0)35 ℃培養(yǎng)至纖維分散(約5 d),得一次增殖培養(yǎng)液。另取鳳眼蓮莖,同上處理加入一次增殖培養(yǎng)液,得二次增殖培養(yǎng)液。取二次增殖培養(yǎng)液1 mL,分別稀釋10-5、10-6和10-7倍。分別取0.1 mL不同濃度稀釋液于分離培養(yǎng)基中涂布,35 ℃恒溫培養(yǎng)2～3 d。挑選分離培養(yǎng)基中得到的菌群,于斜面培養(yǎng)基上劃線純化、保存。

表1 脫膠菌富集培養(yǎng)的不同處理

Table 1 Different treatments in enrichment culture of degumming bacteria

編號處理A10g鳳眼蓮莖+270mL無菌水+30mL底泥懸浮液B10g鳳眼蓮莖+270mL無菌水+30mL池塘水C10g鳳眼蓮莖+270mL無菌水+30mL南湖水D10g鳳眼蓮莖+300mL無菌水E10g鳳眼蓮莖+400mL南湖水F10g鳳眼蓮莖+400mL池塘水

1.2.2 初篩

將上述分離得到的菌株點(diǎn)接于水解圈測定培養(yǎng)基,35 ℃培養(yǎng)2 d。采用剛果紅平板染色法,計(jì)算水解圈直徑(H)與菌落直徑(C)之比,即H/C比值[19]。H/C比值較大的菌株即為初篩菌株。

1.3 酶活性測定

將初篩得到的菌株置于脫膠培養(yǎng)基中培養(yǎng),測定果膠酶、木聚糖酶及纖維素酶活性。脫膠培養(yǎng)條件:溫度35 ℃，振蕩速率145 r·min-1，接種率4%，pH值7.0。每24 h取2 mL發(fā)酵液,用DNS比色法測定果膠酶、木聚糖酶及纖維素酶活性[20]。

1.4 脫膠試驗(yàn)

分別將復(fù)篩菌株接種于脫膠培養(yǎng)基中,在最佳脫膠條件下培養(yǎng)。脫膠完成后取出樣品,用蒸餾水洗凈后烘干稱重,計(jì)算樣品的脫膠率,可用減重率表示[21]。再次按上述步驟連續(xù)脫膠2次(共計(jì)脫膠3次)。減重率=(M0-M1)/M0×100 %。式中，M0為脫膠處理前樣品干重,g；M1為脫膠處理后樣品干重，g。

1.5 菌株的鑒定

1.5.1 革蘭染色及菌株16S rRNA基因測序

將篩選得到的脫膠最優(yōu)菌株A1進(jìn)行革蘭染色后[22],于顯微鏡下觀察其形態(tài)特征。另取1支A1菌種管委托武漢擎科測序公司進(jìn)行16S rRNA測序。

1.5.2 系統(tǒng)發(fā)育分析

分離菌株測序結(jié)果提交GenBank進(jìn)行BLAST比較,從BLAST結(jié)果中挑選與該菌株堿基序列相似度在95%以上的菌株序列,通過Clustal W進(jìn)行多重序列比對,并利用MAGE 6.0軟件,以Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與討論

2.1 初篩結(jié)果

將經(jīng)過富集培養(yǎng)、分離所得的優(yōu)勢菌群用于鳳眼蓮脫膠菌的初次篩選,得到產(chǎn)生黃色透明圈的15株菌株。由表2可知,A1、B3、B11和C11這4支菌株不是該分離培養(yǎng)基上最具優(yōu)勢的菌株,但它們的水解圈直徑均大于45 mm,其菌落所產(chǎn)生的透明圈明顯大于其他菌株,故選擇透明圈較大及H/C比值較高的5株菌株A1、B3、B11、C11和B13用于復(fù)篩。

2.2 酶活性測定

將上述5支菌株復(fù)篩,其酶活性變化見圖1。

表2 鳳眼蓮脫膠菌的初篩結(jié)果

Table 2 Primary screening ofEichhorniacrassipesdegumming strains

菌株菌落直徑C/mm水解圈直徑H/mmH/C比值A(chǔ)16.5>45>6.9B34.5>45>10B117.0>45>6.4C116.0>45>7.5C296.0427.0C810.5393.7B14.5306.7D2110.0292.9B128.0283.5B107.0273.9A54.0256.3C314.0246.0B133.0237.7D123.0196.3B24.0164.0

菌株編碼中字母代表處理?xiàng)l件(詳見表1),下標(biāo)數(shù)字代表該條件下菌株編號。

圖1 不同培養(yǎng)時(shí)間下5支菌株分泌的酶活性Fig.1 Activities of the enzymes secreted by five different strains relative to cultivation time

5支菌株分泌的果膠酶和木聚糖酶活性先升高再降低,纖維素酶活性在培養(yǎng)48～72 h時(shí)均呈明顯降低趨勢,再隨著時(shí)間的延長纖維素酶活性又有所回升。A1、B3和B11菌株的果膠酶和木聚糖酶活性分別在48和72 h達(dá)到最高值,木聚糖酶活性的最大值出現(xiàn)時(shí)間有一定的滯后性;C11和B13菌株的果膠酶與木聚糖酶活性在72 h達(dá)到最高值。上述現(xiàn)象可能是因?yàn)轼P眼蓮樣品經(jīng)物理破碎以及滅菌過程,部分木質(zhì)纖維素成分溶入發(fā)酵液中,促使細(xì)菌產(chǎn)生纖維素酶、木聚糖酶和果膠酶以進(jìn)行自身的發(fā)酵。當(dāng)溶液中的纖維素和木聚糖等消耗后,細(xì)菌開始利用鳳眼蓮?fù)獠康哪z質(zhì)成分,此時(shí)纖維素成分濃度較低,進(jìn)而表現(xiàn)為果膠酶和木聚糖酶活性增加,而纖維素酶活性降低。而當(dāng)膠質(zhì)結(jié)構(gòu)被破壞后,部分纖維素成分暴露出來,使得纖維素酶活性又有所增加。在72 h時(shí)纖維素酶活性基本處于最低水平,此時(shí)果膠酶與木聚糖酶活性較高。因此,選定72 h作為最佳脫膠周期。

經(jīng)過72 h脫膠后,測得A1、B3、B11、C11和B13這5支菌株分泌的3種酶活性見表3。A1菌株分泌的3種酶活性均較高,其木聚糖酶活性明顯高于其他菌株。脫膠效果主要可通過果膠酶活性與木聚糖酶活性來表征,這2種酶活性越高,脫膠效果越顯著。A1菌株纖維素酶活性雖然在5種菌株中最高,但絕對數(shù)值較低,且與其他菌株(B11菌株除外)相比差異不顯著。

表3 不同菌株處理鳳眼蓮莖72 h時(shí)分泌的3種酶活性

同一列數(shù)據(jù)后英文小寫字母不同表示各菌株間某指標(biāo)差異顯著(P<0.05)。

2.3 脫膠效率比較

選取A1、B3、B11、B13和C11這5支菌株進(jìn)行鳳眼蓮脫膠試驗(yàn),經(jīng)過1次脫膠后,鳳眼蓮纖維在不同菌株作用下的分散程度不同,A1菌株處理后的鳳眼蓮莖纖維狀較其他菌株更加明顯,部分莖已成絲狀,其纖維釋放效果明顯優(yōu)于其他菌株。

將鳳眼蓮連續(xù)脫膠3次,計(jì)算3次脫膠的累計(jì)減重率,結(jié)果見圖2。A1菌株第1次脫膠的減重率顯著高于其他菌株,其1次脫膠率可達(dá)33.37%。這與A1菌株具有較高的木聚糖酶和果膠酶酶活性有關(guān)。在累計(jì)3次脫膠后,A1菌株的脫膠速率變緩,而木聚糖酶活性較低的C11菌株脫膠速率有所上升。但3次脫膠后,A1菌株脫膠減重率始終最高,達(dá)到49.26%。楊丹等[13]研究表明,在最佳條件下篩選得到的脫膠菌對苧麻膠質(zhì)的1次去除率為25.94%。與之相比,筆者研究中的A1菌株脫膠較為高效,對鳳眼蓮生物脫膠具有極大的潛力。

圖2 不同菌株處理鳳眼蓮莖的累計(jì)減重率Fig.2 Cumulative weight loss rate of Eichhornia crassipes stem treated by different strains

2.4 菌株的鑒定

將A1菌株進(jìn)行革蘭染色,于顯微鏡下觀察,其染色結(jié)果為紫色,顯示為革蘭陽性,細(xì)菌為短桿狀。

通過GenBank中的基因序列對比,A1菌株與解淀粉芽孢桿菌MPA1034(Bacillusamyloliquefaciensstrain MPA 1034)、解淀粉芽孢桿菌亞種植物乳桿菌FZB 42(Bacillusamyloliquefacienssubsp.Plantarumstrain FZB 42)、殺線蟲劑芽孢桿菌(Bacillusnematocidastrain B-16)等十幾株菌株序列的相似性分別高達(dá)99%,選取同源性較高的6株菌株構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。從圖3可以看出,A1菌株與Bacillusamyloliquefacienssubsp.Plantarumstrain FZB42(登錄號為NR 075005.1)同源性最高。可初步判定A1屬于解淀粉芽孢桿菌屬(Bacillusamyloliquefaciens)。報(bào)道顯示,解淀粉芽孢桿菌與枯草桿菌親緣性極大,可以通過分泌胞外酶或酯肽類物質(zhì)有效抑制細(xì)菌及真菌,促進(jìn)丁草胺的降解[23]。翟秋梅等[24]從羅布麻表皮中篩選出一株枯草芽孢桿菌(BacillussubtilisFM208849),對羅布麻有良好的脫膠效果。于麗萍等[25]從漚麻液中得到一株枯草芽孢桿菌(BacillussubtilisHW201),可在達(dá)到傳統(tǒng)工藝漚麻效果的同時(shí)降低漚麻周期。吳皓瓊等[26]對枯草芽孢桿菌(BacillussubtilisHW201)漚麻條件進(jìn)行了優(yōu)化,證實(shí)該菌在漚麻過程中有脫膠能力。解淀粉芽孢桿菌與枯草桿菌親緣關(guān)系較為接近,因此解淀粉芽孢桿菌中極有可能攜帶類似枯草芽孢桿菌中脫膠酶的基因。李超等[27]從富營養(yǎng)化水中分離得到一株解淀粉芽孢桿菌DC1,具有溶藻能力,可以通過分泌胞外物質(zhì)使魚腥藻長鏈聚集成團(tuán)后斷裂,進(jìn)而溶解藻細(xì)胞。這些研究間接表明解淀粉芽孢桿菌可以分泌出某種破壞植物細(xì)胞壁的物質(zhì),這對于植物細(xì)胞壁中纖維素等可利用成分的釋放具有重要意義。

圖3 A1菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of Strain A1

3 結(jié)論

(1)從鳳眼蓮生長的池塘底泥中分離得到一株高效的鳳眼蓮脫膠菌,經(jīng)16S rRNA鑒定，該菌株為解淀粉芽孢桿菌。

(2)控制溫度為35 ℃,接種率為4%,pH值為7.0,振蕩速率為145 r·min-1條件下,A1菌株的最佳脫膠周期為72 h。

(3)A1菌株為比較理想的鳳眼蓮脫膠菌,其1次脫膠減重率可達(dá)33.37%,連續(xù)3次累計(jì)脫膠的減重率可達(dá)49.26%。

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(責(zé)任編輯： 許 素)

Screening and Identification of an Efficient Strain of Bacteria DegummingEichhorniacrassipes.

YANGQing1,2,ZHANGChao-qi1,MALi-xiao1,ZHOUWen-bing1,2,ZHUDuan-wei1,2,ZHOUYi-yong3,XIAONai-dong1,2

(1.Laboratory of Eco-Environmental Engineering Research, Microelement Research Center, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China;2.The Cooperative Innovation Center for Sustainable Pig Production of Hubei Province, Wuhan 430070, China;3.State Key Laboratory of Freshwater Ecology and Biotechnology, Wuhan 430072, China)

Pretreatment is the most expensive and critical step of converting biomass into energy, while biological pretreatment has attracted extensive attention for its environmental friendliness and low energy consumption. In order to find a bacteria efficient for use in biological pretreatment, degumming efficiency was chosen as the scale for strain screening. A strain, coded as A1, was isolated from the environmental media whereEichhorniacrassipesgrew through enrichment culture and primary screening with the Congo red plate staining method, and tested to be a strain quite efficient in degumming water hyacinth. Under the optimal conditions, Strain A1could secrete pectinase, xylanase and cellulase as high as 3 925.00, 8 331.67 and 4 883.62 nmol·s-1·mL-1, respectively, in activity. When used in pretreatment, it could reduce the weight of water hyacinth by 33.37% through one round of degumming, and cumulatively by 49.26% after three rounds of degumming. The strain was identified asBacillusamyloliquefaciensby means of 16S rRNA sequencing and phylogenetic tree analysis.

degumming;Eichhorniacrassipes; screening;Bacillusamyloliquefaciens

2016-07-11

中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)(2014PY061，2015BQ013，2016PY049)；武漢市關(guān)鍵技術(shù)攻關(guān)計(jì)劃(2015020202010126)；教育部留學(xué)回國人員科研啟動基金；國家水體污染控制與治理科技重大專項(xiàng)(2012ZX07104-001)；淡水生態(tài)與生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題(2016FB19)

X172

A

1673-4831(2017)03-0275-06

10.11934/j.issn.1673-4831.2017.03.012

楊慶(1991—),女,湖北孝感人,碩士生,研究方向?yàn)檗r(nóng)業(yè)固體廢棄物資源化利用。E-mail: jyq805@126.com

① 通信作者E-mail: zhouwb@mail.hzau.edu.cn