任文宇

（杭州博日科技有限公司，浙江杭州，310052）

數(shù)字PCR平臺與單細胞單分子檢測

任文宇

（杭州博日科技有限公司，浙江杭州，310052）

數(shù)字PCR作為第三代PCR技術，主要是在擴增單分子的基礎上對核酸拷貝數(shù)進行絕對性定量的樣品檢測技術，具有非常高的靈敏度。近年來，隨著科學技術的進步和醫(yī)療衛(wèi)生技術水平的改善提高，微流控技術作為一種先進的技術，促使著數(shù)字PCR平臺的產(chǎn)生。但是現(xiàn)有的數(shù)字PCR平臺類型主要是芯片型和液滴型，不僅操作費用昂貴，且需要進行外接的相關配套控制系統(tǒng)以及管路眾多，這便在很大程度上嚴重制約了我國生命科學領域中對于數(shù)字PCR技術的廣泛應用。

數(shù)字PCR平臺；單細胞；單分子；檢測

1 數(shù)字PCR技術在單細胞單分子檢測中的注意事項

1.1 對關鍵因素進行充分的考慮

現(xiàn)階段，應用于擴增數(shù)字核段裝置芯片的類型主要有滑動式、離心轉(zhuǎn)盤式、液滴微流控式和大規(guī)模集成流路式。但是，在實際操作過程中這些裝置效能的發(fā)揮需要借助外部氣壓源和注射泵等控制系統(tǒng)的力量，唯有這樣才可以對眾多樣品進行注入和分配操作等。尤其是在注入樣品過程中，如果使用一定的注射器來完成該項操作則往往花費的時間非常多，并且極易影響敏感樣品的降解，使得丟失樣品的現(xiàn)象層出不窮，檢測的準確性和靈敏性在一定程度上有所降低，相應的在現(xiàn)場完成對樣品的即時檢測非常困難。因此，為確保在擴增數(shù)字核酸過程中集成全部的功能，則需要分配隔離單分子，需要充分考慮以下三個關鍵因素：其一，在芯片內(nèi)部集成一個足以將液體流動驅(qū)動的內(nèi)置動力源；其二，有效的將每一個反應室，保證彼此之間的獨立性；其三 ，PCR技術能夠?qū)崿F(xiàn)對單分子的有效擴增。

1.2 數(shù)字PCR反應需要對熱循環(huán)的溫度進行準確且有效的控制

據(jù)不完全報道，數(shù)字PCR滾環(huán)反應所需要的溫度大約在30攝氏度左右，假陽性的擴增極易產(chǎn)生，數(shù)字重組聚合酶的擴增反應對于溫度更為敏感，LAMP技術的核酸鏈在等溫環(huán)境中進行一定的循環(huán)置換，有助于放大靶序列的擴增，其本身的特異性非常高、所耗的時間較短、檢測起來比較方面，且等溫效果非常高效，無需借助PCR儀器便可以完成循環(huán)置換操作。

2 數(shù)字LAMP芯片技術的重要性

LAMP技術可以不借助熱循環(huán)作用，便可以在60攝氏度左右的條件下進行等溫擴增，并且可以有效降低對環(huán)境的依賴程度，檢測所達到的極限非常低，具有很高的擴增效率，與傳統(tǒng)PCR技術相比其靈敏度要高2到3個數(shù)量，與其他形式的等溫反應相比較，LAMP在數(shù)字LAMP反應中具有很大額度優(yōu)勢，在此基礎上已經(jīng)在診斷臨床疾病、定性定量對細菌和病毒的檢測過程中以及防治動植物的微生物檢測等發(fā)揮著至關重要的作用。

本次所研制的數(shù)字LAMP芯片具備一定的自主知識產(chǎn)權，主要將樣品引入到無動力的進樣技術中，樣品在各小室中的自動分配主要借助的是封隔油箱的方法，這在一定程度上有助于進行數(shù)字LAMP反應，且有助于精確的克隆基因質(zhì)粒進行有效的定量和計數(shù)。同時，該芯片的組成部分主要包括聚合物PDMS與玻璃基底，不需要動力源和微閥的支持，便可以在一定程度上降低或者消除對儀器的依賴程度，以此有助于保持數(shù)字核酸擴增芯片本身的獨立性。

3 自吸分液式數(shù)字LAMP芯片的制作

本文在芯片制作過程中主要是在玻璃蓋片基礎上采用多層刻技術，材料主要以樣品通道流通和高聚物PDMS的微反應室，在封接芯片組件的間隔上主要采用的技術以離子體表面處理技術為主，如低溫空氣等，以此來數(shù)字LAMP芯片制作出來，其集成流路的結構為三層。同時，制作方法相對比較簡單，自動化水平相對較高，價格低廉，能夠?qū)⒓闪髀沸酒淮涡灾谱魍瓿?，在很大程度上可以有效避免或者防止二次污染?/p>

芯片的尺寸大小與蓋玻片差不多，小室的結構總共劃分為5層，其中最中間的為微陣列層，四個區(qū)域中包含眾多的小室且在流通通道上設計主要是堆疊的方式，樣品流通通道在其中彼此相連，每個通道具備相同的進樣速率。陣列層主要是一層完全空白的PDMS上面粘附著，致使每個小室四周的性質(zhì)完全相同，在此基礎上液相與油相的進入都非常方便。

另外，進出的樣口層位于陣列層的上方，出樣口的直徑大約控制在2mm左右，其在廢液池和吸力的儲存方面發(fā)揮著非常重要的作用，在此基礎上可以為連續(xù)吸入樣品和油品提供源源不斷的動力支持。蓋玻片的下層固定著芯片的最下層，這便在很大程度上可以起到更好的固定支撐和熱傳導的作用。在實際使用芯片的過程中，通常會將一塊蓋玻片封蓋在最上層，以此可以起到非常良好的密封作用。

4 結束語

綜上所述，本文主要從對關鍵因素進行充分的考慮和數(shù)字PCR反應需要對熱循環(huán)的溫度進行準確且有效的控制等兩方面對數(shù)字PCR技術在單細胞單分子檢測中的注意事項進行了簡答的介紹，在闡述數(shù)字LAMP芯片技術重要性的基礎上，科學的分析和介紹了制作自吸分液式數(shù)字LAMP芯片的具體流程。

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Digital PCR Platform and Single Cell Single Molecule Detection

Ren Wenyu
（Hangzhou Bioer Technology Co. Ltd.,Hangzhou Zhejiang,310052）

Digital PCR as the third generation of PCR technology, mainly in the amplification of single molecules on the basis of nucleic acid copy number absolute quantitative sample detection technology, with very high sensitivity. In recent years, with the advancement of science and technology and improvement of medical and health technology, microfluidic technology as an advanced technology, promote the generation of digital PCR platform. However, the existing digital PCR platform types are mainly chip type and droplet type, not only expensive to operate, and the need for external control system and the associated pipeline, which in large part severely restricted the field of life sciences For the wide application of digital PCR technology.

digital PCR platform; single cell; single molecule; detection