劉 歡， 楊金芳， 張姍姍， 劉 望， 陳雪峰， 張谷芬

(1.陜西科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院， 陜西 西安 710021； 2.第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院 全軍感染病診療中心， 陜西 西安 710038)

Qrr1對(duì)溶藻弧菌不同生理功能及毒力的調(diào)控研究

劉 歡1， 楊金芳1， 張姍姍1， 劉 望1， 陳雪峰1， 張谷芬2

(1.陜西科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院， 陜西 西安 710021； 2.第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院 全軍感染病診療中心， 陜西 西安 710038)

溶藻弧菌是我國(guó)海水產(chǎn)養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)的重要病原菌，造成水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失.利用生物信息學(xué)手段，在溶藻弧菌體內(nèi)篩選得到群體感應(yīng)調(diào)控sRNA分子，即Qrr1，并對(duì)其進(jìn)行了克隆和無(wú)標(biāo)記框內(nèi)突變株的構(gòu)建，鑒定其在溶藻弧菌生理功能中所發(fā)揮的作用.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：Qrr1對(duì)溶藻弧菌對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期及穩(wěn)定期的生長(zhǎng)具有顯著的促進(jìn)作用.此外，Δqrr1缺失株的運(yùn)動(dòng)性幾乎完全喪失，生物被膜形成能力下降，胞外蛋白酶產(chǎn)量降低，可見(jiàn)，Qrr1對(duì)溶藻弧菌的毒力亦具有重要的調(diào)控作用.

Qrr1; 溶藻弧菌; 生理功能； 毒力

0 引言

溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)是一種重要的水產(chǎn)養(yǎng)殖病原菌，廣泛存在于世界各地，可感染多種魚(yú)類(lèi)和貝類(lèi)，因其感染所導(dǎo)致的細(xì)菌性敗血癥給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1,2].此外，溶藻弧菌還能感染人類(lèi)，通過(guò)受污染的海鮮類(lèi)食品的食用而導(dǎo)致腸胃炎的發(fā)生，亦可通過(guò)皮膚和耳朵感染，危害人類(lèi)健康.深入研究溶藻弧菌致病性分子調(diào)控機(jī)理對(duì)于其預(yù)防和控制顯得尤為必要.

溶藻弧菌的毒力因子包括胞外蛋白酶、生物被膜、運(yùn)動(dòng)性等，主要受群體感應(yīng)系統(tǒng)及sRNA分子伴侶蛋白Hfq的調(diào)控[3-8].Hfq最初是作為噬菌體在大腸桿菌中進(jìn)行復(fù)制所必需的內(nèi)源性宿主蛋白被鑒定的.隨后對(duì)Hfq進(jìn)行缺失分析發(fā)現(xiàn)，該蛋白參與大腸桿菌的生長(zhǎng)、細(xì)胞分裂、滲透壓的響應(yīng)等生理調(diào)控[9].隨后，在多種細(xì)菌體內(nèi)均鑒定到Hfq蛋白,并作為轉(zhuǎn)錄后全局調(diào)控因子對(duì)細(xì)菌的生理功能發(fā)揮調(diào)控作用[10].Hfq主要作為一類(lèi)非編碼的sRNA分子伴侶蛋白發(fā)揮其調(diào)控作用.sRNA是廣泛存在于細(xì)菌體內(nèi)的一類(lèi)非編碼的起調(diào)控作用的RNA，大小為60～300個(gè)堿基.sRNA能夠被快速合成，在分子伴侶蛋白Hfq的協(xié)同作用下，通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)作用與不同的靶標(biāo)mRNA分子結(jié)合，影響其穩(wěn)定性或翻譯活性，實(shí)現(xiàn)基因表達(dá)的快速調(diào)控.Hfq形成炸面圈狀的六聚體結(jié)構(gòu)，具有兩個(gè)獨(dú)立的RNA結(jié)合位點(diǎn)表面，一個(gè)位于遠(yuǎn)端面用于Poly(A)尾巴的結(jié)合，另一個(gè)位于近端面用于AU富集區(qū)的結(jié)合.因此，Hfq為RNA分子提供停泊平臺(tái)，促進(jìn)非編碼sRNA與靶標(biāo)mRNA分子之間的相互作用[11-13].目前越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)Hfq及sRNAs對(duì)于許多細(xì)菌的多種生理功能，如生長(zhǎng)特征、環(huán)境應(yīng)激以及毒力等都具有至關(guān)重要的影響，當(dāng)Hfq表達(dá)受損時(shí)，霍亂弧菌、流血嗜血桿菌和小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌等都顯著減毒[14-18].

本研究通過(guò)生物信息學(xué)手段，在溶藻弧菌基因組中篩選得到群體感應(yīng)調(diào)控sRNA分子，即Qrr1，繼而通過(guò)無(wú)標(biāo)記框內(nèi)缺失手段從基因組中缺失qrr1基因，獲得其缺失株并對(duì)其生物學(xué)特性進(jìn)行研究.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

大腸桿菌DH5α、CC118λpir、SM10λpir、溶藻弧菌野生型菌株MVP01、自殺質(zhì)粒pDM4 、互補(bǔ)質(zhì)粒pMMB206均由本實(shí)驗(yàn)室保存.pMD18T購(gòu)自TaKaRa公司.

1.1.2 主要儀器和試劑

恒溫培養(yǎng)箱購(gòu)自上海一恒科學(xué)儀器有限公司；搖床購(gòu)自太倉(cāng)市儀器設(shè)備廠(chǎng)；PCR儀和核酸電泳儀購(gòu)自伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司；凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自上海復(fù)日科技有限公司.

LB培養(yǎng)基購(gòu)自上海生工生物工程有限公司；TaqDNA聚合酶、Pfu高保真聚合酶、DNA分子標(biāo)準(zhǔn)量Marker、DNA回收試劑盒及質(zhì)粒抽提試劑盒購(gòu)自北京天根生化科技有限公司；T4DNA連接酶及限制性?xún)?nèi)切酶購(gòu)自TaKaRa公司.

1.1.3 引物

表1為本研究中使用的引物，參照GenBank上公布的基因序列設(shè)計(jì)，由上海捷瑞生物工程有限公司合成.

表1 實(shí)驗(yàn)中所使用的引物

1.2 方法

1.2.1qrr1基因的克隆與分析

根據(jù)已公布的溶藻弧菌12G01基因組和霍亂弧菌以及哈氏弧菌中的qrr基因序列，利用生物信息學(xué)手段對(duì)其進(jìn)行比對(duì)分析，篩選溶藻弧菌中的群體感應(yīng)調(diào)控sRNA，Qrr1，并利用Mfold對(duì)其進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析(http://unafold.rna.albany.edu/?q=mfold).在此基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)特異性引物對(duì)qrr1基因進(jìn)行克隆.

1.2.2Δqrr1突變株的構(gòu)建

以溶藻弧菌MVP01基因組為模板，以引物qrr1upF和qrr1upR、qrr1doF和qrr1doR分別擴(kuò)增獲得上下游同源臂片段qrr1up和qrr1do.PCR產(chǎn)物經(jīng)回收后，再以qrr1upF和qrr1doR為引物經(jīng)overlap PCR將上下游同源臂片段qrr1up和qrr1do連接起來(lái)，得到Δqrr1片段.隨后通過(guò)雙酶切與自殺質(zhì)粒pDM4連接重組，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌CC118λpir，挑選陽(yáng)性克隆并驗(yàn)證.隨后從正確的陽(yáng)性克隆株中提取重組質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化大腸桿菌SM10λpir，并挑選含有重組質(zhì)粒的陽(yáng)性克隆株，作為供體菌株，與受體菌株溶藻弧菌MVP01進(jìn)行接合，分別利用氨芐青霉素和氯霉素的雙抗正向選擇標(biāo)記及蔗糖方向選擇標(biāo)記，經(jīng)過(guò)兩輪同源重組，獲得經(jīng)PCR及測(cè)序驗(yàn)證正確的框內(nèi)缺失突變株Δqrr1.

1.2.3 互補(bǔ)菌株qrr1+的構(gòu)建

以MVP01基因組為模板，用引物對(duì)qrr1comF和qrr1comR進(jìn)行PCR反應(yīng)，擴(kuò)增得到含有完整qrr1基因ORF區(qū)域及啟動(dòng)子的DNA片段后，克隆至pDM19-T載體中.對(duì)克隆片段進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證確保沒(méi)有發(fā)生基因突變.對(duì)其進(jìn)行質(zhì)粒提取后,通過(guò)限制性?xún)?nèi)切酶酶切后與互補(bǔ)質(zhì)粒pMMB206連接，并轉(zhuǎn)化入宿主菌株大腸桿菌CC118λpir中，菌落PCR驗(yàn)證得到陽(yáng)性克隆.抽提回補(bǔ)質(zhì)粒pMMB-qrr1，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌SM10λpir中，驗(yàn)證得到陽(yáng)性克隆，并以之作為接合供體菌株，將其互補(bǔ)質(zhì)粒pMMB-qrr1接合至受體菌Δqrr1中，得到互補(bǔ)菌株qrr1+.

1.2.4 生長(zhǎng)曲線(xiàn)的測(cè)定

將保存于-80 ℃甘油管中的菌株接種至LBS液體培養(yǎng)基中，30 ℃搖床中200 r/min過(guò)夜復(fù)蘇培養(yǎng).將各菌液用新鮮LBS液體培養(yǎng)基稀釋至OD600為1.0，按1% (v/v)接種至含有50 ml LBS液體培養(yǎng)基的三角瓶中，于30 ℃搖床中200 r/min培養(yǎng)，每1 h取樣并測(cè)定其OD600值，繪制各菌株的生長(zhǎng)曲線(xiàn)，考察生長(zhǎng)特性.

1.2.5 生物被膜檢測(cè)

將過(guò)夜培養(yǎng)的菌株用新鮮的LBS液體培養(yǎng)基稀釋至相同的OD600值.隨后將各菌株接種至含有10 ml LBS液體培養(yǎng)基的干凈無(wú)菌的玻璃試管中，于30 ℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)48 h.每管培養(yǎng)液中添加2% (w/v)結(jié)晶紫溶液，染色5 min后，將培養(yǎng)物全部倒出，自來(lái)水沖洗，每管中添加33% (v/v)冰醋酸溶液，檢測(cè)其在570 nm處的吸光值.

1.2.6 運(yùn)動(dòng)性分析

分別用含有0.3% (w/v)(軟平板)和1.5% (w/v)(硬平板)瓊脂粉的LBS平板測(cè)定各菌株的游動(dòng)性和泳動(dòng)性.將活化后的溶藻弧菌MVP01野生型菌株、Δqrr1突變株和qrr1+互補(bǔ)菌株用新鮮LBS液體培養(yǎng)基稀釋?zhuān)罯D600=1.0，吸取2μL菌液，滴加于平板上，軟平板正置于30 ℃培養(yǎng)箱中，硬平板則倒置培養(yǎng)，至菌落生長(zhǎng)至合適大小后，取出對(duì)其進(jìn)行拍照.

1.2.7 胞外蛋白酶活性分析

定性測(cè)定采用脫脂牛奶平板：將在75 ℃下滅菌15 min的10% (w/v)脫脂奶粉溶液添加至LBS固體培養(yǎng)基中，使其終濃度為1%.將各活化后的菌種稀釋至OD600=1.0，取2μL滴加于牛奶平板上，小心晾干后在30 ℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)，測(cè)量菌落外透明圈的直徑大小.

定量分析方法是測(cè)定添加的天藍(lán)色皮粉(Hide powder azure,HPA)底物被酶解后釋放的可溶性天藍(lán)色染料的量.將各菌株在LBS液體培養(yǎng)基中于30 ℃搖床培養(yǎng)10 h后，離心收集上清液，用0.22μm孔徑的一次性無(wú)菌過(guò)濾器過(guò)濾上清.取出1 mL已過(guò)濾的上清液加入到血清瓶中，再加入1 mL PBS (pH=7.2)以及10 mg HPA，于37 ℃搖床中200 r/min培養(yǎng)2 h.在各管中添加2 mL 10% (w/v) TCA溶液終止反應(yīng)，12 000 g離心5 min后，取適量上清液測(cè)定其在600 nm處的吸光值.

2 結(jié)果與討論

2.1qrr1序列克隆與分析

利用生物信息學(xué)手段，將霍亂弧菌和哈氏弧菌中的qrr1基因序列與已公布的溶藻弧菌12G01全基因組序列進(jìn)行比對(duì)，篩得qrr1基因序列，并以此設(shè)計(jì)引物，以溶藻弧菌MVP01的基因組為模板擴(kuò)增得到qrr1序列.測(cè)序結(jié)果表明，qrr1基因序列長(zhǎng)度為121 bp，且與哈氏弧菌、副溶血弧菌、霍亂弧菌中qrr1基因序列保持較高同源性.利用Mfold在線(xiàn)分析工具對(duì)其轉(zhuǎn)錄RNA進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，Qrr1具有典型的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，在其3′端為多具U尾巴，同時(shí)在莖環(huán)結(jié)構(gòu)間含有伴侶蛋白Hfq假定的結(jié)合位點(diǎn)AU富含區(qū)(如圖1所示).

2.2Δqrr1突變株的構(gòu)建

在克隆得到qrr1基因序列的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步根據(jù)同源交換的原理利用自殺質(zhì)粒得到缺失qrr1基因7-121 位共115 bp的突變株Δqrr1.首先采用菌落PCR的方法，利用位于突變株構(gòu)建片段外側(cè)的引物進(jìn)行驗(yàn)證.結(jié)果表明，Δqrr1突變株中擴(kuò)增獲得的目的片段比野生型中的片段減少了115 bp (如圖2所示).進(jìn)一步將篩得的突變株進(jìn)行基因組抽提，采用相同引物進(jìn)行測(cè)序分析.測(cè)序結(jié)果證明，該突變株中qrr1基因開(kāi)放閱讀框7-121 位堿基的內(nèi)部核苷酸序列被缺失掉.

圖1 Qrr1二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)圖

圖2 Δqrr1突變株P(guān)CR驗(yàn)證電泳圖

2.3qrr1+互補(bǔ)株的構(gòu)建

在突變株的基礎(chǔ)上，利用啟動(dòng)子預(yù)測(cè)軟件Promoter 2.0對(duì)qrr1基因上游序列進(jìn)行分析，將互補(bǔ)片段連接至pMMB206質(zhì)粒中，并接合至Δqrr1突變株中.以引物qrr1comF和qrr1comR對(duì)得到的菌株進(jìn)行PCR驗(yàn)證.結(jié)果表明，在qrr1+互補(bǔ)株中可擴(kuò)增得到相差115 bp的大小兩條片段，即Δqrr1突變株基因組中框內(nèi)缺失片段以及由pMMB206質(zhì)粒上攜帶的帶有啟動(dòng)子區(qū)域的完整的回補(bǔ)片段，證明攜帶有目的片段的回補(bǔ)質(zhì)粒pMMB-qrr1成功接合轉(zhuǎn)移至Δqrr1突變株中(如圖3所示).隨后進(jìn)行質(zhì)粒提取并進(jìn)行測(cè)序分析，進(jìn)一步確證了qrr1+互補(bǔ)株的成功構(gòu)建.

圖3 qrr1+回補(bǔ)菌株P(guān)CR驗(yàn)證電泳圖

2.4 Qrr1對(duì)溶藻弧菌生長(zhǎng)的影響

為了考察Qrr1在溶藻弧菌生長(zhǎng)過(guò)程中所發(fā)揮的作用，分別對(duì)溶藻弧菌野生型菌株和突變株、互補(bǔ)株進(jìn)行生長(zhǎng)曲線(xiàn)的測(cè)定.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：三者都表現(xiàn)出非常短的停滯期，在接種至新鮮培養(yǎng)基2 h后便進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期；野生株在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期中生長(zhǎng)最為迅速，穩(wěn)定期菌體密度達(dá)到OD600 nm=6.0.在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期內(nèi)，突變株與互補(bǔ)株的生長(zhǎng)相比野生型有較明顯的下降；當(dāng)菌株生長(zhǎng)至12 h后便進(jìn)入穩(wěn)定期，而在進(jìn)入穩(wěn)定期后，突變株的生長(zhǎng)達(dá)到與互補(bǔ)株相當(dāng)?shù)乃?，野生型保持較高菌濃(如圖4所示).可見(jiàn)，qrr1基因的缺失對(duì)溶藻弧菌的整個(gè)生長(zhǎng)周期都有影響，對(duì)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的影響最大.同時(shí)，qrr1+互補(bǔ)株在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期內(nèi)較突變株生長(zhǎng)有所提高，間接驗(yàn)證了互補(bǔ)株構(gòu)建的成功.然而，互補(bǔ)株的生長(zhǎng)水平并未能達(dá)到野生型菌株的水平，可能回補(bǔ)質(zhì)粒較高水平的表達(dá)反而對(duì)其自身的表達(dá)存在一定的抑制作用.

圖4 不同菌株的生長(zhǎng)曲線(xiàn)

2.5 Qrr1對(duì)溶藻弧菌運(yùn)動(dòng)性的調(diào)控

為了研究Qrr1對(duì)溶藻弧菌運(yùn)動(dòng)性的調(diào)控作用，本實(shí)驗(yàn)采用含有0.3%和1.5%瓊脂的LBS軟硬平板對(duì)游動(dòng)性和爬動(dòng)性分別進(jìn)行測(cè)定.從圖5可以看出，野生型菌株在30 ℃培養(yǎng)12 h后，在硬平板上具有較為明顯的爬動(dòng)能力，以點(diǎn)樣處為中心向四周一圈圈地爬動(dòng)擴(kuò)散.而Δqrr1突變株的爬動(dòng)能力基本喪失，只是在點(diǎn)樣處進(jìn)行生長(zhǎng)繁殖，未出現(xiàn)菌落擴(kuò)散的現(xiàn)象.野生型菌株在30 ℃ 培養(yǎng)12 h后，在軟平板上顯示出較為明顯的游動(dòng)能力，基本已經(jīng)鋪滿(mǎn)整個(gè)平板.而Δqrr1菌株的游動(dòng)能力幾乎完全喪失，qrr1+互補(bǔ)株表現(xiàn)出較好的回補(bǔ)效果，游動(dòng)能力較突變株有較明顯的提高.可見(jiàn)，Hfq對(duì)于溶藻弧菌的游動(dòng)能力的正向調(diào)控作用主要通過(guò)Qrr1的作用來(lái)實(shí)現(xiàn).

圖5 Qrr1對(duì)溶藻弧菌運(yùn)動(dòng)性的影響

2.6 Qrr1對(duì)溶藻弧菌生物被膜形成的影響

通過(guò)對(duì)不同菌株生物被膜的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：溶藻弧菌野生型在試管中靜置培養(yǎng)48 h后，在試管壁與LBS液體培養(yǎng)基接觸表面可形成肉眼可見(jiàn)的、較厚實(shí)的生物被膜.Δqrr1突變株在相同的培養(yǎng)條件下在固液接觸表面形成的生物被膜則有所減少，而qrr1+互補(bǔ)株生物被膜的形成量雖未能達(dá)到野生型水平，但較突變株有明顯提高.通過(guò)結(jié)晶紫染色分析發(fā)現(xiàn)Δqrr1突變株生物被膜形成量較野生型減少了近50%(如圖6所示).可見(jiàn)，Qrr1對(duì)溶藻弧菌生物被膜的形成具有正調(diào)控作用.

圖6 Qrr1對(duì)溶藻弧菌生物被膜形成能力的影響

2.7 Qrr1對(duì)溶藻弧菌胞外蛋白酶生成的影響

胞外蛋白酶是溶藻弧菌主要毒力因子，分別通過(guò)脫脂牛奶平板和HPA顯色法對(duì)不同菌株胞外蛋白酶活性進(jìn)行定性和定量分析.結(jié)果表明，野生型菌株在脫脂牛奶平板上可在其菌落四周形成明顯的透明圈，且透明圈直徑和透明度均最大.而Δqrr1突變株在脫脂牛奶平板上形成的透明圈直徑及透明度均減?。划?dāng)具有完整基因開(kāi)放閱讀框序列回補(bǔ)至突變株中后，其胞外蛋白酶的活性得到一定的提高(如圖7(a)所示).HPA顯色反應(yīng)結(jié)果與牛奶平板相符，野生型胞外蛋白酶產(chǎn)量最高，兩個(gè)陰性對(duì)照菌株asp-和ΔluxR突變株幾乎合成胞外蛋白酶.Qrr1表達(dá)受損時(shí)其胞外蛋白酶產(chǎn)量降低，而其互補(bǔ)菌株的產(chǎn)量則基本與野生型相當(dāng)(如圖7(b)和7(c)所示).由此可見(jiàn)，Qrr1對(duì)溶藻弧菌胞外蛋白酶的產(chǎn)生具有一定的促進(jìn)作用.

(a)牛奶平板檢測(cè)分析

(b)HPA顯色分析

(c)HPA顯色定量分析圖7 Qrr1對(duì)溶藻弧菌胞外蛋白酶合成的調(diào)控

3 結(jié)論

溶藻弧菌是水產(chǎn)養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)重要的病原菌，每年因其感染所爆發(fā)的弧菌并給世界海水養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失.溶藻弧菌的主要毒力因子為胞外蛋白酶，生物被膜及運(yùn)動(dòng)性等.前期研究發(fā)現(xiàn)，在溶藻弧菌體內(nèi)存在sRNA分子伴侶蛋白Hfq，該蛋白對(duì)溶藻弧菌的環(huán)境應(yīng)激能力，運(yùn)動(dòng)性，生物被膜，胞外蛋白酶活性，宿主體內(nèi)存活以及毒力等均具有重要的調(diào)控作用[6].Hfq作為一個(gè)重要的轉(zhuǎn)錄后全局調(diào)控因子，主要通過(guò)協(xié)助不同的sRNA分子與靶標(biāo)mRNA分子相互作用而發(fā)揮功能.在大腸桿菌中，Hfq通過(guò)SgrS和CsrA兩個(gè)sRNA分子進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)代謝的調(diào)控[19,20]；通過(guò)OxyS抑制fhlA和rpoS基因的轉(zhuǎn)錄進(jìn)行氧化應(yīng)激適應(yīng)[21].在霍亂弧菌中，Hfq主要通過(guò)Qrr分子對(duì)群體感應(yīng)關(guān)鍵元件LuxR和AphA的影響來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)其毒力的調(diào)控[13].

本文通過(guò)生物信息學(xué)手段在溶藻弧菌12G01基因組中篩查到群體感應(yīng)調(diào)控sRNA分子，即Qrr1.通過(guò)同源重組構(gòu)建了缺失其7-121位堿基的無(wú)標(biāo)記基因框內(nèi)缺失突變株，通過(guò)對(duì)比其與野生型菌株和互補(bǔ)株的不同生理特性發(fā)現(xiàn)：Qrr1對(duì)溶藻弧菌胞外蛋白酶的合成都具有一定的促進(jìn)作用，而前期研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)Hfq缺失后，其胞外蛋白酶的產(chǎn)量顯著上升，且通過(guò)對(duì)群體感應(yīng)元件LuxR的轉(zhuǎn)錄后抑制作用實(shí)現(xiàn)對(duì)胞外蛋白酶的下調(diào)作用.可見(jiàn)，在溶藻弧菌中，Hfq主要通過(guò)其它一個(gè)或多個(gè)sRNA而非Qrr1進(jìn)行胞外蛋白酶表達(dá)的影響.而當(dāng)Qrr1缺失后，溶藻弧菌的運(yùn)動(dòng)性完全受損，與Hfq缺失株表型一致，表明Hfq對(duì)于溶藻弧菌運(yùn)動(dòng)性的調(diào)控作用主要通過(guò)Qrr1來(lái)實(shí)現(xiàn).此外，Qrr1轉(zhuǎn)錄受損時(shí)，溶藻弧菌在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期和穩(wěn)定期的菌體濃度明顯低于野生型菌株，而當(dāng)Hfq表達(dá)受損時(shí)，其僅在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期較野生型菌體濃度有所下降，到達(dá)穩(wěn)定期后即達(dá)到野生型水平，表明Hfq通過(guò)Qrr1及其他未知的sRNA分子的協(xié)同調(diào)控作用進(jìn)行溶藻弧菌生長(zhǎng)代謝的調(diào)控.

通過(guò)本論文的研究工作，在溶藻弧菌體內(nèi)鑒定了與其生長(zhǎng)及毒力相關(guān)的sRNA分子，即Qrr1，為深入研究溶藻弧菌Hfq對(duì)其毒力及其他生理功能的調(diào)控機(jī)理提供了線(xiàn)索.同時(shí)，研究結(jié)果也表明了Hfq對(duì)溶藻弧菌毒力調(diào)控機(jī)制的復(fù)雜性，尚有大量未知的參與溶藻弧菌不同生理功能的sRNA分子有待進(jìn)一步地鑒定，今后將深入研究Qrr1與Hfq協(xié)同作用的機(jī)理，進(jìn)一步探明溶藻弧菌的致病機(jī)制.

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【責(zé)任編輯：陳 佳】

Regulation of Qrr1 on various physiological functions and virulence ofVibrioalginolyticus

LIU Huan1, YANG Jin-fang1, ZHANG Shan-shan1, LIU Wang1, CHEN Xue-feng1, ZHANG Gu-fen2

(1.School of Food and Biological Engineering, Shaanxi University of Science & Technology, Xi′an 710021, China; 2.Department of Infectious Disease, Tangdu Hospital, The Forth Military Medical University, Xi′an 710038, China)

Vibrioalginolyticusis one of the important fish pathogen in China,bringing about serious economic loss to aquaculture.A quorum sensing regulatory sRNA,Qrr1,was screened utilizing the bioinformatics methods and then cloned.Besides,the in-frame deletion mutant strain of Qrr1 was constructed and the roles of this gene in different physiological functions ofVibrioalginolyticuswere characterized.The results demonstrated that Qrr1 obviously promoted the growth ofVibrioalginolyticusduring exponential and stationary stage.Moreover,the ability of mobility was almost absent,the biofilm formation and extracellular protease production were all impaired in theΔqrr1 mutant strain,contrast to the wild-type strain,which means Qrr1 participates in the virulence regulation as an important regulator inVibrioalginolyticus.

Qrr1;Vibrioalginolyticus; physiological functions; virulence

2016-12-27 基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31301059)； 陜西省科技廳自然科學(xué)基礎(chǔ)研究青年基金項(xiàng)目(2013JQ3011)； 陜西科技大學(xué)博士科研啟動(dòng)基金項(xiàng)目(BJ12-24)

劉 歡(1983-)，女，陜西西安人，講師，博士，研究方向：食源性病原微生物

1000-5811(2017)02-0114-07

S917.1

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