抗HTNV中和性鼠/人嵌合抗體基因向植物轉(zhuǎn)化研究

謝偉強(qiáng)

摘 要：在由農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤法轉(zhuǎn)化煙草的研究中，將含有重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌過夜培養(yǎng)后按1∶100接種于新鮮的LB培養(yǎng)液中培養(yǎng)6h至OD600≈0.6時(shí)，取菌液經(jīng)梯度稀釋后分別對(duì)大小約0.5cm2的煙草葉片進(jìn)行不同時(shí)間浸染。結(jié)果表明，用經(jīng)20倍稀釋后的菌液浸染的煙草葉片其轉(zhuǎn)化率達(dá)97%以上，且不同時(shí)間浸染的處理間無顯著差異，培養(yǎng)基中激素濃度以6-BA 1.5mg/L IAA 0.5mg/L為宜。

關(guān)鍵詞：漢灘病毒；嵌合抗體；轉(zhuǎn)基因植物；煙草

中圖分類號(hào) R392 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-7731（2016）23-0046-05

Transformation of Full-length Gene of Mouse/human Chimeric Antibody against HTNV into Plants

Xie Weiqiang

（Yangling Institute of Quality and Technology Inspection，Yangling 712100，China）

Abstract：In this thesis Agrobacterium-mediated transformation of tobacco leaf discs with Agrobacterium tumefaciens containing mouse/human chimeric antibody gene against Hantaan virus was studied.Overnight cultured Agrobacterium tumefaciens containing recombinant plasmid was inoculated in fresh LB culture medium by the Ratio of 1∶100 and incubated till OD600 was about 0.6.Then the pellet of Agrobacterium tumefaciens was diluted gradiently and used to immerse the tobacco leaf discs about 0.5cm2 for different length of time.The results showed that the highest transformation efficiency was obtained with the tobacco leaves immersed by the Agrobacterium tumefaciens which had been diluted 20 times，that no less than 97% leaf discs callused.There were no significant differences among treatments for different immersing time.In addition，it was appropriate for callusing of tobacco leaf discs when the concentrations of 6-BA being 1.5mg / L and IAA being 0.5mg / L.

Key words：Hantaan virus；Chimeric antibody；Transgenic plant；Tobacco

1 引言

1.1 腎綜合征出血熱（HFRS）的研究意義及其進(jìn)展 腎綜合征出血熱（HFRS）是一類以發(fā)熱、出血和腎臟損害為主要臨床特征的疾病。全世界90%以上的HFRS病例發(fā)生在我國(guó)，疫情非常嚴(yán)重，年發(fā)病人數(shù)超過10萬，且以青壯年居多，死亡率約5%～10%。HFRS已成為目前我國(guó)死亡人數(shù)最多的急性病毒性傳染病之一。漢灘病毒（HTNV）隸屬于布尼亞病毒科漢灘病毒屬，在我國(guó)發(fā)生的HFRS主要由該病毒引起，因此對(duì)HTNV的研究具有十分重要的意義。

對(duì)HFRS的治療，迄今還沒有特異有效的治療藥物，臨床上主要是采取血液透析等方法進(jìn)行對(duì)癥處理，費(fèi)用昂貴。目前，對(duì)該病治療制劑研究最多的是抗HTNV鼠源性單克隆抗體（mAb），但由于其在人體內(nèi)應(yīng)用易導(dǎo)致人抗鼠抗體的產(chǎn)生，不僅影響其治療效果，而且還存在一定的安全性問題。而人源性mAb由于存在制備困難，產(chǎn)量低的問題，也難以廣泛應(yīng)用?；蚬こ炭贵w主要是在原核及真核系統(tǒng)中表達(dá)，原核表達(dá)系統(tǒng)雖然表達(dá)產(chǎn)量高，但由于其加工修飾功能限制，會(huì)影響表達(dá)產(chǎn)物的生物學(xué)特性；而真核表達(dá)又存在表達(dá)產(chǎn)量低的難題[1]。運(yùn)用合適的植物表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)抗體不僅表達(dá)產(chǎn)量高，而且由于植物表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的抗體是以雙體形式存在，因此表達(dá)產(chǎn)物的親和力也較高。采用新興的植物表達(dá)技術(shù)，高效表達(dá)鼠/人嵌合植物抗體，不僅可以克服上述鼠源性mAb的缺點(diǎn)，而且具有高表達(dá)量、低成本等優(yōu)點(diǎn)。

1.2 植物轉(zhuǎn)化的影響因素 自20世紀(jì)80年代首次獲得轉(zhuǎn)基因煙草植株以來，轉(zhuǎn)基因技術(shù)日益成熟和集中，針對(duì)不同植物也建立了切實(shí)可行的轉(zhuǎn)化方法。目前，轉(zhuǎn)基因植物開發(fā)主要采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法和基因槍介導(dǎo)法。其中，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化早期主要應(yīng)用于雙子葉植物，近些年來在單子葉植物上也已取得突破。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法已向植物中導(dǎo)入了多個(gè)功能基因，獲得了大量轉(zhuǎn)基因植株，培育了一些轉(zhuǎn)基因新品種。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法可以獲得多種可穩(wěn)定遺傳的植株，但其轉(zhuǎn)化條件因轉(zhuǎn)化對(duì)象的不同而有所差異。

1.2.1 菌液濃度和浸染時(shí)間對(duì)植物轉(zhuǎn)化的影響 農(nóng)桿菌懸浮液濃度及浸染時(shí)間是影響遺傳轉(zhuǎn)化最重要的2個(gè)因素。碭山酥梨離體葉片的外植體經(jīng)過不同濃度的菌液浸染不同的時(shí)間處理，再進(jìn)行選擇培養(yǎng)，結(jié)果表明：當(dāng)OD600=0.5，浸染時(shí)間為5min時(shí)，再生頻率最高[1]。在農(nóng)桿菌介導(dǎo)的小麥遺傳轉(zhuǎn)化試驗(yàn)中，當(dāng)OD600=0.5時(shí)，Alondra's中的gus基因瞬時(shí)表達(dá)頻率最高，而揚(yáng)麥15則在OD600=1時(shí)表現(xiàn)最高的gus基因瞬時(shí)表達(dá)頻率。當(dāng)浸染時(shí)間為10min時(shí)，揚(yáng)麥15和Alondra's都表現(xiàn)最高的gus基因表達(dá)率。而降低或延長(zhǎng)浸染時(shí)間都會(huì)使表達(dá)率降低[3]。根癌農(nóng)桿菌浸染金邊狗牙根遺傳轉(zhuǎn)化表明，用根癌農(nóng)桿菌浸染10min，GUS瞬間表達(dá)效果最好[4]。不同濃度的農(nóng)桿菌菌液對(duì)草地早熟禾浸染表明，農(nóng)桿菌菌液濃度OD600=0.6時(shí)草地早熟禾的轉(zhuǎn)化率最高。而當(dāng)農(nóng)桿菌濃度OD600大于0.6轉(zhuǎn)化率則下降[5]。

1.2.2 共培養(yǎng)對(duì)植物轉(zhuǎn)化的影響 有研究表明在微孔濾膜上進(jìn)行共培養(yǎng)轉(zhuǎn)化效率顯著高于在玻璃紙上進(jìn)行共培養(yǎng)的轉(zhuǎn)化效率。共培養(yǎng)溫度為20℃時(shí)轉(zhuǎn)化效率最高[5]。碭山酥梨離體葉片外植體用OD600=0.5的農(nóng)桿菌浸染5min，然后共培養(yǎng)，結(jié)果表明，共培養(yǎng)48h時(shí)的再生頻率較高[2]。小麥愈傷組織經(jīng)農(nóng)桿菌浸染后，在相同條件下共培養(yǎng)1～3d后進(jìn)行g(shù)us染色，結(jié)果表明當(dāng)共培養(yǎng)1d時(shí)，揚(yáng)麥15中的gus基因瞬時(shí)表達(dá)率最高；而Alondra's中g(shù)us基因表達(dá)率共培養(yǎng)2d時(shí)達(dá)到最高。對(duì)辣椒的研究表明，若共培養(yǎng)3d，比較有利于提高轉(zhuǎn)化率[5]。此外有報(bào)道稱共培養(yǎng)時(shí)光照時(shí)間對(duì)表達(dá)率有一定影響。在全天光照條件下，金邊狗牙根愈傷組織GUS瞬間表達(dá)率最高，但與每天16h光照處理差異不明顯。這2種條件下GUS瞬間表達(dá)率均明顯高于暗培養(yǎng)[5]。Kenjirou Ozawa等用富含N6和DKN的濕潤(rùn)濾紙培養(yǎng)基代替固體培養(yǎng)基，將水稻愈傷組織和農(nóng)桿菌進(jìn)行共培養(yǎng)，在水稻上成功的獲得了高效率的轉(zhuǎn)化體系[7]。

1.2.3 乙酰丁香酮（AS）對(duì)植物轉(zhuǎn)化的影響 乙酰丁香酮可以誘導(dǎo)活化Vir區(qū)基因，使農(nóng)桿菌T-DNA更易進(jìn)入植物基因組并與其整合。因此，乙酰丁香酮也是影響遺傳轉(zhuǎn)化的重要因素之一[8]。碭山酥梨離體葉片外植體經(jīng)農(nóng)桿菌浸染后添加不同濃度的AS，其再生頻率顯著提高；而當(dāng)AS濃度為100μmol/L時(shí)，再生頻率最高。對(duì)于小麥的研究表明，AS的濃度以100μmol/L為宜[2]。對(duì)辣椒進(jìn)行實(shí)驗(yàn)表明，在浸染液中加不同濃度的AS可以不同程度地提高轉(zhuǎn)化效率，當(dāng)AS濃度在100μmol/L時(shí)達(dá)到較好的轉(zhuǎn)化效果[9]。

1.2.4 預(yù)培養(yǎng)對(duì)植物轉(zhuǎn)化的影響 預(yù)培養(yǎng)有利于農(nóng)桿菌更好地將外源基因整合到植物基因組內(nèi)，是影響植物遺傳轉(zhuǎn)化的又一重要因素。外植體預(yù)培養(yǎng)可以促進(jìn)細(xì)胞分裂，分裂狀態(tài)的細(xì)胞更容易與外源DNA整合，因而可以提高轉(zhuǎn)化效率[10-11]。預(yù)培養(yǎng)也可以在一定程度上減少傷害脅迫而有利于農(nóng)桿菌的侵[11]。子葉葉盤在接種農(nóng)桿菌前，在預(yù)培養(yǎng)2d后，芽誘導(dǎo)分化率高，達(dá)到77.6%。預(yù)培養(yǎng)1～7d的栗子香胚性懸浮細(xì)胞的轉(zhuǎn)化結(jié)果表明，預(yù)培養(yǎng)2d的胚性懸浮細(xì)胞，GUS瞬時(shí)表達(dá)率最高，達(dá)71.13%[9]。

1.2.5 其他影響因素 除了研究共培養(yǎng)、菌液濃度和浸染時(shí)間、乙酰丁香酮（AS）、預(yù)培養(yǎng)對(duì)植物轉(zhuǎn)化的影響外，一些學(xué)者考察了諸如負(fù)壓強(qiáng)度、超聲波處理時(shí)間、懸浮培養(yǎng)天數(shù)、抗生素選擇壓等因素對(duì)植物轉(zhuǎn)化的影響。子葉葉盤轉(zhuǎn)化結(jié)果表明，預(yù)培養(yǎng)3d的胚性懸浮細(xì)胞，GUS瞬時(shí)表達(dá)率最高[12]。對(duì)金邊狗牙根進(jìn)行不同負(fù)壓處理表明，給予一定的負(fù)壓處理有利于提高轉(zhuǎn)化率，但負(fù)壓過大則會(huì)對(duì)植物細(xì)胞本身產(chǎn)生較大的傷害甚至導(dǎo)致細(xì)胞死亡[5]。農(nóng)桿菌對(duì)苦豆子子葉和下胚軸的轉(zhuǎn)化率隨超聲波處理時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸遞增，當(dāng)超聲波處理25min時(shí)GUS瞬時(shí)表達(dá)率最高，再延長(zhǎng)處理時(shí)間轉(zhuǎn)化率下降[13]。王欣等在對(duì)甘薯聲波輔助的農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化方法（SAAT）條件的優(yōu)化的研究中對(duì)懸浮培養(yǎng)不同天數(shù)的胚性懸浮細(xì)胞進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化。GUS瞬時(shí)表達(dá)率檢測(cè)結(jié)果表明，培養(yǎng)105d的愈傷GUS瞬時(shí)表達(dá)率最高。在各培養(yǎng)階段不同濃度的羧芐青霉素（Carb）均不影響未浸染農(nóng)桿菌的胚性愈傷生長(zhǎng)及植株再生，濃度為100mg/L反而對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)有明顯的促進(jìn)作用。不同培養(yǎng)階段的胚性愈傷在含Kan0～50mg/L的培養(yǎng)基上培養(yǎng)結(jié)果表明，14d內(nèi)Kan對(duì)愈傷無明顯影響，28d后影響則逐漸明顯[12]。

1.3 擬開展研究的內(nèi)容及方法 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化技術(shù)已成功運(yùn)用到植物的遺傳轉(zhuǎn)化中。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的外源基因轉(zhuǎn)化是農(nóng)桿菌菌株與植物細(xì)胞之間相互作用的結(jié)果，凡是能夠影響植物細(xì)胞轉(zhuǎn)化應(yīng)答能力和農(nóng)桿菌侵染能力以及轉(zhuǎn)化體再生能力的各種因素都會(huì)對(duì)其轉(zhuǎn)化效果產(chǎn)生影響。因此，農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化頻率的提高依賴于對(duì)各種影響因子的優(yōu)化和轉(zhuǎn)化條件的改善。就菌懸液濃度及浸染時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)化率影響方面來看，大多數(shù)植物在OD600=0.6浸染10min時(shí)能達(dá)到較高的轉(zhuǎn)化率。但考慮到種屬特異性，我們有必要在現(xiàn)有條件下對(duì)菌懸浮液濃度及浸染時(shí)間作進(jìn)一步研究。

本研究將改造過的抗HTNV鼠/人嵌合抗體基因?qū)朕r(nóng)桿菌進(jìn)而通過葉盤法轉(zhuǎn)化煙草，通過抗生素對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行初步篩選，獲得抗性植株，并初步檢測(cè)外源基因在煙草中的表達(dá)。繼而，建立適合本實(shí)驗(yàn)室的煙草轉(zhuǎn)化與再生系統(tǒng)，確定本實(shí)驗(yàn)室煙草的最優(yōu)轉(zhuǎn)化條件，獲得可穩(wěn)定表達(dá)抗HTNV中和性鼠/人嵌合抗的抗性植株。本實(shí)驗(yàn)著重對(duì)菌液濃度及浸染時(shí)間進(jìn)行了研究。待含有重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌培養(yǎng)至0.6時(shí)，取菌液梯度稀釋后分別用于對(duì)煙草葉片進(jìn)行不同時(shí)間的浸染。運(yùn)用組織培養(yǎng)技術(shù)，將浸染后的煙草葉片經(jīng)共培養(yǎng)、選擇培養(yǎng)后統(tǒng)計(jì)其在不同條件下的轉(zhuǎn)化率。另外，本實(shí)驗(yàn)對(duì)部分葉片采用不同的共培養(yǎng)時(shí)間探究了共培養(yǎng)時(shí)間對(duì)煙草轉(zhuǎn)化的影響。

2 材料與方法

2.1 實(shí)驗(yàn)材料

2.1.1 植物材料 無菌煙草苗CV品種。

2.1.2 菌種 農(nóng)桿菌EHA105，由本實(shí)驗(yàn)室保存。

2.1.3 質(zhì)粒 抗?jié)h灘病毒鼠/人嵌合抗體植物表達(dá)載體3G1MH-pCAMBIA2301，由第四軍醫(yī)大學(xué)微生物學(xué)教研室構(gòu)建。

2.2 實(shí)驗(yàn)儀器 臺(tái)式高速離心機(jī)（Eppendorf），數(shù)顯振蕩培養(yǎng)箱（蘇坤），超低溫冰箱（中科美菱），電泳儀（北京鼎國(guó)1100型），PCR儀（MJ），光照培養(yǎng)箱，超凈工作臺(tái)，數(shù)碼凝膠成像系統(tǒng)（Wealtech公司）。

2.3 實(shí)驗(yàn)試劑

2.3.1 質(zhì)粒提取試劑 質(zhì)粒小量提取試劑盒，購自博大泰克公司。

2.3.2 抗生素：利福霉素（rif） 工作濃度50mg/L；卡那霉素（kan）：工作濃度50mg/L；羧芐青霉素（carb）：工作濃度50mg/L 均為Sigma產(chǎn)品。

2.3.3 轉(zhuǎn)化液 MS+AS（200μM/L）+二巰基乙醇（0.003%）。

2.3.4 培養(yǎng)基 （1）LB液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，pH≈7.0。（2）LB固體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，瓊脂粉0.7%，pH≈7.0。（3）MS培養(yǎng)基：大量元素+微量元素+鐵鹽+有機(jī)元素+蔗糖（3%）+瓊脂（0.7%），pH≈5.8。（4）共培養(yǎng)培養(yǎng)基：MS+AS（40μM/L）+6-BA+IAA。（5）選擇培養(yǎng)基：MS+Kan（100mg/L）+carb（200mg/L）+6-BA+IAA。

2.4 實(shí)驗(yàn)方法

2.4.1 制備農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化子及鑒定

2.4.1.1 農(nóng)桿菌EHA105的培養(yǎng) 取-70℃保存的農(nóng)桿菌EHA105菌株劃線接種于含rif 50mg/L的LB平板上，28℃培養(yǎng)36～48h后挑取單菌落，接種于6ml含rif 50mg/L的LB液體培養(yǎng)基中，28℃ 200r振蕩培養(yǎng)24h后，按1∶100轉(zhuǎn)接于新鮮LB液體培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)6h（OD600≈0.6）。

2.4.1.2 農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備 取新鮮轉(zhuǎn)接的培養(yǎng)菌液1.5mL，10 000r離心1min，棄上清；用100μL的TSS重懸菌體沉淀，制備的感受態(tài)細(xì)胞置于冰上現(xiàn)用或-70℃凍存。

2.4.1.3 重組質(zhì)粒向農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化（凍融法） 向農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞（100μL）中加入10μL重組質(zhì)粒3G1MH-pCAMBIA2301，混和均勻，置于液氮中速凍3min，立即28℃水浴5min，28℃200r振蕩培養(yǎng)5h后，涂布于含rif 50mg/L、kan 50mg/L的LB平板上，培養(yǎng)48～72h[14]。

2.4.1.4 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化子的鑒定 從平板上挑取已轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌單菌落，接種于10mL的含rif 50mg/L、kan 50mg/L的LB液體培養(yǎng)基中，28℃振蕩培養(yǎng)過夜，留取甘油菌備用，并提取質(zhì)粒。提出的質(zhì)粒進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳鑒定。

（1）重鏈Fd基因的擴(kuò)增：

引物：

P1：5′-ATTCTAGAGCCATGGCCGAGGCGCAGCTG-3′

P2：5′-TCACTAGTTCATTTGTCACAAGATTTGGC-3′

反應(yīng)體系（50μL）：

①H2O 35.0μL；②10×PCR Buffer 5.0μL ③Mgcl2 3.0μL；④dNTP 2.0μL；⑤P1 2.0μL，P2 2.0μL；⑥質(zhì)粒DNA 0.5μL；⑦TaqDNAPolymerase 0.5μL。

PCR擴(kuò)增條件：

預(yù)變性：95℃10min；循環(huán)擴(kuò)增：94℃ 1min，50℃ 1min，72℃1min，30個(gè)循環(huán)；延伸：72℃ 10min。

（2）輕鏈全基因的擴(kuò)增：

引物：

PⅠ：5′-GCGCCATGGACATTGTGATGACGCAG-3′

PⅡ：5′-TCCACTAGTTTAACACTCTCCCCTGTT-3′

反應(yīng)體系（50μL）：

①H2O 35μL；②10×PCR Buffer 5.0μL③Mgcl2 3.0μL；④dNTP 2.0μL；⑤PⅠ 2.0μL，PⅡ 2.0μL；⑥質(zhì)粒DNA 0.5μL；⑦TaqDNAPolymerase 0.5μL。

PCR擴(kuò)增條件 預(yù)變性：95℃10min；循環(huán)擴(kuò)增：94℃1min，55℃1min，72℃1min，30個(gè)循環(huán)；延伸：72℃10min。

2.4.2 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤法轉(zhuǎn)化 （1）將含有重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌EHA105培養(yǎng)24h后按1：100接種于新鮮的LB培養(yǎng)液中培養(yǎng)6h至OD600≈0.6，分別取2mL離心，用2mL轉(zhuǎn)化液重懸菌體，取菌液經(jīng)梯度稀釋后分別對(duì)大小約0.5cm2的煙草葉片進(jìn)行不同時(shí)間浸染。具體處理如表1所示。

（2）用無菌濾紙吸干煙草葉片表面的菌液。

（3）共培養(yǎng)：將浸染過的煙草葉片接種于共培養(yǎng)基上，22℃黑暗培養(yǎng)。

（4）選擇培養(yǎng)：將經(jīng)共培養(yǎng)數(shù)天的煙草葉片轉(zhuǎn)入含有Kan和carb的誘導(dǎo)愈傷組織及芽的選擇培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)（溫度：22℃光周期：暗8h；光16h）。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化提取及鑒定 利用TSS凍融法將3G1MH-pCAMBIA2301質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌EHA105中，提取質(zhì)粒，插入序列經(jīng)PCR擴(kuò)增鑒定，結(jié)果如圖1所示，分別擴(kuò)增出大小為750bp左右的片段。與預(yù)期相符，說明重組質(zhì)粒3G1MH-pCAMBIA2301已成功轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌。

3.2 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的煙草葉片轉(zhuǎn)化 將煙草葉片接種到誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)基上，培養(yǎng)3d后，部分葉片的邊緣開始膨脹，再繼續(xù)培養(yǎng)，切塊膨大成圓拱形，并開始出現(xiàn)有綠色半透明的愈傷組織。愈傷組織生長(zhǎng)迅速，根據(jù)色澤、質(zhì)地，可分為以下2種類型：第一類，開始透明狀后轉(zhuǎn)為褐色、質(zhì)地疏松的愈傷組織；第二類，開始為黃綠色后轉(zhuǎn)為綠色致密愈傷組織。

3.2.1 菌懸浮液濃度及浸染時(shí)間對(duì)出愈率的影響 取OD600≈0.6的含有重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌EHA105菌液經(jīng)梯度稀釋后，分別對(duì)大小約0.5cm2的煙草葉片進(jìn)行不同時(shí)間浸染。葉片共培養(yǎng)3d后轉(zhuǎn)入選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)，其出愈率如表2所示，方差分析結(jié)果如表3所示。

3.2.2 共培養(yǎng)時(shí)間對(duì)出愈率的影響 對(duì)經(jīng)30倍稀釋菌液浸染的煙草葉片分別進(jìn)行不同時(shí)間的共培養(yǎng)后轉(zhuǎn)入選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)。觀察發(fā)現(xiàn)不同的處理間葉片被包埋的程度不同，隨著浸染時(shí)間的縮短，農(nóng)桿菌長(zhǎng)勢(shì)呈下降趨勢(shì)。

3.2.3 激素濃度對(duì)出愈的影響 將浸染過的煙草葉片共培養(yǎng)后轉(zhuǎn)入激素濃度為：6-BA 2.0mg/L、IAA 0.5 mg/L 的選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)，結(jié)果葉片均未出現(xiàn)愈傷組織。將激素濃度調(diào)整為：6-BA 1.5mg/L、IAA 0.5mg/L后部分葉片產(chǎn)生愈傷組織。

4 討論

在農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物遺傳轉(zhuǎn)化過程中，由于受體組織是直接浸染在農(nóng)桿菌懸浮液之中，因此，菌液濃度以與遺傳轉(zhuǎn)化效率有著最為直接的關(guān)系。當(dāng)菌液濃度過低時(shí)，會(huì)由于單位體積農(nóng)桿菌細(xì)胞數(shù)過少而達(dá)不到浸染效果，以至于遺傳轉(zhuǎn)化效率較低；過高則會(huì)由于農(nóng)桿菌細(xì)胞的過度生長(zhǎng)而影響受體細(xì)胞的正常生長(zhǎng)及分化，也達(dá)不到較高的遺傳轉(zhuǎn)化效率。與菌液濃度最為密切的是浸染時(shí)間，因此，需要將2個(gè)因素綜合考慮，當(dāng)菌液濃度過大時(shí)，可以適當(dāng)減少受體組織浸染的時(shí)間；當(dāng)菌液濃度過小時(shí)，可以適當(dāng)延長(zhǎng)浸染時(shí)間。

本研究中，將含有重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌過夜培養(yǎng)后按1∶100接種于新鮮的LB培養(yǎng)液中培養(yǎng)6h至OD600≈0.6時(shí)取菌液經(jīng)梯度稀釋后分別對(duì)大小約0.5cm2的煙草葉片進(jìn)行不同時(shí)間浸染。結(jié)果用經(jīng)20倍稀釋后的菌液浸染的煙草葉片其轉(zhuǎn)化率達(dá)97%以上，且不同時(shí)間浸染的處理間無顯著差異。農(nóng)桿菌懸浮液濃度及浸染時(shí)間是影響遺傳轉(zhuǎn)化最重要的2個(gè)因素，但相比之下菌懸浮液濃度對(duì)轉(zhuǎn)化的影響更為明顯。

將含重組質(zhì)粒的菌體振蕩培養(yǎng)過夜，取菌液2mL離心后用轉(zhuǎn)化液重懸菌體，并進(jìn)行20～40倍的稀釋，黑暗處22℃共培養(yǎng)3d，葉片常會(huì)被農(nóng)桿菌包埋，而導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗。分析原因：其一，可能是菌液濃度過大，導(dǎo)致經(jīng)其浸染的葉片上菌濃度過高，從而快速生長(zhǎng)將組織葉片包埋；其二，可能是共培養(yǎng)的時(shí)間過長(zhǎng)，應(yīng)適當(dāng)縮短共培養(yǎng)的時(shí)間，當(dāng)共培養(yǎng)至肉眼可見的微小菌落出現(xiàn)時(shí)，立即轉(zhuǎn)入選擇培養(yǎng)基中；其三，在選擇培養(yǎng)的過程中，可能是抗生素的濃度較小，而無法將農(nóng)桿菌抑制，可將抗生素的濃度加大或是采用另一種更有效的廣譜抗生素。

雖然有文獻(xiàn)稱煙草轉(zhuǎn)化再生系統(tǒng)中激素濃度以6-BA 2.0mg/L+IAA 0.5mg/L時(shí)再生率最高[15]。但本研究中煙草轉(zhuǎn)化后按其再生條件進(jìn)行再生，再生率為0%，然將激素濃度調(diào)整為6-BA 1.5mg/L+IAA 0.5mg/L時(shí)再生情況良好。出現(xiàn)以上情況可能是因?yàn)榧尤肟股睾笫乖偕鷹l件發(fā)生變化進(jìn)而影響了煙草的再生。

參考文獻(xiàn)

[1]白雪帆，黃長(zhǎng)形.進(jìn)一步加強(qiáng)腎綜合征出血熱的研究[J].中華傳染病雜志，2002，820（4）：197-198.

[2]孟顥光，張朝紅，王躍進(jìn).抗病基因VpPR10轉(zhuǎn)化‘碭山酥梨及轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化[J].園藝學(xué)報(bào)，2010，37（10）：1567-1574.

[3]李明浩，陳煒，邢莉萍，等.農(nóng)桿菌介導(dǎo)小麥遺傳轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化[J].分子植物育種.2010，8（2）：388-392.

[4]胡繁榮.根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的金邊狗牙根遺傳轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化[J].植物資源與環(huán)境學(xué)報(bào)，2005，14（2）：15-18.

[5]王娟.農(nóng)桿菌介導(dǎo)草地早熟禾轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38（1）：58-59，62.

[6]張嬌，谷守芹，李青為，等.根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的玉米大斑病菌轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化[J].河北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào).2010，33（4）：85-88.

[7]Kenjirou Ozawa.Establishment of a high efficiency Agrobacterium-mediated Transformation system of rice（Oryza sativa L.）[J].Plant Science，176 （2009）：522-527.

[8]武小霞，李靜，王志坤，等.乙酰丁香酮濃度和共培養(yǎng)pH對(duì)大豆再生頻率的影響[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào).2010，41（5）：1-4.

[9]羅齊軍，朱昌叁，曾富華.農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化辣椒條件的優(yōu)化[J].江西農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2008，20（5）：14-16.

[10]王關(guān)林，方宏筠.植物基因工程原理與技術(shù)（第二版）[M].北京：科學(xué)出版社，2002.

[11]MchughenA，JordanM，F(xiàn)eistG.Aprecultureperiodpriorto Agrobacteriuminoculationincreaseproductionoftransgenicplants[J]. J. PlantPhysio.l，1989，135：245～248.

[12]王欣，周忠，李強(qiáng)，等.甘薯SAAT法遺傳轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化[J].江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2006，22（1）：14-18.

[13]趙東利，陳紅波，聶秀苑，等.超聲波輔助處理對(duì)發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)的苦豆子遺傳轉(zhuǎn)化的影響[J].西北植物學(xué)報(bào)，2003，23（3）：468-472.

[14]羅雯，劉陽.根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化條件優(yōu)化的研究[J].生物技術(shù)，2006，16（1）：41-42.

[15]王荔，楊艷瓊，楊德，等.不同激素濃度及培養(yǎng)基對(duì)煙草愈傷組織分化的影響[J].云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1999，14（4）：371-375.

（責(zé)編：張宏民）