崔榮榮 何奕騉 郭琪琦

（1首都師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 北京 100048 2深圳市第二實(shí)驗(yàn)學(xué)校 廣東深圳 518021）

細(xì)胞膜又稱細(xì)胞質(zhì)膜，是指圍繞在細(xì)胞最外層，主要由脂類和蛋白質(zhì)組成的一層極薄的膜。細(xì)胞膜不僅是細(xì)胞結(jié)構(gòu)的邊界，使細(xì)胞具有一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的內(nèi)部環(huán)境，同時(shí)在細(xì)胞與環(huán)境進(jìn)行物質(zhì)運(yùn)輸、能量轉(zhuǎn)換，以及信息傳遞過程中也起著決定性的作用。細(xì)胞膜是細(xì)胞與周圍環(huán)境進(jìn)行選擇性物質(zhì)交換的屏障與通路[1］?？梢哉f認(rèn)識(shí)整個(gè)細(xì)胞乃至生命體從細(xì)胞膜開始。

細(xì)胞膜是選擇透過性膜，大分子物質(zhì)不能通過活細(xì)胞膜。細(xì)胞膜控制物質(zhì)進(jìn)出這一重要功能，在高中生物學(xué)概念體系中非常關(guān)鍵，有利于學(xué)生理解細(xì)胞膜的選擇透過性這一重要概念，同時(shí)幫助學(xué)生理解細(xì)胞膜是系統(tǒng)的邊界。中學(xué)教師和學(xué)生對(duì)于臺(tái)盼藍(lán)試劑有所耳聞，“臺(tái)盼藍(lán)拒染實(shí)驗(yàn)”也多次作為高中試題的考查材料，但具體實(shí)驗(yàn)過程和實(shí)驗(yàn)結(jié)果并未見相關(guān)報(bào)道。同時(shí)實(shí)驗(yàn)中需要運(yùn)用活細(xì)胞系，由于一般學(xué)校沒有細(xì)胞培養(yǎng)室，單個(gè)的動(dòng)物活細(xì)胞不便于培養(yǎng)和獲取。筆者運(yùn)用高校資源，根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康母倪M(jìn)了大學(xué)教材中 “臺(tái)盼藍(lán)拒染實(shí)驗(yàn)”，通過實(shí)證研究設(shè)計(jì)并記錄實(shí)驗(yàn)過程，展示具體直觀的過程與結(jié)果，填補(bǔ)了高中教材中大分子物質(zhì)不能隨意進(jìn)出細(xì)胞膜的實(shí)驗(yàn)空缺，為細(xì)胞膜控制物質(zhì)尤其是大分子物質(zhì)進(jìn)出提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，驗(yàn)證了活細(xì)胞膜具有控制物質(zhì)進(jìn)出細(xì)胞的功能，為高中教師開展教學(xué)提供教學(xué)參考資料。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 主要試劑 濃度0.4%臺(tái)盼藍(lán)50 mL。臺(tái)盼藍(lán)（Trypan Blue）或稱臺(tái)盼蘭、錐蟲藍(lán)、曲利苯藍(lán)。分子式：C34H24N6O14S4Na4，分子量:960.82，屬于大分子物質(zhì)，無法隨意進(jìn)出活細(xì)胞膜。因此它可以作為細(xì)胞活性染料，常用于檢測(cè)細(xì)胞膜的完整性[3］。一般細(xì)胞膜完整性發(fā)生改變，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡。因此臺(tái)盼藍(lán)也常用于檢測(cè)細(xì)胞是否存活?；罴?xì)胞不會(huì)被染成藍(lán)色，而死細(xì)胞會(huì)被染成淡藍(lán)色。冰甲醇：－20℃預(yù)冷的濃度100%的甲醇，常被用作細(xì)胞固定液。通過結(jié)合蛋白質(zhì)形成沉淀，使得蛋白質(zhì)發(fā)生不可逆轉(zhuǎn)變性，從而改變細(xì)胞膜的通透性，同時(shí)固定保持細(xì)胞形態(tài)，便于染色觀察。由于蒸餾水不能調(diào)節(jié)鹽平衡，會(huì)破壞生物蛋白的結(jié)構(gòu)及生物特性，生理鹽水不能調(diào)整pH，對(duì)完整的、具有活性的物質(zhì)不能保證其在最適條件下參與生物反應(yīng)，而磷酸緩沖鹽溶液（PBS）具有鹽平衡、可調(diào)整的適宜pH緩沖作用，一般用PBS稀釋有活性的生物制劑。本實(shí)驗(yàn)用PBS作為沖洗液。

1.2 細(xì)胞株及常規(guī)培養(yǎng) 骨肉瘤細(xì)胞株 （U-2OS），由首都師范大學(xué)生科學(xué)動(dòng)物細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室提供。該細(xì)胞的特點(diǎn)是細(xì)胞核大，細(xì)胞形態(tài)圓潤，實(shí)驗(yàn)效果明顯。接種細(xì)胞之前在培養(yǎng)孔里加入蓋玻片，將細(xì)胞接種于蓋玻片上，使細(xì)胞在蓋玻片上貼壁培養(yǎng)，這樣設(shè)計(jì)便于實(shí)驗(yàn)處理之后，直接將蓋玻片扣在載玻片上進(jìn)行制片觀察。在培養(yǎng)孔中加入血清和雙抗的高糖DMEM培養(yǎng)基，37℃，CO2培養(yǎng)濃度為5%，培養(yǎng)密度 5×105，培養(yǎng)24 h。單層細(xì)胞均勻覆蓋在蓋玻片表面，細(xì)胞狀態(tài)健康。

2 實(shí)驗(yàn)步驟

2.1 冰甲醇固定壞死處理 用壓力泵吸除骨肉瘤細(xì)胞培養(yǎng)基后，PBS清洗殘留培養(yǎng)基。將載有細(xì)胞的蓋玻片分為左、右2個(gè)部分，左邊細(xì)胞作為對(duì)照組，保持活性；右邊作為實(shí)驗(yàn)組，用一小滴冰甲醇處死并固定細(xì)胞，時(shí)間控制在5 s即可，用PBS沖洗2～3遍，盡量不污染活細(xì)胞。

2.2 貼壁細(xì)胞的原位臺(tái)盼藍(lán)染色實(shí)驗(yàn) 吸除培養(yǎng)盤中多余的PBS，在蓋玻片左右2個(gè)部分都滴加臺(tái)盼藍(lán)，完全覆蓋細(xì)胞，同時(shí)進(jìn)行染色，室溫染色約3 min即可，吸除臺(tái)盼藍(lán)，用PBS沖洗染料2～3次。立即制作裝片觀察并拍照。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

3.1 結(jié)果 未經(jīng)冰甲醇處理的細(xì)胞，細(xì)胞膜完整，不能被臺(tái)盼藍(lán)染色（見圖1，本文附圖見插頁2）；經(jīng)過冰甲醇處理的細(xì)胞，細(xì)胞膜喪失完整性，被臺(tái)盼藍(lán)染成藍(lán)色（見圖2）。圖3則顯示了實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組對(duì)照實(shí)驗(yàn)交界處，對(duì)比明顯（圖1～圖3均為物鏡40倍下觀察，圖片比例尺20 μm）。

3.2 討論 經(jīng)過冰甲醇處理，細(xì)胞膜的通透性變大，失去控制物質(zhì)進(jìn)出的能力，大分子物質(zhì)臺(tái)盼藍(lán)進(jìn)入細(xì)胞，使得細(xì)胞染上藍(lán)色。未經(jīng)冰甲醇處理的細(xì)胞，細(xì)胞膜完整，臺(tái)盼藍(lán)分子不能進(jìn)入染色。

此次動(dòng)物細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的創(chuàng)新之處在于借鑒了傳統(tǒng)的臺(tái)盼藍(lán)拒染實(shí)驗(yàn)中試劑的使用，但在此基礎(chǔ)上大膽進(jìn)行了改進(jìn)，尤其是在實(shí)驗(yàn)操作和新試劑的使用方面。實(shí)驗(yàn)試劑濃度和實(shí)驗(yàn)時(shí)間經(jīng)過多次摸索得出，可重復(fù)。實(shí)驗(yàn)優(yōu)點(diǎn)在于：

1）未將貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞用胰蛋白酶消化下來，直接在細(xì)胞貼壁原位進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。原實(shí)驗(yàn)胰蛋白酶消化細(xì)胞會(huì)對(duì)細(xì)胞的活性有很大影響，酶反應(yīng)的時(shí)間不可控，時(shí)間過短消化出的細(xì)胞較少。時(shí)間較長，對(duì)細(xì)胞有毒性作用，會(huì)破壞細(xì)胞膜上的糖蛋白，導(dǎo)致細(xì)胞死亡過多，影響實(shí)驗(yàn)效果。

2）創(chuàng)造性地運(yùn)用冰甲醇固定液，破碎細(xì)胞膜同時(shí)固定死細(xì)胞。原臺(tái)盼藍(lán)染色實(shí)驗(yàn)，破膜嚴(yán)重的細(xì)胞多次沖洗后會(huì)飄走，原位實(shí)驗(yàn)不改變細(xì)胞的位置，直接處理，操作簡(jiǎn)便，效果明顯。

3）將細(xì)胞直接種植在蓋玻片上，并根據(jù)對(duì)照原則將蓋玻片上長勢(shì)相同的細(xì)胞分為左、右2個(gè)部分，一部分做破膜處理，一部分保持活性，同時(shí)染色，顯微鏡下直接對(duì)比，結(jié)果更明顯。

4）在細(xì)胞染色后用重懸液PBS進(jìn)行漂洗，洗去浮色后，在顯微鏡下觀察，這個(gè)步驟優(yōu)化了臺(tái)盼藍(lán)拒染實(shí)驗(yàn)。原實(shí)驗(yàn)在觀察細(xì)胞染色情況時(shí)，直接吸取混有臺(tái)盼藍(lán)溶液的細(xì)胞液，直接觀察，視野整體藍(lán)色，不利于觀察細(xì)胞染色情況。

實(shí)驗(yàn)的不足在于實(shí)驗(yàn)所用的細(xì)胞材料不易獲得；同時(shí)細(xì)胞在脫離了適宜的培養(yǎng)環(huán)境時(shí)，死亡較快，因此對(duì)實(shí)驗(yàn)者的操縱技能要求較高。鑒于實(shí)驗(yàn)結(jié)果明顯，可以為中學(xué)教師教學(xué)提供參考。