徐鑫

摘要 以新?lián)P州雞為素材，用膠原酶/透明質(zhì)酸酶和各梯度濃度的Percoll液的方法分離子宮陰道交接處（UVJ）的貯精腺細(xì)胞并進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)以達(dá)到細(xì)胞純化的目的，旨在建立雞貯精腺細(xì)胞純化分離和培養(yǎng)技術(shù)，為進(jìn)一步研究和分析貯精腺的構(gòu)造和功能，以及調(diào)控機(jī)理的研究提供技術(shù)平臺(tái)。結(jié)果表明：用膠原酶/透明質(zhì)酸酶分離培養(yǎng)，消化45 min，100目過(guò)濾的貯精腺細(xì)胞用Percoll液原代培養(yǎng)至少存活120 h，細(xì)胞的純化效果很明顯。

關(guān)鍵詞 新?lián)P州雞；Percoll液；透明質(zhì)酸酶；貯精腺；純化；細(xì)胞培養(yǎng)

中圖分類號(hào) Q50 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-5739（2017）04-0233-01

動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)開(kāi)始于20世紀(jì)初，到1962年規(guī)模開(kāi)始擴(kuò)大，發(fā)展至今已成為醫(yī)學(xué)、生物研究和應(yīng)用中廣泛采用的技術(shù)方法，具有重要醫(yī)用價(jià)值的酶、生長(zhǎng)因子、疫苗和單抗等可通過(guò)利用動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)，這已成為醫(yī)藥生物高技術(shù)產(chǎn)業(yè)的重要部分[1]。

動(dòng)物細(xì)胞雖可像微生物細(xì)胞一樣，在人工控制條件的生物反應(yīng)器中進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)，但其細(xì)胞結(jié)構(gòu)和培養(yǎng)特性與微生物細(xì)胞相比有顯著差別：①動(dòng)物細(xì)胞比微生物細(xì)胞大得多，無(wú)細(xì)胞壁，機(jī)械強(qiáng)度低，對(duì)剪切力敏感，適應(yīng)環(huán)境能力差；②培養(yǎng)過(guò)程需氧量少；③倍增時(shí)間長(zhǎng)，生長(zhǎng)緩慢，易受微生物污染，培養(yǎng)時(shí)須用抗生素；④原代培養(yǎng)細(xì)胞一般繁殖50代即退化死亡；⑤培養(yǎng)過(guò)程中細(xì)胞相互粘連以集群形式存在；⑥代謝產(chǎn)物具有生物活性，生產(chǎn)成本高，但附加值也高[1-5]。

Percoll是一種包有乙烯吡咯烷酮的硅膠顆粒。滲透壓很低（<20 mosm/kg H2O），黏度也很小，可形成高達(dá)1.3 g/mL密度，采用預(yù)先形成的密度梯度時(shí)可在低離心力[（200～1 000）g]于數(shù)分鐘至數(shù)十分鐘內(nèi)達(dá)到滿意的細(xì)胞分離結(jié)果[6-9]。由于Percoll擴(kuò)散常數(shù)低，所形成的梯度十分穩(wěn)定[10-15]。此外，Percoll不穿透生物膜，對(duì)細(xì)胞無(wú)毒害，因而廣泛用于分離細(xì)胞、亞細(xì)胞成分、細(xì)菌及病毒，還可將受損細(xì)胞及其碎片與完好的活細(xì)胞分離[16]。

家禽輸卵管由漏斗部、膨大部、峽部、子宮部和陰道部組成[11]，陰道部較短，呈“S”狀彎曲，其中子宮陰道交接部存在一種特殊的管狀腺，該腺體由單層柱狀上皮細(xì)胞構(gòu)成，腺管細(xì)胞頂部無(wú)纖毛，細(xì)胞核排列整齊，位于細(xì)胞的基部，因精子在此貯存而被稱為貯精腺[12]，貯精腺的存在使禽類精子在輸卵管內(nèi)可以長(zhǎng)期存活，一般為2～3周，并能長(zhǎng)時(shí)間保持受精能力[12-13]。本次試驗(yàn)用新?lián)P州雞為素材，用膠原酶/透明質(zhì)酸酶消化分離子宮陰道交接處（UVJ）的貯精腺細(xì)胞[16-19]，并用各梯度濃度的Percoll液純化貯精腺細(xì)胞，旨在建立雞貯精腺細(xì)胞純化分離和培養(yǎng)技術(shù)，為貯精腺調(diào)控機(jī)理的研究提供技術(shù)平臺(tái)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)選用4只處于盛產(chǎn)期的新?lián)P州雞貯精腺為素材，采用膠原酶/透明質(zhì)酸酶消化分離子宮陰道交接處（UVJ）的貯精腺細(xì)胞，并用各梯度濃度的Percoll液純化貯精腺細(xì)胞[20-24]。

試驗(yàn)儀器和試驗(yàn)試劑有無(wú)菌室和無(wú)菌操作臺(tái)，體視顯微鏡，天平（稱量所取組織或黏膜），離心機(jī)，臺(tái)式天平（離心時(shí)平衡用），鋁盒1個(gè)（盛器皿），大瓷盤(pán)1個(gè)（采樣用），小瓷盤(pán)1個(gè)（裝冰用），大剪刀1把（剖雞），解剖剪2把（剪子宮陰道部），解剖刀2把，眼科剪2把（將組織剪成小塊），小鑷子4 把，小培養(yǎng)皿6個(gè)，西林瓶6個(gè)，廢液瓶1個(gè)（500 mL燒杯代替），100目過(guò)濾篩1個(gè)，0.1%明膠預(yù)處理過(guò)的4孔細(xì)胞培養(yǎng)板若干個(gè)，吸管20支，50～100 mL三角瓶（或稱錐形瓶）2個(gè)，10 mL試管2個(gè)（套帽），紅血球計(jì)數(shù)板，載玻片，蓋玻片，1 000、100、10 μL槍各1把，10 mL試管8個(gè)（套帽）。膠原酶/透明質(zhì)酸酶無(wú)菌PBS（pH值7.2～7.4），DMEM 培養(yǎng)液，滅活血清，酒精棉，慶大霉素1支，臺(tái)盼藍(lán)染液。各梯度濃度的 Percoll。

1.2 試驗(yàn)方法

膠原酶/透明質(zhì)酸酶、培養(yǎng)液DMEM、碎冰入無(wú)菌室內(nèi)，無(wú)菌室和無(wú)菌操作臺(tái)用紫外線消毒0.5～1.0 h。酒精棉消毒大瓷盤(pán)、大剪刀、鑷子、解剖剪各1把入解部室，用時(shí)再酒精燈消毒。慶大霉素1支（80萬(wàn)U）入消過(guò)毒的PBS。雞固定于大瓷盤(pán)，大剪刀剖1只雞腹，暴露生殖道，用鑷子夾住子宮陰道部，解剖剪剪下UVJ入含PBS的培養(yǎng)皿。縱剖UVJ，并縱向分成2個(gè)部分，入無(wú)菌室。洗滌入另一PBS培養(yǎng)皿，去結(jié)締組織。無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)解剖剪剪碎，入含PBS培養(yǎng)皿。無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)將樣品、吸管用酒精燈消毒。用吸管吹打樣品管，吸PBS入廢液瓶。換吸管并用酒精燈消毒。用吸管加膠原酶/透明質(zhì)酸酶20 mL入三角瓶，加5 mL DMEM。置37 ℃水浴鍋內(nèi)振蕩消化45 min，入碎冰盤(pán)終止消化。同時(shí)做4個(gè)梯度離心管：滅活血清將10 mL離心管潤(rùn)洗1次，每個(gè)離心管用1 000 μL槍依次取1 mL 70%、60%、50%、40%、30%、20%、15%的Percoll液入10 mL離心管（注意離心管內(nèi)Percoll液體從底部至頂部依次從高濃度到低濃度，各層不得相互混合）。100目過(guò)濾入三角瓶，吸管吸入10mL離心管，蓋帽，1 000 r/min 7～8 min，灑精棉擦離心管外壁四周，無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)消毒試管，上清液入廢液瓶，換吸管并用酒精燈消毒[25-26]。下層細(xì)胞用DMEM稀釋（用1 mL槍吸DMEM培養(yǎng)基入試管，總用量為5 mL）。先取DMEM入1個(gè)試管，吸打并移入另一試管，兩者混合吹打均勻成細(xì)胞懸液。在4個(gè)梯度離心管頂層加1 mL分離的細(xì)胞液，蓋帽。從超凈臺(tái)內(nèi)取出。以1 400～2 500 r/min離心25 min。100 μL槍收集每層細(xì)胞置10 mL離心管，加5倍（下轉(zhuǎn)第236頁(yè)）

（上接第233頁(yè)）

體積PBS洗滌，以1 000 r/min離心10 min。重復(fù)洗滌1次。加1 mL DMEM重懸細(xì)胞。用槍取10 μL細(xì)胞至載玻片，用體視顯微鏡觀察，照相；10 μL樣于10 μL 0.4%臺(tái)盼藍(lán)染色，計(jì)數(shù)死活細(xì)胞數(shù)。 細(xì)胞原液、各層純化的細(xì)胞調(diào)整密度至3×106個(gè)/mL，4孔培養(yǎng)板培養(yǎng)。板孔底部最好不要有氣泡，可用吸管將氣泡吸出，蓋上瓶蓋。標(biāo)記日期及樣品名稱，移至38.5 ℃的CO2培養(yǎng)箱，進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。

2 結(jié)果與分析

試驗(yàn)結(jié)果表明，膠原酶/透明質(zhì)酸酶，Percoll液純化分離，消化45 min，100目過(guò)濾的貯精腺細(xì)胞的細(xì)胞純度很高（圖1），基本都是所需要的細(xì)胞，細(xì)胞數(shù)目多，完整性好，貼壁效果好，比沒(méi)用Percoll液分離的效果更加明顯更清楚，更加有利于進(jìn)一步分離培養(yǎng)。

3 結(jié)論與討論

密度梯度離心技術(shù)是早期應(yīng)用的一種細(xì)胞分離、純化的方法，是Brakke于1951年提出來(lái)的，其基本原理是利用離心溶液介質(zhì)所形成的密度梯度來(lái)維持重力的穩(wěn)定性和抑制對(duì)流，待分離顆粒的密度在離心溶液的梯度柱密度范圍內(nèi)，經(jīng)過(guò)一定時(shí)間離心后，不同密度的顆粒分別集中在離心溶液某密度帶上而得以分離[16]。Percoll細(xì)胞分離液是一質(zhì)優(yōu)的分離介質(zhì)，與Ficoll相比其黏度低、穩(wěn)定，對(duì)細(xì)胞無(wú)毒害作用，顆粒大易于從細(xì)胞表面洗脫下來(lái)，更重要的是Percoll在高速離心（>10 000 r/min）時(shí)可產(chǎn)生連續(xù)梯度，利用這一特點(diǎn)先處理細(xì)胞懸濁液，光鏡下幾乎沒(méi)見(jiàn)到細(xì)胞間的聚集。Percoll液顆粒大小不一，離心后可形成一定的密度梯度，不同密度的細(xì)胞分布于不同密度的層內(nèi)，借此可將貯精腺細(xì)胞和雜細(xì)胞及細(xì)胞碎片分離。本試驗(yàn)利用Percoll密度梯度離心法快速穩(wěn)定，而且便于提純和體外培養(yǎng)，細(xì)胞成活率高，取得了比較滿意的效果。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，用Percoll細(xì)胞分離液和膠原酶/透明質(zhì)酸酶分離貯精腺細(xì)胞的效果非常明顯，純度很高，并且分離出的細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)的效果也很好，這2種試劑組合有利于細(xì)胞的分離培養(yǎng)，為進(jìn)一步研究貯精腺的機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。

4 參考文獻(xiàn)

[1] 司徒鎮(zhèn)強(qiáng)，吳軍正.細(xì)胞培養(yǎng)[M].北京：興界圖書(shū)出版社，1996：65-68.

[2] 鄂征.組織培養(yǎng)和分子細(xì)胞學(xué)技術(shù)[M].北京：北京出版社，1995：83.

[3] 黃蘭蘭，石國(guó)慶.影響動(dòng)物細(xì)胞體外培養(yǎng)因素[J].黑龍江動(dòng)物繁殖，2005，13（6）：17-29.

[4] 尹衛(wèi)忠，張敏.家禽陰道腺貯精機(jī)制的研究Ⅰ家禽陰道腺的組織學(xué)[J].塔里木農(nóng)墾大學(xué)學(xué)報(bào)，1995，7（1）：24-27.

[5] BOBR L W，LORENZ FW，OGASAWARA F X.Distribution of sperma-tozoa in the oviduct and fertility in domestic birds[J].Journal of Reprodu-ction and Fertility，1963，8：39-47.

[6] BAKST M R.Observatons on the turkey oviductal sperm storage tubule using differential interference contrast microscopy[J].Journal of Reprodu-ction and Fertility，1992，95：877-883.

[7] RENDEN J A，MAY E B，BENOFF F H.Histochemistry of uterovaginal sperm host glands in Japanese quail（Coturnix coturnix japonical）with reference to the period of oviposition[J].Poult.Sci，1981，60：2529-2535.

[8] GIST D H，JEFFERY M J.Sperm storage within the oviduct of turtles [J].Morphol，1989，199：379-384.

[9] KUMARI T R S，SARKAR HBD，SHIVANANDAPPA T.Histology and histochem-istry of the oviductal sperm storage pockets of the agamid lizard Calotes versicolor[J].Morphol，1990，203：97-106.

[10] RACEY P A.The prolonged storage and survival of spermatozoa in Chir-optera[J].Journal of Reproduction and Fertility，1979，569（1）：391-402.

[11] 尹衛(wèi)忠，張敏.家禽陰道腺貯精機(jī)制的研究Ⅱ家禽陰道腺的組織化學(xué)[J].塔里木農(nóng)墾大學(xué)學(xué)報(bào)，1995，7（2）：17-20.

[12] 張梅芬，趙翔，翁笑艷.金絲雀輸卵管內(nèi)貯精腺體的組織學(xué)及組織化學(xué)的研究[J].動(dòng)物學(xué)研究，1997，18（1）：105-111.

[13] 陳巖，王琨，朱大海.雞骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的分離培養(yǎng)、鑒定及生物學(xué)特性研究[J].遺傳，2006，28（3）：257-260.

[14] 趙翔，張梅芬.番鴨輸卵管內(nèi)貯精腺體超微結(jié)構(gòu)的觀察[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，1997，28（6）：511-516.

[15] 白薩日娜，曹貴方，唐博.綿羊輸軟管上皮細(xì)胞的分離與培養(yǎng)[J].畜牧與飼料科學(xué)，2006（4）：15-17.

[16] 韓曼，朱曉云，劉喜明.Ficoll及Percoll分離、純化金黃地鼠肝細(xì)胞方法比較研究[J].世界中西醫(yī)結(jié)合雜志，2012（10）：843-845.

[17] 顏秉陽(yáng)，殷國(guó)強(qiáng)，張志培，等.肺腺癌胸水腫瘤細(xì)胞分離與體外懸浮培養(yǎng)及鑒定[J].現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué)，2012（9）：1844-1848.

[18] 吳盼盼.幼豬肺泡上皮和血管內(nèi)皮祖細(xì)胞分離培養(yǎng)技術(shù)探討[D].上海：復(fù)旦大學(xué)，2009.

[19] 馬金友.動(dòng)物寄生蠕蟲(chóng)的生物學(xué)與流行學(xué)的比較研究[D].廈門(mén)：廈門(mén)大學(xué)，2007.

[20] 張高峰，郭彤，魏華，等.采用Percoll法分離、純化鯽肝細(xì)胞[J].中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)，2007（2）：208-214.

[21] 鄭連文，王曄玲，張慕淳，等.Percoll離心聯(lián)合多步差異黏附法分離、純化人睪丸精原細(xì)胞[J].中國(guó)老年學(xué)雜志，2007（2）：117-119.

[22] 張玉石，李漢忠，張銳強(qiáng)，等.應(yīng)用Percoll分離純化組織工程用肌衛(wèi)星細(xì)胞[J].中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院學(xué)報(bào)，2006（2）：182-185.

[23] 鄔于川，凌體淑，劉玉林，等.應(yīng)用Percoll分離純化NK細(xì)胞[J].瀘州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2000（2）：102-104.

[24] 鄭茂榮，范青源，謝勇，等.Percoll密度梯度離心技術(shù)分離純化豚鼠表皮Langerhans細(xì)胞[J].中華皮膚科雜志，1995（5）：296-298.

[25] 邢蕾，鄧昌彥，鄭嶸，等.新生豬肌組織成纖維細(xì)胞的分離培養(yǎng)和鑒定[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，2008（2）：18-20.

[26] 邢蕾.新生豬肌組織成纖維細(xì)胞系和耳部皮膚成纖維細(xì)胞系的建立[D].武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2007.