占衛(wèi)紅，吳啟航，趙隆麒，王心倩，孫 妍，余曉麗

(武漢輕工大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院，湖北 武漢 430023)

結(jié)核分枝桿菌Rv2181T、B細(xì)胞表位預(yù)測及分析

占衛(wèi)紅，吳啟航，趙隆麒，王心倩，孫 妍，余曉麗

(武漢輕工大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院，湖北 武漢 430023)

預(yù)測和分析結(jié)核分枝桿菌Rv2181抗原的T細(xì)胞表位和B淋巴抗原表位的分布狀況。首先從NCBI中得到蛋白的氨基酸序列，接著通過BLAST將人類蛋白和得到的序列進(jìn)行同源性分析，使用SYFPEITHI對MTB中Rv2181蛋白的T淋巴細(xì)胞抗原表位，取得分在前2%的多肽作為優(yōu)勢抗原，然后用NETCTL、NetMHC和BIMAS等數(shù)據(jù)庫預(yù)測抗原CD8+T和CD4+T細(xì)胞表位，綜合結(jié)果篩選出優(yōu)勢肽段。利用Protean預(yù)測到的B細(xì)胞抗原表位，再根據(jù)IEDB、ABCpred、Bcepred等數(shù)據(jù)庫預(yù)測，排除α-螺旋、β-折疊內(nèi)不易形成表位的序列，將位于β-轉(zhuǎn)角、無規(guī)則卷曲處的表位確定為優(yōu)勢表位。通過預(yù)測、分析，篩選出Rv2181抗原CD4+T細(xì)胞表位中強(qiáng)結(jié)合表位120個，弱結(jié)合表位495個，綜合CD4、8+T的預(yù)測，最終篩選出1個優(yōu)勢表位肽段,確定7條優(yōu)勢的B細(xì)胞抗原表位區(qū)域。預(yù)測T、B細(xì)胞候選表位為結(jié)核病診斷和治療有重要價值。

結(jié)核分枝桿菌；Rv2181；T細(xì)胞；B細(xì)胞；表位分析

1 引言

一個世紀(jì)以來，結(jié)核病作為一種對人類的生命安全具有嚴(yán)重威脅的傳染病，越來越多的人開始關(guān)注它對人類造成的健康問題。據(jù)世界衛(wèi)生組織估計(jì),有860萬人感染,130萬人死于這種疾病[1]。近年來，通過研究人員的辛勤探索和不斷追尋，結(jié)核病的檢測手段和與它相關(guān)的抗結(jié)核藥物都在日新月異的變換著，但是加強(qiáng)對結(jié)核病診斷以及開發(fā)新的、有效的抗結(jié)核疫苗依舊是結(jié)核病研究的熱點(diǎn)。目前，卡介苗(BCG)是唯一一種較為廣泛用來預(yù)防結(jié)核病的疫苗，但是卡介苗只能預(yù)防幼兒肺外血源播散性結(jié)核[2],對成年人起到的的保護(hù)效力并不高[3]，甚至疫苗對部分成年人起不到保護(hù)作用,更加嚴(yán)峻的是，隨著多重耐藥的結(jié)核患者的出現(xiàn)，治好結(jié)核耐藥患者的失敗率在一般敏感性結(jié)核病高出80倍[4]。隨著生物化學(xué)、免疫學(xué)和分子生物學(xué)等學(xué)科的研究進(jìn)步,發(fā)現(xiàn)有部分結(jié)核分枝桿菌的抗原可能在提高結(jié)核病診斷能力或研制新的疫苗方面具有重要作用[5]。有研究發(fā)現(xiàn)結(jié)核分枝桿菌基因組的保守性相對較高,且其中的T/B細(xì)胞抗原表位序列具有更高的保守性,甚至可能在機(jī)體免疫識別過程中受益。這給我們研究和開發(fā)新的抗結(jié)核分枝桿菌疫苗帶來挑戰(zhàn),需要對相關(guān)現(xiàn)象進(jìn)行更深入和系統(tǒng)的研究。

抗原表位是通過與抗體或者細(xì)胞表面的抗原受體結(jié)合而發(fā)揮免疫效應(yīng)。一個蛋白質(zhì)抗原的表位,不僅包含B細(xì)胞表位，輔助性、細(xì)胞毒性T細(xì)胞表位，還有自然殺傷細(xì)胞表位。這些與免疫識別密切相關(guān)的結(jié)構(gòu)，同時也有不利于保護(hù)性免疫作用的結(jié)構(gòu)。因此篩選和鑒定蛋白抗原優(yōu)勢抗原表位對了解結(jié)核分枝桿菌的致病機(jī)制、改進(jìn)免疫學(xué)診斷方法以及新型、安全的疫苗開發(fā)有重要價值[6]。

2 材料與方法

2.1 同源性分析比對

在NCBI數(shù)據(jù)庫中獲得MTB的Rv2181的蛋白序列(GeneID：888269、428aa) 。

在NCBI數(shù)據(jù)庫中用Blast (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) 將Rv2181的蛋白序列與結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的蛋白序列進(jìn)行同源比對分析。登入NCBI選擇protein Blast，然后選擇非重復(fù)蛋白序列Non-redundant protein sequences ( nr ) 數(shù)據(jù)庫，并提交Rv2181抗原序列，分析抗原序列與MTB復(fù)合群、非結(jié)核分枝桿菌以及其他細(xì)菌的同源性；然后選擇人類Human進(jìn)行分析。

2.2 Rv2181抗原的CD4+T細(xì)胞表位預(yù)測

登錄NetMHCⅡpan 3.1 Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHCIIpan/),來預(yù)測MHCⅡ中的分子。選擇DRB1*0901、DRB1*1501、DRB1*0701、DRB1*1101、DRB1*0301、DRB1*0405、DPA1*0103-DPB1*0401、DPA1*0201-DPB1*0101、DQA1*0101-DQB1*0501和DQA1*0301-DQB1*0302作為HLAⅡ類分子的限定條件預(yù)測結(jié)果。根據(jù)表位多肽與HLA分子結(jié)合能力的強(qiáng)弱，分為較強(qiáng)結(jié)合(KD<50 nM)與較弱結(jié)合(KD<500 nM)[7]。

2.3 Rv2181抗原的CD8+T細(xì)胞表位預(yù)測

2.3.1 NetMHC表位預(yù)測

登錄NetMHC ⅡPAN 4.0 Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHC/),該軟件可預(yù)測分析HLA-ABCE類別的MHC分子。由于多數(shù)HLA分子偏向于和九個氨基酸長度的多肽有強(qiáng)結(jié)合，所以選擇氨基酸長度為9個，并選擇可能性最大的HLA-A (A2)以及(A3)兩類HLA分子作為限定條件[8]。

2.3.2 SYFPEITHI表位預(yù)測

SYFPEITHI是一個主要組織相容性復(fù)合體的數(shù)據(jù)庫，可以進(jìn)行針對MHC等位基因的產(chǎn)物的配體進(jìn)行預(yù)測。進(jìn)入網(wǎng)站,選擇HLA- A* 02:01、 A* 03:01兩類，多肽長度選為9個氨基酸，提交序列，記錄分析得分在前2%的多肽序列[9]。

2.3.3 BIMAS表位預(yù)測

進(jìn)入BIMAS網(wǎng)站(http:// www-bimas.cit.nih.gov/molbio/hla_bind/),BIMAS是依據(jù)多肽分子與HLAⅠ類分子解離所用時間的一半進(jìn)行排序，其分析結(jié)果是依據(jù)系數(shù)表推導(dǎo)的。選擇 HLA*0201及A3 兩類分子，多肽長度選為9個氨基酸[10]，接著輸入Rv2181的氨基酸序列并提交，進(jìn)行預(yù)測分析。

2.3.4 NetCTL表位預(yù)測

登入NetCTL網(wǎng)站( http://www.cbs.dtu.dk/services/NetCTL/) ，從選擇類別中，選定A2和A3兩個超類型，Weight on C terminal cleavag值填寫為“0.15”，以及 Weight on TAP transport efficiency填寫為“0.05”，Threshold for epitope identification填寫為“0.75”，而后輸入Rv2181的氨基酸序列，進(jìn)行預(yù)測。預(yù)測結(jié)果是以得分高低來分別顯示敏感度和特異度的高低。最后，對預(yù)測肽段的得分超過0.75的進(jìn)行記錄分析[11]。

2.4 Rv2181蛋白抗原的B細(xì)胞表位預(yù)測

將MTB的Rv2181的蛋白質(zhì)氨基酸序列單獨(dú)保存成*.fas格式，啟動Protean程序，以FASTA文件格式打開。我們采用Kyte-Doolittle的親水性方案、Karplus-Schulz的柔韌性方案、Emini的表面可及性方案和Jameson-Wolf的抗原指數(shù)方案綜合性預(yù)測，預(yù)測蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)，排除α-螺旋、β-折疊內(nèi)不易形成表位的序列，將位于β-轉(zhuǎn)角、無規(guī)則卷曲處的表位確定為優(yōu)勢抗原表位。再根據(jù)IEDB、ABCpred、Bcepred等軟件綜合分析，確定最佳抗原表位候選區(qū)域。

3 結(jié)果

3.1 Rv2181抗原同源性比對結(jié)果

Rv2181抗原與結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群蛋白的同源性都達(dá)到100%；與非結(jié)核分枝桿菌蛋白同源性比對的一致性為71%-82%，其平均值為76.5%。Rv2181抗原與結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌相比較，Rv2181的抗原與前者的同源性較高。從表1中看出Rv2181抗原序列與人類蛋白同源性僅有31%。通過以上結(jié)果可以得出Rv2181抗原與結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的同源性相當(dāng)高，然而與人類蛋白的同源性很低，所以認(rèn)為Rv2181抗原可能有作為免疫性結(jié)核病疫苗的能力，因此繼續(xù)對其進(jìn)行預(yù)測分析很有必要。

表1 抗原Rv2181與人類蛋白同源性的比較結(jié)果

蛋白最高評分期望值同源性Rv218132．73．031%

3.2 Rv2181抗原T細(xì)胞表位結(jié)合預(yù)測結(jié)果

3.2.1 Rv2181抗原表位預(yù)測結(jié)果

使用NetMHCⅡpan 3.1 server對抗原CD4+T細(xì)胞表位進(jìn)行預(yù)測分析，選擇DRB1*0901、DRB1*1501、DRB1*0701、DRB1*1101、DRB1*0301、DRB1*0405、DPA1*0103-DPB1*0401、DPA1*0201-DPB1*0101、DQA1*0101-DQB1*0501、DQA1*0301-DQB1*0302作為限定條件，預(yù)測結(jié)果見表2。從預(yù)測結(jié)果可以知道不同HLA分子結(jié)合數(shù)目大相徑庭，就拿Rv2181抗原與DRB1*1101強(qiáng)結(jié)合的數(shù)目明顯較多，與DQA1*0301-DQB1*0302結(jié)合的數(shù)目最少。與不同HLAⅡ分子強(qiáng)弱結(jié)合的數(shù)目可見表2。

表2 NetMHCⅡ?qū)v2181抗原的CD4+T細(xì)胞表位分布的預(yù)測結(jié)果

HLAⅡ分子強(qiáng)結(jié)合肽段數(shù)弱結(jié)合肽段數(shù)DRB1?09011369DRB1?15011762DRB1?0701553DRB1?11011830DRB1?03011438DRB1?0405531DPA1?0103?DPB1?04011750DPA1?0201?DPB1?0101、1532DQA1?0101?DQB1?05011659DQA1?0301?DQB1?0302071

3.2.2 Rv2181CD8+T表位預(yù)測結(jié)果

選擇HLA-0201和HLA-0301作為限定條件，對Rv2181抗原使用NETCTL、SYFPEITH、NetMHC和BIMAS這4種不同在線預(yù)測軟件進(jìn)行預(yù)測。綜合結(jié)果，得出Rv2181抗原預(yù)測出4條抗原表位多肽，結(jié)果見表3。

表3 Rv2181抗原CD8+T細(xì)胞表位的綜合分析

起始位置序列NETCTLSYFPEITHINetMHCBIMS親和值得分得分親和值得分得分20CLLWLLAGV0．25501．14243016．65強(qiáng)結(jié)合591．888112LLIASTAIV0．45401．23332821．81強(qiáng)結(jié)合48．478265NIAGALARL1．0880．8102281081．20弱結(jié)合6．75617VLWCLLWLL1．34001．3579274．85強(qiáng)結(jié)合5199．555

注：親和值越低表明結(jié)合能力越強(qiáng)，得分越高表示結(jié)合能力越強(qiáng)。

3.2.3 Rv2181 CD8+T和CD4+T表位綜合預(yù)測結(jié)果

通過在線預(yù)測工具的結(jié)果，得出Rv2181抗原的CD4+T與CD8+T的肽段。最后根據(jù)CD4+T細(xì)胞表位的肽段包含CD8+T細(xì)胞表位的肽段的原則，預(yù)選出Rv2181有1條優(yōu)勢表位肽段，結(jié)果見表4。

3.3 Rv2181抗原的B細(xì)胞表位預(yù)測和分析結(jié)果

3.3.1 單參數(shù)方案預(yù)測的抗原表位

Protean軟件預(yù)測的抗原表位見表5。

表4 Rv2181抗原的CD4+T和CD8+T細(xì)胞表位綜合分析

蛋白位置序列CD4+T表位肽段CD8+T表位肽段14～28GRRVLWCLLWLLAGVVLWCLLWLL

3.3.2 B細(xì)胞優(yōu)勢抗原表位的確定

綜合DNAStare中的Protean和蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)分析初步得到B細(xì)胞抗原表位，根據(jù)IEDB、

表5 單參數(shù)方案預(yù)測的抗原表位

預(yù)測方法預(yù)測表位Hydrophilicity(Kyte?Doolittle)1～17、38～66、126～143、181～192、213～220、239～257、261～268、275～284、303～308、327～334、346～353、370～390、409～427Flexibility(Karplus?Schulz)8～15、59～68、128～133、158～163、182～190、201～204、214～218、252～255、261～266、276～279、305～309、373～380、411～425Accessibility(Emini)13～16、41～45、60～63、81～84、183～191、214～219、239～256、261～267、277～283、306～309、346～353、373～380、409～427AntigenicIndex(Jameson?Wolf)4～18、41～50、57～69、127～134、138～144、159～164、180～192、213～221、239～247、251～258、263～268、276～283、302～310、326～333、346～353、373～380、410～427

Bcepred等軟件綜合預(yù)測后得到的結(jié)果，排除α-螺旋、b-折疊內(nèi)不易形成表位的序列，將位于-轉(zhuǎn)角、無規(guī)則卷曲處的表位確定為優(yōu)勢抗原表位，最終確定的最佳抗原表位候選區(qū)域有7條，結(jié)果見表6。

表6 B細(xì)胞優(yōu)勢抗原表位

表位氨基酸序列4～12WRAPEVGSR41～46TPYRID57～62WLDGRP183～189RRTPWPR251～257HTDRIGA373～379PQHRETT409～428RMTPQRSLTRGLTPAPTAS

4 討論

在近些年的研究中，許多特異性結(jié)核抗原被研究人員發(fā)現(xiàn)，這結(jié)果為結(jié)核疫苗的研制提供了一些研究基礎(chǔ)[12]。許多新的疫苗也在動物實(shí)驗(yàn)中取得較好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，但是仍然存在許多能被T細(xì)胞所識別的結(jié)核菌的蛋白抗原有待發(fā)現(xiàn)。傳統(tǒng)疫苗是將病原體滅活或減毒而制成的，存在生物危害性和遺傳變異致使原疫苗效力喪失等問題。表位疫苗(Epitope vaccine)是用抗原表位制備的疫苗，包括合成肽疫苗、重組表位疫苗及表位核酸疫苗是目前有關(guān)傳染性疾病和惡性腫瘤疫苗的研制方向。 由于表位僅是蛋白抗原的一部分，其分子量較小，免疫原性較弱，不能刺激機(jī)體產(chǎn)生較強(qiáng)的免疫應(yīng)答，因此為增強(qiáng)其免疫原性，可將表位與載體蛋白如牛血清白蛋白或破傷風(fēng)類毒素等相偶聯(lián)，其所產(chǎn)生的保護(hù)力可與大分子相比。另外也可將多種T、B細(xì)胞表位的氨基酸連接于分支狀的多聚賴氨酸骨架上形成一種具有獨(dú)特三維空間結(jié)構(gòu)的大分子多抗原肽疫苗，因包含多種特異性的表位，而具有更有力的保護(hù)[13]。目前基因疫苗可作為預(yù)防和治療性疫苗，而研究中發(fā)現(xiàn)常規(guī)疫苗肌注后誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答較弱，因此找到新的基因疫苗設(shè)計(jì)方案已成為研究的熱點(diǎn)之一[14-15]。徐煥賓等將鴨乙肝病毒Pre-s中的P127-138B細(xì)胞表位基因克隆到含多肽表達(dá)盒的載體中，體外轉(zhuǎn)染肌肉細(xì)胞，并經(jīng)動物試驗(yàn)證實(shí)重組的載體可在體外瞬時高效表達(dá)，并保持原有的免疫活性，結(jié)果提示以B細(xì)胞表位為基礎(chǔ)的基因疫苗可以誘導(dǎo)特異性體液免疫應(yīng)答，同時顯示出顯著的MHC限制性[16]。雖然表位疫苗具有許多優(yōu)點(diǎn)，并且其研究也取得了重大的進(jìn)展，但仍存在一些問題。比如將多肽單獨(dú)應(yīng)用的免疫原性較低，如何誘導(dǎo)出最佳的免疫應(yīng)答是我們需要去解決的難點(diǎn)之一，此問題或許可以通過構(gòu)建包含多種限制性表位的疫苗來解決[17]。在未來的研究中，我們應(yīng)當(dāng)加大對結(jié)核表位的研究，研制出具有效價、便捷的疫苗。

筆者對MTB的Rv2181蛋白抗原中T、B細(xì)胞表位預(yù)測分析是通過生物信息學(xué)的方法進(jìn)行預(yù)測。首先得到Rv2181蛋白的氨基酸序列，接著通過對人類蛋白和Rv2181蛋白序列進(jìn)行同源性分析，使用SYFPEITHI、NETCTL、NetMHC和BIMAS等數(shù)據(jù)庫預(yù)測抗原T細(xì)胞中CD8和CD4T的表位，綜合結(jié)果篩選出一條優(yōu)勢肽段GRRVLWCLLWLLAGV。利用Protean預(yù)測到的B細(xì)胞抗原表位，再根據(jù)IEDB、ABCpred、Bcepred等數(shù)據(jù)庫預(yù)測，排除α-螺旋、β-折疊內(nèi)不易形成表位的序列，將位于β-轉(zhuǎn)角、無規(guī)則卷曲處的表位確定為優(yōu)勢表位[17]。通過預(yù)測分析來篩選出7條優(yōu)勢的B細(xì)胞抗原表位區(qū)域，Rv2181蛋白可作為新的結(jié)核病診斷試劑和疫苗研發(fā)的候選靶蛋白。

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Prediction and analysis of T，B cell epitopes’ s distribution of theMycobacteriumtuberculosisRv2181

ZHANWei-hong,WUQi-hang,ZHAOLong-qi,WANGXin-qian,SUNYan,YUXiao-li

(School of Biology and Pharmaceutical Engineering,Wuhan Polytecnic University,Wuhan 430023,China)

To forecast and analyse the distribution of CD4+T cell CD8+T cell and B epitope encoded by the Rv2181 ofMycobacteriumtuberculosis.First obtain the protein amino acid sequence from NCBI detabase,and then analyse its homology with human proteins sequence and homology.Using SYFPEITHI to analyse T cell antigen epitope, choosing the points in the top 2% as advantage epitope.Then using NETCTL, NetMHC and BIMAS database to predict CD8+T CD4+T cell epitope, to screen out advantage peptides from prediction results.Protean are used to get the predicted B cell antigen epitope, and according to IEDB, ABCpred, Bcepred detabases, eliminate the sequences which have alpha helix, beta - fold,but choose the sequences in beta angle, the table level random curl as advantage epitope.By predicting, there are 120 strong and 495 candidates epitope in CD4+T cell.In the end, select one dominant epitope,and determine 7 B cell advantages antigen epitope area.The prediction of T ,B cells in the diagnosis and treatment of tuberculosis is of improtant value.

Mycobacteriumtuberculosis; Rv2181; T cells; B cells; epitope analysis

2017-01-26.

占衛(wèi)紅(1992-)，女，碩士研究生，E-mail: 3051361453@qq.com.

余曉麗(1963-)，女，教授，E-mail:yxll268@126.com.

2095-7386(2017)01-0039-05

10.3969/j.issn.2095-7386.2017.01.008

Q 93

A