何美升，于茜，高程程，曹行，馬海玉，劉玲玲，姜鑫，劉武軍

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，烏魯木齊 830052)

伊犁馬DMRT3基因多態(tài)性研究

何美升，于茜，高程程，曹行，馬海玉，劉玲玲，姜鑫，劉武軍

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，烏魯木齊 830052)

【目的】以103匹伊犁馬(速步型)為研究對(duì)象，研究伊犁馬DMRT3基因多態(tài)性與步法性狀之間的相關(guān)性?！痉椒ā窟\(yùn)用PCR-RFLP方法對(duì)伊犁馬DMRT3基因進(jìn)行多態(tài)性分析?！窘Y(jié)果】該基因在伊犁馬上存在3種基因型，分別為CC、CA和AA，測(cè)序結(jié)果顯示：DMRT3的堿基突變位置為g.22999655C>A，該突變導(dǎo)致氨基酸編碼提前終止，經(jīng)關(guān)聯(lián)分析，該突變對(duì)伊犁馬速度有顯著影響(P<0.05)。【結(jié)論】伊犁馬DMRT3基因突變與速度之間存在關(guān)聯(lián)性，且可能是伊犁馬步法性狀的重要位點(diǎn)。

伊犁馬；DMRT3基因；步法性狀；速步性能

0 引 言

【研究意義】馬匹的運(yùn)動(dòng)能力直接決定著馬匹的競(jìng)技水平和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，近些年來(lái)，優(yōu)質(zhì)運(yùn)動(dòng)馬的選育成為研究熱點(diǎn)。新疆的馬品種豐富，其中伊犁馬聞名中外，伊犁馬主要分布于伊犁河谷地區(qū)，是知名的優(yōu)良馬種，不僅是肉乳兼用，更具有良好的運(yùn)動(dòng)性能。【前人研究進(jìn)展】在速步賽事中，不同的步法性狀對(duì)運(yùn)動(dòng)能力和比賽成績(jī)有著至關(guān)重要的影響[1]。DMRT基因在控制性別發(fā)展、調(diào)節(jié)性別分化和雄性不育方面有重要作用[2,3,4]。L S. Anderson等[5]發(fā)現(xiàn)DMRT3基因是控制冰島馬的步法的主效基因，DMRT3基因突變?cè)鰪?qiáng)了馬匹肢體同側(cè)的運(yùn)動(dòng)能力[6]。K. Jaderkvist等[7,8]研究表明DMRT3基因突變與標(biāo)準(zhǔn)種、法國(guó)速步以及北歐速步馬的速步性能有很大的關(guān)系，也對(duì)冰島馬的騎乘性能產(chǎn)生一定的影響。隨后，K. Jaderkvist等[9]又對(duì)180匹芬蘭馬(速步型)，59匹(騎乘型)進(jìn)行了DMRT3基因的分型。不同的基因型對(duì)芬蘭馬的競(jìng)技能力和經(jīng)濟(jì)價(jià)值有重要的影響?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】DMRT3基因突變是馬匹的運(yùn)動(dòng)模式改變的遺傳因素之一，不同基因型對(duì)速步型馬匹的步法類(lèi)型、運(yùn)步能力等有著重要影響。目前有關(guān)伊犁馬DMRT3基因多態(tài)性的研究還未見(jiàn)報(bào)道。研究以伊犁馬(速步型)為研究對(duì)象，研究伊犁馬DMRT3基因多態(tài)性與步法性狀之間的關(guān)系。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】運(yùn)用PCR-RFLP方法，檢測(cè)分析DMRT3基因的多態(tài)性，對(duì)該基因的多態(tài)性與伊犁馬步法性狀進(jìn)行相關(guān)分析，為選育優(yōu)良運(yùn)動(dòng)性能的伊犁馬提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

在伊犁哈薩克自治州昭蘇軍馬場(chǎng)，選取103匹伊犁馬，頸靜脈采血5 mL，枸櫞酸鈉抗凝，-20℃保存。

1.2 方 法

1.2.1 血液基因組DNA的提取與檢測(cè)

試驗(yàn)操作參照《分子克隆指南》[10](第3版)，用酚-氯仿抽提法提取DNA。

1.2.2 引物設(shè)計(jì)

試驗(yàn)參照Han等[11]設(shè)計(jì)的DMRT3基因引物序列，列出引物信息。表1

表1 引物信息

Table 1 Primer information

基因Gene引物序列(5’→3’)Primersequence長(zhǎng)度(bp)Size退火溫度(℃)AnnealingtemperatureDMRT3F：CGACAAAGACACCGACCAGAR：CCGATCCCACGGACCATT485551

1.2.3 PCR擴(kuò)增

反應(yīng)體系20 μL：DNA模板1.0 μL，PCR Mixture 10 μL，F(xiàn)引物0.5 μL、R引物0.5 μL，加ddH2O至20 μL。反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 min，退火30 s，72℃延伸10 min，4℃保存。

1.2.4 PCR-RFLP分析

酶切反應(yīng)體系為10 μL：PCR產(chǎn)物5 μL，10×PCR Buffer 1 μL，限制性內(nèi)切酶DdeI 0.3 μL，ddH2O 3.7 μL。恒溫箱37℃酶切過(guò)夜。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

利用Excel整理表型數(shù)據(jù)；利用生物信息軟件計(jì)算基因頻率、基因型頻率、基因純合度(homozygosity,Ho)、基因雜合度(heterozygosity,He)、有效等位基因數(shù)(effective number of alleles,Ne)和多態(tài)信息含量(polymorphism information content,PIC)。利用SPSS18.0軟件進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA提取結(jié)果

伊犁馬基因組DNA提取后，DNA檢測(cè)條帶清晰明亮，可用于后續(xù)試驗(yàn)。圖1

圖1 基因組DNA檢測(cè)

Fig.1 Electrophoresis detection of genomic DNA

2.2DMRT3基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)

將DMRT3基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，產(chǎn)物檢測(cè)表的PCR產(chǎn)物檢測(cè)條帶清晰明亮，產(chǎn)物大小與預(yù)期一致，可用于后續(xù)試驗(yàn)。圖2

1～7,DMRT3PCR擴(kuò)增產(chǎn)物;M,DL600DNA Maker

1-7,PCR products ofDMRT3;M,DL600DNA Maker

圖2DMRT3的PCR檢測(cè)結(jié)果

Fig.2 PCR detection result ofDMRT3

2.3DMRT3基因的多態(tài)性檢測(cè)

2.3.1 DMRT3基因的PCR-RFLP檢測(cè)結(jié)果

用限制性內(nèi)切酶DdeI將PCR產(chǎn)物酶切后，顯示DMRT3基因具有多態(tài)性，有3種基因型：CC、CA和AA。圖3

圖3DMRT3基因PCR-RFLP檢測(cè)結(jié)果

Fig.3 PCR-RFLP detection result ofDMRT3 gene

2.3.2DMRT3基因的測(cè)序結(jié)果

將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。研究表明，DMRT3基因的堿基突變位置為g.22999655C>A，該突變?yōu)闊o(wú)義突變，導(dǎo)致了氨基酸編碼提前終止。圖4

圖4DMRT3基因測(cè)序結(jié)果

Fig.4 Sequencing result ofDMRT3 gene

2.4 伊犁馬DMRT3基因的群體遺傳結(jié)構(gòu)

研究表明，伊犁馬群體中，DMRT3優(yōu)勢(shì)基因型為CA基因型，快步型中，優(yōu)勢(shì)等位基因?yàn)镃；在對(duì)側(cè)步型中，優(yōu)勢(shì)等位基因?yàn)锳。表2

表2DMRT3基因的基因型分布

Table 2 Genotye distribution ofDMRT3 gene

步法類(lèi)型Gaittype樣本(匹)Sample基因型頻率Genotypefrequency等位基因頻率AllelefrequencyCCCAAACA快步970289(28)0649(63)0061(6)06130387對(duì)側(cè)步600833(5)0167(1)04170583

2.5 純合度(Ho)、雜合度(He)、有效等位基因數(shù)(Ne)和多態(tài)信息含量(PIC)

研究表明，伊犁馬群體快步型和對(duì)側(cè)步型的Ho、He、Ne分別為0.351、0.649、1.902和0.514、0.486、1.946；PIC分別是 0.362和0.368，為中度多態(tài)位點(diǎn)。表3

表3 伊犁馬DMRT3基因的Ho,He,Ne和PIC

Table 3Ho,He,Neand PIC ofDMRT3 gene loci of Yili Horses

步法類(lèi)型Gaittype樣本Sample基因純合度Ho基因雜合度He有效等位基因數(shù)Ne多態(tài)信息含量PIC快步970351064919020362對(duì)側(cè)步60514048619460368

2.6 伊犁馬2種步法速度的差異

研究表明，在伊犁馬群體中，1 000 m速步賽事2種步法速度比較發(fā)現(xiàn)，對(duì)側(cè)步型個(gè)體速度顯著快于快步型(P<0.05)。表4

表4 伊犁馬2種步法類(lèi)型速度差異

Table 4 The difference between 2 gait types and speed of Yili Horses

步態(tài)速度(m/s)對(duì)側(cè)步778±059a快步706±070b

注：同列，肩標(biāo)字母不同時(shí)，差異顯著(P<0.05)

Note: In the same row, values with different letter superscripts mean significant difference(P<0.05)

2.7DMRT3基因不同基因型與速度的關(guān)聯(lián)分析

研究表明，伊犁馬1 000 m速步賽中，CA和AA基因型個(gè)體的速度顯著高于CC基因型個(gè)體(P<0.05)，CA與AA基因型之間差異不顯著(P>0.05)。表5

表5 DMRT3基因不同基因型與速度的關(guān)系

Table 5 The relationship betweenDMRT3 genotypes and speed

DMRT3基因DMRT3gene基因型GenotyesCCCAAA速度(m/s)687±044b759±081a764±041a

注：同行，肩標(biāo)字母不同時(shí)，差異顯著(P<0.05);肩標(biāo)字母相同時(shí)，差異不顯著(P>0.05)

Note: In the same row,values with different letter superscripts mean significant difference(P<0.05);While with the same superscripts mean no significant difference(P>0.05)

3 討 論

DMRT3基因主要與動(dòng)物生長(zhǎng)、性別控制有關(guān)[12,13]；同時(shí)該基因與馬匹運(yùn)動(dòng)能力有關(guān)。近年來(lái)，國(guó)外學(xué)者著力于DMRT3基因突變對(duì)于步法和競(jìng)技能力影響的研究，結(jié)果表明，DMRT3基因單堿基突變是馬匹運(yùn)動(dòng)模式改變的主要因素，該突變對(duì)馬的速步性能有很重要的影響[14]。

3.1 步法和速度的關(guān)系

對(duì)側(cè)步的主要特點(diǎn)是同側(cè)肢體同時(shí)運(yùn)動(dòng)，而快步是對(duì)角線前后肢體同時(shí)運(yùn)動(dòng)，這是兩種步法最本質(zhì)的區(qū)別。在短距離賽馬比賽的速步賽中，對(duì)側(cè)步比快步更有優(yōu)勢(shì)，具有對(duì)側(cè)步法的馬運(yùn)動(dòng)時(shí)，上下波動(dòng)小，步頻快，速度輕快。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在伊犁馬群體中，快步型居多，對(duì)側(cè)步型少；對(duì)兩種步型在測(cè)試賽中的數(shù)據(jù)結(jié)果比較顯示，對(duì)側(cè)步型的平均速度比快步型快(P<0.05)。說(shuō)明在伊犁馬群體的短途速步比賽中，對(duì)側(cè)步個(gè)體更有優(yōu)勢(shì)。

3.2 不同基因型與步法的關(guān)系

DMRT3基因AA純合突變對(duì)馬匹的步法產(chǎn)生了影響，增強(qiáng)了馬匹同側(cè)前后肢的運(yùn)動(dòng)能力，即增強(qiáng)了對(duì)側(cè)步能力和其他衍生步法能力，同時(shí)還增強(qiáng)運(yùn)動(dòng)時(shí)平衡感和肢體的協(xié)調(diào)能力[15]。試驗(yàn)利用PCR-RFLP方法對(duì)伊犁馬DMRT3基因多態(tài)性檢測(cè)發(fā)現(xiàn)存在g.22999655C>A的突變，在快步群體中，有3種基因型：CC、CA和AA， AA純合突變并未導(dǎo)致步法類(lèi)型的變化，有可能是AA型個(gè)體長(zhǎng)期處于快步群體中，需要特定的調(diào)教才能訓(xùn)練出對(duì)側(cè)步；也有可能是伊犁馬所處的地域環(huán)境和氣候、飼養(yǎng)管理水平及用于農(nóng)用運(yùn)輸從而導(dǎo)致某些性狀的變異與傳統(tǒng)的核內(nèi)遺傳學(xué)原理不符，可能與DNA的甲基化和其他表觀遺傳學(xué)有關(guān)。對(duì)側(cè)步型群體中，只有2種基因型，CA和AA，表明A等位基因可能更利于速步競(jìng)技。

3.3 不同基因型和速度的關(guān)系

前人研究表明，A等位基因會(huì)影響速度型賽馬的比賽成績(jī)，可能會(huì)減慢比賽速度。Guilherme L. Pereira等[16]在對(duì)296匹夸特馬的g.22999655C>A的研究發(fā)現(xiàn)，等位基因A頻率極低，并且對(duì)夸特馬的速度有影響，不利于速度競(jìng)技。在試驗(yàn)中，速步型群體中CA型頻率最高，CC型次之，AA型最少，其中，CA型和AA型群體平均速度比CC型快，差異達(dá)到顯著水平(P<0.05)，這與Guilherme L. Pereira等[16]的研究結(jié)果不同，可能與速度型賽馬和速步型賽馬群體之間存在群體間的遺傳差異有關(guān)，也可能是伊犁馬長(zhǎng)期處于農(nóng)用，短途速力不突出，導(dǎo)致某些性狀在群體間差異不大。

4 結(jié) 論

在伊犁馬速步型群體中，伊犁馬對(duì)側(cè)步型平均速度大于快步型(P<0.05)；伊犁馬DMRT3基因存在3種基因型，CC、CA和AA， AA純合突變沒(méi)有改變伊犁馬的步法類(lèi)型，但是，在速步賽測(cè)試中CA和AA型速度比CC型快(P<0.05)，A等位基因可能有利于伊犁馬速步賽的競(jìng)技能力，對(duì)伊犁馬的步法性狀具有重要影響。

References)

[1] 姚新奎,韓國(guó)才.馬生產(chǎn)管理學(xué)[M].北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社,2008.

YAO Xin-kui, HAN Guo-cai. (2008).MASHENGCHANGUANLIXUE[M]. China Agriculture Press. Beijing. (in Chinese)

[2] 肖調(diào)義,吳寶林,葛喜凱,等．中國(guó)大鯢Dmrt基因DM結(jié)構(gòu)域的克隆與序列分析[J]．水生生物學(xué)報(bào),2009,33(1):89-93．

XIAO Tiao-yi, WU Bao-lin, GE Xi-kai, et al. (2009). Cloning and sequencing DM domain of the Dmrt gene from the Chinese Giant Salamander and Riasdavidianus [J].ActaHydrobiologicaSinica, 33(1):89-93. (in Chinese)

[3] Ren, L., Cheng, H., Guo, Y., Huang, X., Li, L., & Zhou, R. (2001). Evolutionary conservation of dmrt gene family in amphibi-ans, reptiles and birds.ChineseScienceBulletin, 46(23):1,992-1,994.

[4] Ellegren, H. (2001). Hens, cocks and avian sex determination. a quest for genes on z or w.EmboReports, 2(3):192-196.

[5] Andersson, L. S., Larhammar, M., Memic, F., Wootz, H., Schwochow, D., & Rubin, C. J., et al. (2012). Mutations in dmrt3 affect locomotion in horses and spinal circuit function in mice.Nature, 488(7413):642-646.

[6] Promerova, M., Andersson, L.S, Juras, R., Penedo, MCT, et al. (2014). Worldwide frequency distribution of the "Gait keeper" mutation in the DMRT3 gene.AnimalGenetics, 45(2):274-282.

[7] Jaderkvist, K., Holm, N., Imsland, F., rnason, T., Andersson, L., & Andersson, L. S., et al. (2015). The importance of the dmrt3, 'gait keeper' mutation on riding traits and gaits in standardbred and icelandic horses.LivestockScience, 176:33-39.

[8] Kristjansson, T., Bjornsdottir, S., Sigurdsson, A., Andersson, L. S., Lindgren, G., & Helyar, S. J., et al. (2014). The effect of the 'gait keeper' mutation in the dmrt3, gene on gaiting ability in icelandic horses.JournalofAnimalBreeding&Genetics, 131(6):415-425.

[9] Jaderkvist, K., Johansson, L., Mykknen, A., Menp, M., Andersson, L. S., & Andersson, L., et al. (2015). 36 the dmrt3, "gait keeper" mutation affects harness racing performance and riding traits in finnhorses.JournalofEquineVeterinaryScience, 35(5):399.

[10] J.薩姆布魯克,D.W.拉塞爾.分子克隆實(shí)驗(yàn)指南[M]. 第3版. 北京：科學(xué)出版社,2002.

Sambrook. J. RUSSELL. D.W. (2002)MolecularCloningALABORATORYMANUAL[M]. 3rd Ed.Beijing: Beijing Science Press. (in Chinese)

[11] Han, H., Zeng, L., Dang, R., Lan, X., Chen, H., & Lei, C. (2015). The dmrt3 gene mutation in chinese horse breeds.AnimalGenetics, 46(3):341-342.

[12] 董曉麗,陳松林,季相山,等.半滑舌鰨Dmrt3基因cDNA片段的克隆與表達(dá)分析[J].中國(guó)水產(chǎn)雜志，2010,34(6):829-834.

DONG Xiao-li, CHEN Song-lin, JI Xiang-shan, et al. (2010). Molecular cloning and expression analysis of Dmrt3 gene in half-smooth tongue sole (Cynoglossussemilaevis) [J].JournalofFisheriesofChina, 34(6):829-834. (in Chinese)

[13] 宋 穎,邴旭文,曹哲明,等.黃鱔Dmrt3基因在性腺中的甲基化差異[J]. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào),2014,30(35):126-131.

SONG Yin, BING Xu-wen, CAO Zhe-ming, et al. (2014). Dmrt3Methylation Differences of Sex Gland in Monopterus albus Gene [J].ChineseAgriculturalScienceBulletin, 30(35):126-131.(in Chinese)

[14] Jaderkvist, K., Kangas, N., Andersson, L. S., & Lindgren, G. (2014). Gaitedness is associated with the dmrt3 'gait keeper' mutation in morgan and american curly horses.AnimalGenetics, 45(6):908-909.

[15] Jaderkvist, K., Andersson, L. S., Johansson, A. M., rnason T, Mikko, S., & Eriksson, S., et al. (2014). The dmrt3 'gait keeper' mutation affects performance of nordic and standardbred trotters.JournalofAnimalScience, 92(10):4,279-4,286.

[16] Pereira, G. L., Matteis, R. D., Regitano, L. C. A., Chardulo, L. A. L., & Curi, R. A. (2015). Mstn, ckm and dmrt3 gene variants in different lines of quarter horses.JournalofEquineVeterinaryScience, (39):33-37.

Fund project:National science and technology support project (2012BAD44B01)

Polymorphism Analysis ofDMRT3 Gene in Yili Horse

HE Mei-sheng, YU Xi, GAO Cheng-cheng , CAO Hang, MA Hai-yu, LIU Ling-ling, JIANG Xin, LIU Wu-jun

(CollegeofAnimalScience,XinjiangAgriculturalUniversity,Urumqi830052,China)

【Objective】 In this study, the project aims to analyze the association ofDMRT3 gene polymorphism with gait trait in trotting type of 103 individuals Yili horse.【Method】Genetic polymorphism ofDMRT3 gene was detected by PCR-RFLP and DNA sequencing technology.【Result】The result showed that there was 1 mutation inDMRT3 gene and there were 3 genotypes: CC, CA and AA. The SNPg.22999655 C>A was identified inDMRT3 gene by sequencing, and it caused the premature stop of the encoded acid. Statistical results indicated that the SNP was significantly associated with speed in Yili horse (P<0.05).【Conclusion】The mutation might be acted as an crucial DNA genetic marker for trotting performance traits selection in Yili horse.

Yili horse;DMRT3 gene; gait trait; trotting performance

2016-04-23

國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目課題(2012BAD44B01)

何美升(1990-)，男，四川人，碩士研究生，研究方向?yàn)閯?dòng)物遺傳育種與繁殖，(E-mail)317924834@qq.com

劉武軍(1966-)，女，新疆人，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)閯?dòng)物遺傳育種與繁殖，(E-mail)lwj_ws@163.com

10.6048/j.issn.1001-4330.2017.01.024

S821.2

A

1001-4330(2017)01-0184-06