王 淵，楊曉航，牛文民，朱先偉，王 強，劉思洋，王衛(wèi)剛,劉智斌*(.陜西中醫(yī)藥大學，陜西 咸陽 7046；.西安醫(yī)學院，陜西 西安 700；.陜西中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，陜西 咸陽 7000)

電針迎香穴對嗅覺功能障礙大鼠胰島素樣生長因子-1的影響

王 淵1，楊曉航1，牛文民1，朱先偉1，王 強1，劉思洋2，王衛(wèi)剛3,劉智斌1*
(1.陜西中醫(yī)藥大學，陜西 咸陽 712046；2.西安醫(yī)學院，陜西 西安 710021；3.陜西中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，陜西 咸陽 712000)

目的 探討電針迎香穴對嗅覺功能障礙大鼠胰島素樣生長因子-1（insulin-like growth factor 1,IGF-1）的影響。方法 將50只SD大鼠隨機分為5組，分別是正常組、嗅覺功能障礙組、嗅覺功能障礙+眶下神經(jīng)切斷組、嗅覺功能障礙+電針組、嗅覺功能障礙+眶下神經(jīng)切斷+電針組，電針干預迎香穴后，運用嗅覺迷宮實驗和對大鼠嗅球組織及血液中IGF-1進行ELISA、免疫組織化學等方法進行分析研究。結果 嗅覺功能障礙+電針組大鼠與正常組相比，其嗅覺功能明顯改善（P＜0.01），其嗅球組織及血液中IGF-1表達明顯升高（P＜0.05）,而嗅覺功能障礙+眶下神經(jīng)切斷+電針組大鼠與正常組相比，其嗅覺功能和嗅球組織及血液中IGF-1表達無明顯改善（P＞0.05）。結論 電針迎香穴對嗅覺功能障礙模型大鼠具有顯著干預效應,其作用機制可能是通過三叉神經(jīng)通路，促進大鼠體內IGF-1的產生，從而有利于嗅覺系統(tǒng)嗅感神經(jīng)元（ORN）再生，改善嗅覺功能障礙。

嗅覺功能障礙；胰島素樣生長因子-1；迎香穴

嗅覺在人類的各種生理、心理活動中發(fā)揮著重要作用。本研究針對嗅覺功能障礙所選穴位迎香，《玉龍歌》中所載：“不聞香臭從何治？迎香穴二穴可堪攻，先補后瀉分明效，一針未出氣先通”，其中歌賦中所載的“不聞香臭”即指現(xiàn)代醫(yī)學范疇的嗅覺功能障礙，包括嗅覺減退和嗅覺喪失，流行病學調查結果顯示，人群中嗅覺功能障礙實際總發(fā)生率20歲以上占19.1%，50歲以上高達24.5%，而在這些患病人群中，末梢神經(jīng)性嗅覺功能障礙患者占全體嗅覺功能障礙患者的30%以上[1-2]。因此，電針迎香穴被廣泛應用于治療末梢神經(jīng)性嗅覺功能障礙[3-5]。嗅覺受體神經(jīng)細胞作為唯一具備持續(xù)再生能力的神經(jīng)元，其中含有各種氣味結合蛋白，通過一系列機制參與嗅覺的整個形成過程,胰島素樣生長因子-1 (IGF-1)是調節(jié)嗅覺受體神經(jīng)再生的主要分子。本項目在前期研究基礎上，對于末梢神經(jīng)性嗅覺功能障礙動物模型，本研究團隊采用Triton X-100灌注大鼠雙側鼻孔進行復制，采用電針迎香穴干預嗅覺功能障礙模型和切斷眶下神經(jīng)嗅覺功能障礙模型，通過嗅覺迷宮觀察大鼠行為學、ELISA法觀察大鼠嗅球組織及血液中IGF-1的表達、免疫組化法觀察鼠嗅球組織IGF-1的表達等方法，分析電針迎香穴干預嗅覺功能障礙的效應機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

健康清潔級雄性SD大鼠50只，體質量（250± 20）g，由西安交大實驗動物中心提供，動物合格證號：SCXK（陜）2016.038)。隨機分為正常組、嗅覺功能障礙組、嗅覺功能障礙+眶下神經(jīng)切斷組、嗅覺功能障礙+電針組、嗅覺功能障礙+眶下神經(jīng)切斷+電針組，每組10只。

1.2 主要儀器及試劑

Morris水迷宮實驗系統(tǒng) （北京現(xiàn)代太極電子有限公司），Multiskan MK3全自動酶標儀 （美國Bio-Rad公司），Rat Insulin-like Growth Factor 1 IGF-1(IGF-1)ELISA KIT（Thermo Fisher Scientific），SDZ-II型電子針療儀（蘇州醫(yī)療用品廠有限公司出品）。

1.3 模型制備

1.3.1 嗅覺功能障礙模型制備 麻醉劑采用0.3%戊巴比妥鈉，將大鼠麻醉后，選用由 PBS配制的0.7%Triton X-100，并將其吸注于微量注射器中，再將磨鈍的針頭探入大鼠的雙側鼻孔，一次性灌注量為100 μL,時間1 min[6]。

1.3.2 眶下神經(jīng)切斷模型制備 首先對大鼠雙側眶下皮膚區(qū)域進行常規(guī)消毒，然后沿兩側眶下緣做一長約0.5 cm的水平切口，接著對視野內的皮下脂肪進行鈍性分離直至將眶下孔充分暴露出來，再將眶下神經(jīng)及其同名動靜脈進行仔細分離，最后在避開血管的情形下，對眶下神經(jīng)施行切斷術[7]。

1.4 實驗方法

穴位選擇：迎香穴（雙側）。穴位定位：大鼠鼻孔外側上端，有毛與無毛交界處[8]。操作方法：常規(guī)消毒穴位，選擇30號、0.5寸“華佗牌”不銹鋼毫針，迎香向內上方斜刺0.3 cm；電針儀正極和負極各接一側迎香穴，以穴區(qū)保持輕微抖動為適宜刺激強度，每次電針刺激10 min，每日1次，1個干預療程為5次，休息2 d，再進行下一個干預療程，共觀察2個療程。對于正常組和嗅覺功能障礙模型組大鼠，每日于同一時間段進行捉拿固定，不施加任何干預措施。

1.5 觀察指標

1.5.1 嗅覺迷宮實驗 將圓形迷宮等分為6個小格，將新鮮鼠料(0.5 g)隨機置于大鼠僅靠嗅覺才能找到而不能直接看見的小格后面。將大鼠放置于迷宮中間，對于大鼠從進入迷宮開始到用前爪抓住食物小球啃噬的時間進行記錄，待大鼠進食結束后將其放回籠中，將大鼠的排泄物和食物殘渣取出，為了防止對后面測試的干擾，用水和70%的乙醇對迷宮進行清潔；陽性對照是將食物小球放置在大鼠能夠直接看見小格外。對于300 s(5次測試的平均值)內未找到食物小球的大鼠，即定為嗅覺喪失[9]。

1.5.2 酶聯(lián)免疫吸附測定 在療程結束后取下大鼠頭顱，參照The Rat Brain大鼠圖譜，使用電鉆在大鼠頭顱前囟前3.2 mm的位置對后界開窗，使得左側嗅球充分暴露，刀片采用厚度為0.5 mm的規(guī)格，在視野清晰的條件下，將其由后界垂直插入，進一步將嗅球組織取出并切成碎片[10]，接下來依照每10 mg組織對應100 μL PBS的比例將組織進行勻漿，為了破壞細胞膜，采用超聲波對勻漿液進行進一步處理，最后將上清液吸出并且置于-80℃超低溫冰箱之中。對于嗅球組織中IGF-1的表達采用ELISA法進行檢驗分析。

1.5.3 免疫組織化學 將大鼠嗅球組織進行石蠟包埋并切片，采用梯度酒精和二甲苯對切片進行水化,使用pH值6.0的0.01 mol/L枸櫞酸鹽緩沖液對抗原進行修復，非特異性結合位點的封閉采用山羊血清工作液，在37℃ 30 min的條件下，滴加比例為1∶200的IGF-1R抗體并且在4℃條件下過夜，采用0.01 mol/L PBS對其進行漂洗，將生物素化山羊抗鼠/兔IgG二抗滴加于其中，在37℃ 30 min的條件下，對其進行PBS漂洗，將辣根過氧化酶標記鏈霉素卵蛋白試劑滴加于其中，在37℃ 30 min的條件下，對其進行PBS漂洗，并進行DAB顯色，采用蘇木素將其輕度復染，接下來采用酒精梯度對其脫水，最后進行中性樹膠封片。

1.6 統(tǒng)計方法

2 結果

2.1 嗅覺迷宮實驗結果

與正常對照組相比，嗅覺功能障礙組與嗅覺功能障礙+眶下神經(jīng)切斷組在嗅覺迷宮中所用時間均大于300 s，差異有顯著統(tǒng)計學意義（P＜0.01），說明這兩組大鼠嗅覺喪失；與嗅覺功能障礙組相比，嗅覺功能障礙+電針組大鼠在嗅覺迷宮實驗中所用的時間明顯縮短，差異有顯著統(tǒng)計學意義（P＜0.01）而嗅覺功能障礙+眶下神經(jīng)切斷+電針組大鼠在嗅覺迷宮實驗中所用的時間大于300 s，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 嗅覺迷宮實驗結果 (±s，s)

表1 嗅覺迷宮實驗結果 (±s，s)

注:與正常對照組比較，##P＜0.01；與嗅覺功能障礙組比較，**P＜0.01。

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2.2 酶聯(lián)免疫吸附分析結果

與嗅覺功能障礙模型組比較,嗅覺功能障礙+電針組大鼠嗅球組織和血液中的IGF-1表達增加（P＜0.05），嗅覺功能障礙+眶下神經(jīng)切斷組大鼠嗅球組織和血液中的IGF-1表達無顯著變化，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2 各組大鼠嗅球組織及血液中IGF-1的表達 (n=10,±s，ng/mL)

表2 各組大鼠嗅球組織及血液中IGF-1的表達 (n=10,±s，ng/mL)

注:與正常對照組比較，#P＜0.05；與嗅覺功能障礙組比較，*P＜0.05。

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2.3 免疫組織化學分析結果

圖1，表3結果說明，與嗅覺功能障礙模型組比較,嗅覺功能障礙+電針組大鼠嗅球組織IGF-1的陽性表達明顯增加（P＜0.05），嗅覺功能障礙+眶下神經(jīng)切斷組大鼠嗅球組織中IGF-1的陽性表達無顯著變化，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

圖1 各組大鼠嗅球組織中IGF-1表達（免疫組化染色，IHC×400）

表3 各組大鼠嗅球中IGF-1的表達 (n=10,±s，ng/mL)

表3 各組大鼠嗅球中IGF-1的表達 (n=10,±s，ng/mL)

注:與正常對照組比較，#P＜0.05；與嗅覺功能障礙組比較，*P＜0.05。

3 討論

迎香穴的解剖學定位位于鼻翼外緣中點旁、當鼻唇溝中，此位置恰好是作為三叉神經(jīng)分支之一的上頜支的分布區(qū)域，而鼻睫神經(jīng)由三叉神經(jīng)分支之一的眼支分出，其分布于嗅上皮區(qū)域，并包含在鼻腔粘膜中，在解剖學分布模式上三叉神經(jīng)與嗅覺神經(jīng)具有重疊分布性，且嗅覺的產生有賴于三叉神經(jīng)系統(tǒng)和嗅覺神經(jīng)系統(tǒng)的協(xié)同作用，故我們推斷，通過電針刺激迎香穴可以對三叉神經(jīng)產生激活效應。

嗅覺迷宮實驗結果表明，采用Triton X-100灌注能夠成功復制大鼠嗅覺功能障礙模型，嗅覺功能障礙組和嗅覺功能障礙+眶下神經(jīng)切斷組大鼠行為學中均以嗅覺喪失為主要表現(xiàn)。電針迎香穴干預嗅覺功能障礙大鼠后嗅覺顯著改善，然而，電針迎香穴嗅覺障礙+眶下神經(jīng)切斷大鼠后嗅覺無顯著改善。研究表明，作為三叉神經(jīng)主要分支之一的眶下神經(jīng)，在其完整的情況下，電針迎香穴發(fā)揮了改善嗅覺的作用，而在其被切斷后，電針迎香穴沒有發(fā)揮相應效應，故推斷電針迎香穴之所以能夠發(fā)揮對嗅覺功能障礙的良性調節(jié)效應可能是基于三叉神經(jīng)的完整性之上的。

IGF-1由肝細胞、腎細胞、脾細胞等十幾種細胞自分泌和旁分泌而成，是生長激素產生生理作用過程中必須的一種活性蛋白多肽物質。IGF-1可以調節(jié)細胞DNA的合成，是人體內重要細胞有絲分裂的促進劑，對維持細胞分化有關蛋白質水平具有關鍵作用。有研究表明，嗅覺刺激可以增加IGF-1在體內的產生，因此，本研究選擇IGF-1作為整個實驗的觀測指標，而本實驗研究結果顯示，IGF-1濃度含量的變化與針刺的干預作用具有明顯相關性。研究發(fā)現(xiàn)，嗅覺功能障礙組大鼠嗅球或血液中的IGF-1表達減少，電針迎香穴干預嗅覺功能障礙大鼠后嗅球或血液中的IGF-1表達顯著增加，然而，電針迎香穴嗅覺障礙+眶下神經(jīng)切斷大鼠嗅球或血液中的IGF-1表達無顯著變化。提示經(jīng)電針迎香穴干預嗅覺障礙大鼠后能夠增加IGF-1的表達，且此干預效應的發(fā)揮是基于三叉神經(jīng)通路的完整性之上的。

嗅覺障礙或嗅覺傳導通路失常與很多疾病密切相關，其嚴重影響患者的生活質量。選用電針迎香穴時，三叉神經(jīng)被激活，一種類似嗅覺的信號向大腦進行傳遞，大腦在這樣的信號影響下，促進肝細胞、腎細胞等細胞旁細胞分泌和IGF-1，增加其產生，IGF-1的增加有利于嗅覺受體神經(jīng)的再生。因此，電針迎香穴可以改善大鼠嗅覺，促進嗅覺受體神經(jīng)的再生，促進大鼠體內IGF-1的產生，其機制可能是基于三叉神經(jīng)的完整性而發(fā)揮良性調節(jié)效應。

[1]劉巧平,劉建華.針刺內迎香治療嗅覺下降[J]北京中醫(yī)藥大學學報（中醫(yī)臨床版）,2011,18(2):21-22.

[2]張 偉,張 羅.嗅覺功能障礙的診斷與治療[J].首都醫(yī)科大學學報,2013,34(6):814-819.

[3]牛文民,劉智斌,楊曉航，等.嗅三針治療嗅覺功能障礙100例[J]陜西中醫(yī),2008,29(8):1054-1055.

[4]倪道鳳,劉劍峰,王 劍,等.國內嗅覺障礙研究[J].中國醫(yī)學文摘?耳鼻咽喉科學,2007,(4):212-213.

[5]郭 義.實驗針灸學[M].北京:中國中醫(yī)藥出版社,2008.

[6]秦照萍,葉樹明,杜繼曾，等.Triton損傷成年大鼠嗅上皮對嗅球鈣結合蛋白-D和小白蛋白表達的影響[J].中國藥理學與毒理學雜志,2005,19(3):226-228.

[7]王 強，劉智斌，牛文尼，等.電針迎香穴對嗅覺障礙大鼠嗅粘膜Ki-67、IGF-IR吸嗅球IGF-1-I表達的影響[J].陜西中醫(yī)，2016,37 (11):1547-1550.

[8]郭 義.實驗針灸學[M].北京：中國中醫(yī)藥出版社，2008.

[9]李小松,唐 玲,汪克建，等.小鼠嗅黏膜中水通道蛋白1對嗅覺形成的作用[J].第三軍醫(yī)大學學報,2010,32(23):2483-2487.

[10]JonasKO,MariaJ,Ingrid E,etal.Long-term episodic memory decline is associated with olfactory deficits only in carriers of ApoE-e4[J].Neuropsychologia.2016,85:1-9.

（本文編輯 匡靜之）

Effect of Yingxiang Acupoint on Insulin-like Growth Factors-1 in Olfactory Dysfunction Rats

WANG Yuan1,YANG Xiaohang1,NIU Wenmin1,ZHU Xianwei1,WANG Qiang1,LIU Siyang2,WANG Weigang3,LIU Zhibin1* (1.Shanxi University of Chinese Medicine,Xianyang,Shanxi 712046,China;2.Xi'an Medical College,Xi'an,Shanxi 710021,
China;3.The Affiliated Hospital of Shanxi University of Chinese Medicine,Xianyang,Shanxi 712000,China)

Objective To investigate the effect of Yingxiang acupoint on insulin-like growth factors-1 (IGF-1)in olfactory dysfunction rats.Methods The 50 SD rats were randomly assigned into five groups,normal control group,olfactory dysfunction group,olfactory dysfunction+infraorbital nerve transection group group,olfactory dysfunction+EA group,olfactory dysfunction+infraorbital nerve transection+EA group.After electro-acupuncture intervention at Yingxiang acupoint,the IGF-1 in olfactory bulb tissue and blood of rats was analyzed by using olfactory maze test,ELISA and immunohistochemistry methods.Results Compared with the normal group,the olfactory function of the olfactory dysfunction+EA group rats were significantly improved(P＜0.01),IGF-1 in the olfactory bulb tissue and blood increased significantly(P＜0.05).While the IGF-1 in olfactory dysfunction+infraorbital nerve cut+EA group had no significant improvement (P＞0.05).Conclusion Electroacupuncture Yingxiang acupoint has a significant intervention effect on olfactory dysfunction model rats and its mechanism may be through the trigeminal nerve pathway,promote the production of IGF-1 in rats.It is conducive to the olfactory mucosa olfactory sense(ORN)of neuronal regeneration and improve olfactory dysfunction.

olfactory dysfunction;insulin-like growth factors-1;Yingxiang acupoint

R245.3；R765

A

10.3969/j.issn.1674-070X.2017.03.018

2016-07-11

國家自然科學基金項目（81273859）；陜西省教育廳專項科學研究項目（11JK0679）。

王 淵，男，副教授，研究方向：針灸推拿治療脊柱疾病和老年病的基礎與臨床研究。

*劉智斌，男，二級教授，E-mail:lzb210396@163.com。

本文引用：王 淵，楊曉航，牛文民，朱先偉，王 強，劉思洋，王衛(wèi)剛,劉智斌.電針迎香穴對嗅覺功能障礙大鼠胰島素樣生長因子-1的影響[J].湖南中醫(yī)藥大學學報，2017，37（3）：298-301.